国产单硝酸异山梨醇酯注射剂抗实验性心肌缺血及对一氧化氮产生的影响
作者：彭芳 陈植和 王德成 李玲
单位：彭芳(云南省大理医学院药理教研室，大理 671000)；陈植和(昆明医学院省天然药物药理重点实验室，昆明 650031)；王德成(昆明医学院省天然药物药理重点实验室，昆明 650031)；李玲(昆明医学院省天然药物药理重点实验室，昆明 650031)
关键词：单硝酸异山梨醇酯；心肌缺血；一氧化氮
国产单硝酸异山梨醇酯注射剂 抗实验性心肌缺血及对一氧化氮产生的影响
摘 要：目的：研究国产单硝酸异山梨醇酯(5-ISMN)注射剂抗实验性心肌缺血及NO产生情况。方法：观察药物对三种实验性心肌梗死的保护作用及多种离体血管条的效应，测定体内外给药其NO产生情况(Griess法)。结果：5-ISMN能降低结扎大鼠LAD致心肌缺血的ΣST，NST ，心肌缺血区百分比和血清CPK，LDH(P<0.05，0.01)；可使ISP诱发大鼠心肌缺血的ΣST及LVEDP降低，对血流动力学其他指标影响不明显；还可拮抗脑垂体后叶素所致豚鼠冠脉流量下降(P<0.05，0.01)。本品对去甲肾上腺素(NE)引起兔多种离体血管条的收缩呈浓度依赖性抑制作用，扩张静脉强于动脉。5-ISMN体内外给药在无L-Cys的磷酸缓冲液不能产生外，其他均有一定量NO产生，且呈剂量及时间依赖性(P<0.05，0.01)。结论：国产5-ISMN注射剂具有一定抗心肌缺血效应及不能自发释放NO。
, http://www.100md.com
EFFECTS OF DOMESTIC ISOSORBIDE-5-MONONITRATE (5-ISMN) ON ANTIMYOCARDIAL ISCHEMIA AND NITRIC OXIDE RELEASE IN ANIMAL MODELS
Peng Fang,Chen Zhihe,Wang Decheng,et al.
(Department of Pharmacology,Dali Medical College of Yunnan Province,Dali 671000)
ABSTRACT：OBJECTIVE：To study the effects of 5-ISMN on anti-my ocardial ischemia and nitric oxide release in animal models.METHODS：3 animal models of myocardial ischemia and many isolated vascular strips were adop ted in the study and the release of nitric oxide in vitro and in vivo we re deter mined by Griess method. RESULTS：5-ISMN may reduce the myocardial ischemic ΣST and NST,the percentage of ischemic area,and serum levels of CPK and LDH(P<0.05，0.01)induced by LDA ligation in rats;and it may also reduce the my ocardial ischemic ΣST and LVEDP induced by ISP rats (P<0.05，0.01) but noobviou s effects on haemodynamic parameters.The drug may antagonize reduction in coronary blood volume(P<0.05，0.01)evoked by posterior pituitary in guinea pigs. The drug may inhibit the concentration-dependent relaxation induced by NE in isolate dstrips of rabbits and this inhibitive effect was more pronounce in veins than in arteries .The generation of NO occurred in all cases when 5-ISMN is administ rated,except in PBS or Krebs' solution without L-cysteine. CONCLUSION：Domestic 5-ISMN injection has been shown to have significant anti-myocardial ischemic effects but spontaneous release of NO do not occur.
, 百拇医药
KEY WORDS：Isosorbide-5-mononitrate;Myocardial ischemia;Nitric oxide▲
国产单硝酸异山梨醇酯(5-ISMN)片剂用于预防和治疗缺血性心脏病已在世界各国获得广泛应用，国外早在临床上使用多种剂型的5-ISMN，而国内较落后。现开发注射剂不仅满足临床用药需要，且疗效更为显著，但国内对国产5-ISMN注射剂的系统研究甚少。本实验就5-ISMN对多种实验性心肌缺血的保护作用及多种离体血管条的效应，测定体内外给药其一氧化氮(NO)产生情况等方面参数，以期对该药的开发和临床应用提供实验基础。
材料和方法
1 药品和试剂
5-ISMN注射剂(25mg/100ml)及其原料药、溶媒由四川乐山三民药物研究所提供，余所需试剂为国内市售产品。
, http://www.100md.com
2 方法
2.1 结扎大鼠冠状动脉所致心肌缺血 SD大鼠(250±14.8)g，雌雄兼用，乌拉坦1.0g/kg腹腔麻醉。按文献方法[1，2]结扎左冠状动脉前降支(LAD), 迅速关闭胸腔,恢复自主呼吸。将动物随机分为Ⅰ组(溶媒组), Ⅱ组(注射5-ISMN 3mg/kg)，Ⅲ组(注射 5-ISMN 6mg/kg), 各组均于结扎前5 m in静注,记录结扎前及结扎后5,10,15,30,60min的心电图ECG，于RM-6000型多道生理记录仪的Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ导联同步标记。以ST段抬高≥2mm或下降≥ 1mm为阳性点(按1 mv = 20 mm定标), 计算各时间点内出现阳性点的总数目(NST),并计算各时间ST段上下偏移总mv数(ΣST)。结扎后1h取血, 立即测定磷酸肌酸激酶(CPK)和乳酸脱氢酶(LDH)。经主动脉根部注入1.5 ml/kg稀释1倍的印度墨汁,迅速取下心脏, 冰冻30～40 min,将心室肌切成等厚度的5片, 分别称取墨水染色区及非染色区(缺血区)之重量, 计算心肌缺血区百分比。
, 百拇医药
2.2 异丙肾上腺素诱导大鼠心肌缺血 健康Wistar 大鼠(225±20.6)g,用 1 .0g/kg乌拉坦麻醉。按文献方法[3]行股、颈动脉插管,于RM-6000多道生理记录仪同步记录ECG、左室内压(LVP)、左室内压变化速率(Lvdp/dt)、左室舒张末压(L VEDP)、收缩压(SAP)、舒张压(DAP)。采用异丙肾上腺素(ISP)筛选合格的动物即ISP 10 μg/kg恒速iv达5 min, 如ST段压低>0.1mv即可使用(按1mv=10mm 定标)。待各指标稳定后, 将动物分成Ⅰ组(5mg/kg)和Ⅱ组(10mg/kg)，各组均先给等体积溶媒,约5 min后iv ISP 10μg/kg;随后恒速注射5-ISMN,5 min后各组再同上iv ISP,每次给ISP后对各项指标变化观察30min。
2.3 离体豚鼠心脏灌流(脑垂体后叶素致心肌缺血) 选用健康豚鼠(330±28.9)g, 雌雄不拘, 按 Langendoff法[1]制备离体豚鼠心脏。采用改良Krebs'液(NaCl 128, KCl 4.7, CaCl2 2.2, MgCl2 0.6,NaH2PO4 0.8, NaHCO3 12 和葡萄糖5.6 mmol/L,pH 7.2),(37±0.5)℃恒速恒压灌流。平衡15 min后记录冠脉流量,通过紧靠灌流心脏插管的旁侧三通管恒速灌注等体积溶媒2 min后记录指标,尔后恒速灌注脑垂体后叶素(终浓度为1.67×10-2u/ml), 观察15 min内指标变化; 随后将注射剂的原料药配成适宜浓度同法给予, 记录给脑垂体后叶素后各时间点指标。
, http://www.100md.com
2.4 离体家兔血管条 常规制备离体血管螺旋条置于Krebs'液(配方同上)[4]。通氧于( 37±0.5)℃, 采用微拉力换能器连接U-135C型岛津记录仪观察5-ISMN注射剂的原料药对2×10-6mol/L 的去甲肾上腺素(NE)引起兔离体降主动脉、肺动脉、肾动脉、股动脉、肾静脉、股静脉螺旋条收缩的抑制作用，计算IC50及最大舒张百分率。
2.5 对NO的影响
2.5.1 体外NO产生 参照Yasuhiro及Rein法(Griess法)[5,6]测定0.02 mmol/L的5-ISMN注射剂的原料药及0.02 mmol/L硝普钠(SNP)在含或不含25 mmo l/L的L-半胱氨酸(L-Cys)的0.1 mol/L的磷酸缓冲液(PBS)中亚硝酸盐(NO-2)含量。将SD大鼠((300±16.5)g)乙醚麻醉后放血致死，立即取血测定大鼠血清 NO-2含量，同时取胸主动脉置于Krebs'液，彻底清除周围组织及血迹，将其剪为5 m m长血管段置于含25 mmol/L的L-Cys的Krebs'液中。37℃水浴锅温育10 min，后将血管条均置于不同浓度(0.04，0.08，0.16 mmol/L的5-ISMN)含药管中，再次温育。分别于0，5 ，10，15，30 min测定NO-2含量，同法测定含L-Cys但无血管条的上述系列浓度的药物在Krebs'液中NO-2含量，NO水平以NO-2表示。采用亚硝酸钠作标准，用CL-7 70型分光光度计进行测定(波长548 nm)。
, http://www.100md.com
2.5.2 体外NO测定 仿照上法，将12.5，25，5 0 mg/kg的5-ISMN及等体积溶媒分别一次性ig大鼠。于给药前及给药后30，60，120 min 分别测定大鼠血清中的NO-2含量。
3 统计方法
结果用均数±标准差表示，前后变化差值行配对t检验，组间比较用成组t检验。
结 果
1 对3种实验性心肌缺血的影响
溶媒组结扎LAD后ST段立即出现缺血性改变并持续60 min，梗塞范围达41%，CP K和LDH 显著升高，见表1及表2。给溶媒后再静注 ISP其ST段缺血性改变明显，5-ISMN二个剂量组对ST段改变有缓解作用(P<0.01)，可降低LVEDP(P<0.05)，呈量效趋势，对血流动力学其他指标影响不明显。溶媒组给脑垂体后叶素致冠脉流量明显下降，44，88 μmol /(ml*min )5-ISMN可拮抗脑垂体后叶素所致的冠脉流量减少(P<0.05，0.01)，高剂量略有增加趋势，约增加0.38 ml/min 。
, 百拇医药
表1 5-ISMN对结扎LAD后ECG的影响
(
±s，n=8)
分组
结扎前
结扎后( min)
5
10
15
30
60
, 百拇医药
ΣST(mv)
溶媒
0.45±0.17
1.12 ±0.32
1.20±0.36
1.29±0.31
1.35±0.36
1.08±0.21
3 mg/kg
0.50±0.21
1.15±0.31
1.09±0.33
, 百拇医药
1.10±0.3 0
1.00±0.22a
0.76±0.20b
6 mg/kg
0.45±0.17
0.68±0.13b
0.64±0.13b
0.55 ±0.09b
0.60±0.14b
0.59±0.12b
, 百拇医药
NST
溶媒
1.45±0.53
4.51±1.42
4.30±1.51
4.23±1.51
4.14±1.62
4.10±1.66
3 mg/kg
1.35±0.37
4.70±1.50
4.71±1.61
, 百拇医药
4.33±1.5 0
2.98±0.93
2.00±0.62b
6 mg/kg
1.39±0.35
2.40±1.21b
2.34±1.17b
1.30 ±0.32b
2.50±0.54a
1.59±0.43b
, 百拇医药
与溶媒比较a：P<0.05，b:P<0.01 表2 5-ISMN对结扎大鼠LAD后血清CPK、LDH及心肌缺血区百分比的影响
(±s，n=8)
分组
CPK(u/L)
LDH(u/L)
心肌缺血区百分比(%)
溶 媒
3 968±700
624±111
, http://www.100md.com
41±4
3 mg/kg
2 033±160a
345±32a
27±5a
6 mg/kg
1 922±146a
320±46a
19±4a
与溶媒比较 a:P<0.01 2 离体家兔血管条
, 百拇医药
结果表明5-ISMN对NE引起兔离体降主动脉、肺动脉、肾动脉、股动脉、肾静脉、股静脉螺旋条收缩呈浓度依赖性抑制作用，其IC50依次为(5.5±0.6)(n = 8)，(2.6± 0.1 )(n = 6)，(3.0±0.1)(n = 5)，(8.7±0.5)(n = 5)，(0.4±0. 1)(n = 5)，(0.5±0.1)(n = 5)μg/ml。最大舒张百分率依次为(81±3) %，(63±2)%，(82±2)%，(69±3)%，(88±4)%及(94 ±2)%，显示扩张静脉强于动脉。
3 对NO的影响
SNP及5-ISMN在无L-Cys的PBS中无NO产生，在含L-Cys的PBS中SNP产生的NO明显高于5-IS MN (P<0.01)；两药物在体外大鼠血清中能产生NO，但P<0.05，见表3。5-ISMN在体外有L- Cys的含与不含血管条营养液中及不同剂量体内给药均能产生一定量的NO(P<0.05，0. 01)，呈剂量及时间依赖性，见表4及表5。
, http://www.100md.com
表3 5-ISMN在体外大鼠血清及含L-Cys的
PBS中NO(μmol/L)的产生(±s ，n=5)
分组
0 min
15 min
30 min
PBS
SNP
3.2±0.9
, http://www.100md.com 267.3±60.4
334.8±56.8
5-ISMN
0.7± 0.1a
0.8±0.2a
1.0±0.2a
大鼠血清
SNP
10.6± 2.1
44.5±9.1
55.8±11.1
, http://www.100md.com
5-ISMN
12.2± 5.3
26.7±5.4
48.3±10.2
与比较a:P<0.01 表4 5-ISMN在体外大鼠离体血管条
NO(μmol / L)的产生 (±s，n=5)
剂量(mmol/L)
0 min
5 mi n
, http://www.100md.com
10 min
15 min
30 min
0.04
0.00±0.00
0.00±0.00
0.20±0.08
1.00±0.15
1.40 ±0.38
0.04+血管条
0.00±0.00
0.00±0.00
, 百拇医药
0.40±0.10a
1.40±0. 30a
1.60±0.27
0.08
0.00±0.00
0.40±0.16
1.80±0.08
2.50±0.53
2.80 ±0.49
0.08+血管条
0.40±0.05b
, 百拇医药
1.40±0.25b
2.20±0.57
3.00 ±0.47
3.30±0.46
0.16
0.60±0.11
1.60±0.34
2.40±0.54
4.00±0.22
5.40 ±0.91
0.16+血管条
, 百拇医药 1.20±0.20b
2.70±0.40b
3.20±0.41a
4.40±0.54
6.20±0.78
相同浓度不同处理间比较 a:P<0.05，b:P<0.01 表5 5-ISMN(ig)在体内大鼠血清
NO(μmol / L)的产生(±s，n=6)
剂量(mg/kg)
, 百拇医药
0 h
0.5 h
1 h
2 h
溶媒
5.0±1.1
7.8±1.7
0.0±0.0
0.0±0.0
12.5
4.7±1.0
20.0±4.3a
, 百拇医药
9.0±2.5a
0.0±0.0
25
4.8±1.1
73.8±12.7a
220.3±25.4a
84.5±14.8a
50
5.1±0.9
75.0±14.0a
436.5±53.2a
, 百拇医药
151.5±32.3a
与溶媒比较 a:P<0.01 讨 论
抗实验性心肌缺血的方法很多，而评价药物的疗效最重要的是用药前后梗死面积的变化。本研究发现5-ISMN注射剂能降低缺血心肌的CPK和LDH，逆转心电图的缺血性改变，缩小心肌梗死区面积。扩张静脉强于动脉，对心率和血压影响不明显，不因显著降压而致体位性降压，但能降低LVEDP，从而降低心室壁张力，增加冠脉流量，上述作用均有利于防治缺血性心脏病。
NO性质不稳定，通过测定NO-2 / NO-3来间接反映NO的生成量[7 ]。5-ISMN不能自发释放NO，其释放速率似与体液中L-Cys密切相关。本身是否被动静脉组织摄取，以及释放NO 的关键条件尚有待进一步研究。有报道SNP仅在反应液被可见光辐射时才自发释放NO, 在我们实验条件下发现SNP不能自发释放NO, 与国外报道一致[5]。
, http://www.100md.com
本实验供试样品为剂型的改变, 故未采用阳性对照药。在离体心脏灌流本实验采用将所给药物通过灌流装置的旁侧三通管直接向主动脉根部注入, 避免了药物的浪费, 又能很快的观察到药物效果, 较传统给药方法有所改进。实验证明对结扎大鼠LAD后1 h立即测定血清CP K和LDH及直接向主动脉根部注入染料测定心肌梗塞区范围均能明显观察到心肌缺血的表现, 无须长期观察。■
参考文献：
[1]黄文兴, 张世玲. 离体心脏实验法. 见:徐叔云, 卞如濂, 陈修主编. 药理实验方法学.第2版. 北京: 人民卫生出版社, 1994. 863～886
[2]中华人民共和国卫生部药政局编. 新药(西药)临床前研究指导原则汇编(药学药理学毒理学).1993.61～62
[3]Katsuhiko H, Yuzo F, Atsushi M, et al. Effect of KRN2391, a novel vasodilator, on various experimental anginal models in rats. Japan J Pha rmacol , 1993,63∶35
, 百拇医药
[4]可君. 离体血管张力实验法.见:徐叔云, 卞如濂, 陈修主编. 药理实验方法学.第2版. 北京: 人民卫生出版社，1994.983～991
[5]Yashiro Kita,Shinichi Fukuyama,Yoshimi Hirasawa. Close correlation bet ween nitric oxide formation from NO release and biological activities of these a gents in rats. Japan J Pharmacol,1995,69∶69
[6]Rein van der Zee,Toyoaki Murohara,LUO-ZhengYu,et al. Vascula rendothelial growth factor/vascular permeability factor augments nitric oxider elease from quiescent rabbit and human vascular endothelium. Circulation, 1997，95(4)∶1030
[7]周武雄. 一氧化氮的循环系统生理学. 见: 钟慈声, 孙安阳主编.一氧化氮的生物医学.上海：上海医科大学出版社, 1997.357～368
收稿日期：1999-05-05
修稿日期：1999-11-09, 百拇医药
单位：彭芳(云南省大理医学院药理教研室，大理 671000)；陈植和(昆明医学院省天然药物药理重点实验室，昆明 650031)；王德成(昆明医学院省天然药物药理重点实验室，昆明 650031)；李玲(昆明医学院省天然药物药理重点实验室，昆明 650031)
关键词：单硝酸异山梨醇酯；心肌缺血；一氧化氮
国产单硝酸异山梨醇酯注射剂 抗实验性心肌缺血及对一氧化氮产生的影响
摘 要：目的：研究国产单硝酸异山梨醇酯(5-ISMN)注射剂抗实验性心肌缺血及NO产生情况。方法：观察药物对三种实验性心肌梗死的保护作用及多种离体血管条的效应，测定体内外给药其NO产生情况(Griess法)。结果：5-ISMN能降低结扎大鼠LAD致心肌缺血的ΣST，NST ，心肌缺血区百分比和血清CPK，LDH(P<0.05，0.01)；可使ISP诱发大鼠心肌缺血的ΣST及LVEDP降低，对血流动力学其他指标影响不明显；还可拮抗脑垂体后叶素所致豚鼠冠脉流量下降(P<0.05，0.01)。本品对去甲肾上腺素(NE)引起兔多种离体血管条的收缩呈浓度依赖性抑制作用，扩张静脉强于动脉。5-ISMN体内外给药在无L-Cys的磷酸缓冲液不能产生外，其他均有一定量NO产生，且呈剂量及时间依赖性(P<0.05，0.01)。结论：国产5-ISMN注射剂具有一定抗心肌缺血效应及不能自发释放NO。
, http://www.100md.com
EFFECTS OF DOMESTIC ISOSORBIDE-5-MONONITRATE (5-ISMN) ON ANTIMYOCARDIAL ISCHEMIA AND NITRIC OXIDE RELEASE IN ANIMAL MODELS
Peng Fang,Chen Zhihe,Wang Decheng,et al.
(Department of Pharmacology,Dali Medical College of Yunnan Province,Dali 671000)
ABSTRACT：OBJECTIVE：To study the effects of 5-ISMN on anti-my ocardial ischemia and nitric oxide release in animal models.METHODS：3 animal models of myocardial ischemia and many isolated vascular strips were adop ted in the study and the release of nitric oxide in vitro and in vivo we re deter mined by Griess method. RESULTS：5-ISMN may reduce the myocardial ischemic ΣST and NST,the percentage of ischemic area,and serum levels of CPK and LDH(P<0.05，0.01)induced by LDA ligation in rats;and it may also reduce the my ocardial ischemic ΣST and LVEDP induced by ISP rats (P<0.05，0.01) but noobviou s effects on haemodynamic parameters.The drug may antagonize reduction in coronary blood volume(P<0.05，0.01)evoked by posterior pituitary in guinea pigs. The drug may inhibit the concentration-dependent relaxation induced by NE in isolate dstrips of rabbits and this inhibitive effect was more pronounce in veins than in arteries .The generation of NO occurred in all cases when 5-ISMN is administ rated,except in PBS or Krebs' solution without L-cysteine. CONCLUSION：Domestic 5-ISMN injection has been shown to have significant anti-myocardial ischemic effects but spontaneous release of NO do not occur.
, 百拇医药
KEY WORDS：Isosorbide-5-mononitrate;Myocardial ischemia;Nitric oxide▲
国产单硝酸异山梨醇酯(5-ISMN)片剂用于预防和治疗缺血性心脏病已在世界各国获得广泛应用，国外早在临床上使用多种剂型的5-ISMN，而国内较落后。现开发注射剂不仅满足临床用药需要，且疗效更为显著，但国内对国产5-ISMN注射剂的系统研究甚少。本实验就5-ISMN对多种实验性心肌缺血的保护作用及多种离体血管条的效应，测定体内外给药其一氧化氮(NO)产生情况等方面参数，以期对该药的开发和临床应用提供实验基础。
材料和方法
1 药品和试剂
5-ISMN注射剂(25mg/100ml)及其原料药、溶媒由四川乐山三民药物研究所提供，余所需试剂为国内市售产品。
, http://www.100md.com
2 方法
2.1 结扎大鼠冠状动脉所致心肌缺血 SD大鼠(250±14.8)g，雌雄兼用，乌拉坦1.0g/kg腹腔麻醉。按文献方法[1，2]结扎左冠状动脉前降支(LAD), 迅速关闭胸腔,恢复自主呼吸。将动物随机分为Ⅰ组(溶媒组), Ⅱ组(注射5-ISMN 3mg/kg)，Ⅲ组(注射 5-ISMN 6mg/kg), 各组均于结扎前5 m in静注,记录结扎前及结扎后5,10,15,30,60min的心电图ECG，于RM-6000型多道生理记录仪的Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ导联同步标记。以ST段抬高≥2mm或下降≥ 1mm为阳性点(按1 mv = 20 mm定标), 计算各时间点内出现阳性点的总数目(NST),并计算各时间ST段上下偏移总mv数(ΣST)。结扎后1h取血, 立即测定磷酸肌酸激酶(CPK)和乳酸脱氢酶(LDH)。经主动脉根部注入1.5 ml/kg稀释1倍的印度墨汁,迅速取下心脏, 冰冻30～40 min,将心室肌切成等厚度的5片, 分别称取墨水染色区及非染色区(缺血区)之重量, 计算心肌缺血区百分比。
, 百拇医药
2.2 异丙肾上腺素诱导大鼠心肌缺血 健康Wistar 大鼠(225±20.6)g,用 1 .0g/kg乌拉坦麻醉。按文献方法[3]行股、颈动脉插管,于RM-6000多道生理记录仪同步记录ECG、左室内压(LVP)、左室内压变化速率(Lvdp/dt)、左室舒张末压(L VEDP)、收缩压(SAP)、舒张压(DAP)。采用异丙肾上腺素(ISP)筛选合格的动物即ISP 10 μg/kg恒速iv达5 min, 如ST段压低>0.1mv即可使用(按1mv=10mm 定标)。待各指标稳定后, 将动物分成Ⅰ组(5mg/kg)和Ⅱ组(10mg/kg)，各组均先给等体积溶媒,约5 min后iv ISP 10μg/kg;随后恒速注射5-ISMN,5 min后各组再同上iv ISP,每次给ISP后对各项指标变化观察30min。
2.3 离体豚鼠心脏灌流(脑垂体后叶素致心肌缺血) 选用健康豚鼠(330±28.9)g, 雌雄不拘, 按 Langendoff法[1]制备离体豚鼠心脏。采用改良Krebs'液(NaCl 128, KCl 4.7, CaCl2 2.2, MgCl2 0.6,NaH2PO4 0.8, NaHCO3 12 和葡萄糖5.6 mmol/L,pH 7.2),(37±0.5)℃恒速恒压灌流。平衡15 min后记录冠脉流量,通过紧靠灌流心脏插管的旁侧三通管恒速灌注等体积溶媒2 min后记录指标,尔后恒速灌注脑垂体后叶素(终浓度为1.67×10-2u/ml), 观察15 min内指标变化; 随后将注射剂的原料药配成适宜浓度同法给予, 记录给脑垂体后叶素后各时间点指标。
, http://www.100md.com
2.4 离体家兔血管条 常规制备离体血管螺旋条置于Krebs'液(配方同上)[4]。通氧于( 37±0.5)℃, 采用微拉力换能器连接U-135C型岛津记录仪观察5-ISMN注射剂的原料药对2×10-6mol/L 的去甲肾上腺素(NE)引起兔离体降主动脉、肺动脉、肾动脉、股动脉、肾静脉、股静脉螺旋条收缩的抑制作用，计算IC50及最大舒张百分率。
2.5 对NO的影响
2.5.1 体外NO产生 参照Yasuhiro及Rein法(Griess法)[5,6]测定0.02 mmol/L的5-ISMN注射剂的原料药及0.02 mmol/L硝普钠(SNP)在含或不含25 mmo l/L的L-半胱氨酸(L-Cys)的0.1 mol/L的磷酸缓冲液(PBS)中亚硝酸盐(NO-2)含量。将SD大鼠((300±16.5)g)乙醚麻醉后放血致死，立即取血测定大鼠血清 NO-2含量，同时取胸主动脉置于Krebs'液，彻底清除周围组织及血迹，将其剪为5 m m长血管段置于含25 mmol/L的L-Cys的Krebs'液中。37℃水浴锅温育10 min，后将血管条均置于不同浓度(0.04，0.08，0.16 mmol/L的5-ISMN)含药管中，再次温育。分别于0，5 ，10，15，30 min测定NO-2含量，同法测定含L-Cys但无血管条的上述系列浓度的药物在Krebs'液中NO-2含量，NO水平以NO-2表示。采用亚硝酸钠作标准，用CL-7 70型分光光度计进行测定(波长548 nm)。
, http://www.100md.com
2.5.2 体外NO测定 仿照上法，将12.5，25，5 0 mg/kg的5-ISMN及等体积溶媒分别一次性ig大鼠。于给药前及给药后30，60，120 min 分别测定大鼠血清中的NO-2含量。
3 统计方法
结果用均数±标准差表示，前后变化差值行配对t检验，组间比较用成组t检验。
结 果
1 对3种实验性心肌缺血的影响
溶媒组结扎LAD后ST段立即出现缺血性改变并持续60 min，梗塞范围达41%，CP K和LDH 显著升高，见表1及表2。给溶媒后再静注 ISP其ST段缺血性改变明显，5-ISMN二个剂量组对ST段改变有缓解作用(P<0.01)，可降低LVEDP(P<0.05)，呈量效趋势，对血流动力学其他指标影响不明显。溶媒组给脑垂体后叶素致冠脉流量明显下降，44，88 μmol /(ml*min )5-ISMN可拮抗脑垂体后叶素所致的冠脉流量减少(P<0.05，0.01)，高剂量略有增加趋势，约增加0.38 ml/min 。
, 百拇医药
表1 5-ISMN对结扎LAD后ECG的影响
(
±s，n=8)分组
结扎前
结扎后( min)
5
10
15
30
60
, 百拇医药
ΣST(mv)
溶媒
0.45±0.17
1.12 ±0.32
1.20±0.36
1.29±0.31
1.35±0.36
1.08±0.21
3 mg/kg
0.50±0.21
1.15±0.31
1.09±0.33
, 百拇医药
1.10±0.3 0
1.00±0.22a
0.76±0.20b
6 mg/kg
0.45±0.17
0.68±0.13b
0.64±0.13b
0.55 ±0.09b
0.60±0.14b
0.59±0.12b
, 百拇医药
NST
溶媒
1.45±0.53
4.51±1.42
4.30±1.51
4.23±1.51
4.14±1.62
4.10±1.66
3 mg/kg
1.35±0.37
4.70±1.50
4.71±1.61
, 百拇医药
4.33±1.5 0
2.98±0.93
2.00±0.62b
6 mg/kg
1.39±0.35
2.40±1.21b
2.34±1.17b
1.30 ±0.32b
2.50±0.54a
1.59±0.43b
, 百拇医药
与溶媒比较a：P<0.05，b:P<0.01 表2 5-ISMN对结扎大鼠LAD后血清CPK、LDH及心肌缺血区百分比的影响
(
±s，n=8)分组
CPK(u/L)
LDH(u/L)
心肌缺血区百分比(%)
溶 媒
3 968±700
624±111
, http://www.100md.com
41±4
3 mg/kg
2 033±160a
345±32a
27±5a
6 mg/kg
1 922±146a
320±46a
19±4a
与溶媒比较 a:P<0.01 2 离体家兔血管条
, 百拇医药
结果表明5-ISMN对NE引起兔离体降主动脉、肺动脉、肾动脉、股动脉、肾静脉、股静脉螺旋条收缩呈浓度依赖性抑制作用，其IC50依次为(5.5±0.6)(n = 8)，(2.6± 0.1 )(n = 6)，(3.0±0.1)(n = 5)，(8.7±0.5)(n = 5)，(0.4±0. 1)(n = 5)，(0.5±0.1)(n = 5)μg/ml。最大舒张百分率依次为(81±3) %，(63±2)%，(82±2)%，(69±3)%，(88±4)%及(94 ±2)%，显示扩张静脉强于动脉。
3 对NO的影响
SNP及5-ISMN在无L-Cys的PBS中无NO产生，在含L-Cys的PBS中SNP产生的NO明显高于5-IS MN (P<0.01)；两药物在体外大鼠血清中能产生NO，但P<0.05，见表3。5-ISMN在体外有L- Cys的含与不含血管条营养液中及不同剂量体内给药均能产生一定量的NO(P<0.05，0. 01)，呈剂量及时间依赖性，见表4及表5。
, http://www.100md.com
表3 5-ISMN在体外大鼠血清及含L-Cys的
PBS中NO(μmol/L)的产生(
±s ，n=5)分组
0 min
15 min
30 min
PBS
SNP
3.2±0.9
, http://www.100md.com 267.3±60.4
334.8±56.8
5-ISMN
0.7± 0.1a
0.8±0.2a
1.0±0.2a
大鼠血清
SNP
10.6± 2.1
44.5±9.1
55.8±11.1
, http://www.100md.com
5-ISMN
12.2± 5.3
26.7±5.4
48.3±10.2
与比较a:P<0.01 表4 5-ISMN在体外大鼠离体血管条
NO(μmol / L)的产生 (
±s，n=5)剂量(mmol/L)
0 min
5 mi n
, http://www.100md.com
10 min
15 min
30 min
0.04
0.00±0.00
0.00±0.00
0.20±0.08
1.00±0.15
1.40 ±0.38
0.04+血管条
0.00±0.00
0.00±0.00
, 百拇医药
0.40±0.10a
1.40±0. 30a
1.60±0.27
0.08
0.00±0.00
0.40±0.16
1.80±0.08
2.50±0.53
2.80 ±0.49
0.08+血管条
0.40±0.05b
, 百拇医药
1.40±0.25b
2.20±0.57
3.00 ±0.47
3.30±0.46
0.16
0.60±0.11
1.60±0.34
2.40±0.54
4.00±0.22
5.40 ±0.91
0.16+血管条
, 百拇医药 1.20±0.20b
2.70±0.40b
3.20±0.41a
4.40±0.54
6.20±0.78
相同浓度不同处理间比较 a:P<0.05，b:P<0.01 表5 5-ISMN(ig)在体内大鼠血清
NO(μmol / L)的产生(
±s，n=6)剂量(mg/kg)
, 百拇医药
0 h
0.5 h
1 h
2 h
溶媒
5.0±1.1
7.8±1.7
0.0±0.0
0.0±0.0
12.5
4.7±1.0
20.0±4.3a
, 百拇医药
9.0±2.5a
0.0±0.0
25
4.8±1.1
73.8±12.7a
220.3±25.4a
84.5±14.8a
50
5.1±0.9
75.0±14.0a
436.5±53.2a
, 百拇医药
151.5±32.3a
与溶媒比较 a:P<0.01 讨 论
抗实验性心肌缺血的方法很多，而评价药物的疗效最重要的是用药前后梗死面积的变化。本研究发现5-ISMN注射剂能降低缺血心肌的CPK和LDH，逆转心电图的缺血性改变，缩小心肌梗死区面积。扩张静脉强于动脉，对心率和血压影响不明显，不因显著降压而致体位性降压，但能降低LVEDP，从而降低心室壁张力，增加冠脉流量，上述作用均有利于防治缺血性心脏病。
NO性质不稳定，通过测定NO-2 / NO-3来间接反映NO的生成量[7 ]。5-ISMN不能自发释放NO，其释放速率似与体液中L-Cys密切相关。本身是否被动静脉组织摄取，以及释放NO 的关键条件尚有待进一步研究。有报道SNP仅在反应液被可见光辐射时才自发释放NO, 在我们实验条件下发现SNP不能自发释放NO, 与国外报道一致[5]。
, http://www.100md.com
本实验供试样品为剂型的改变, 故未采用阳性对照药。在离体心脏灌流本实验采用将所给药物通过灌流装置的旁侧三通管直接向主动脉根部注入, 避免了药物的浪费, 又能很快的观察到药物效果, 较传统给药方法有所改进。实验证明对结扎大鼠LAD后1 h立即测定血清CP K和LDH及直接向主动脉根部注入染料测定心肌梗塞区范围均能明显观察到心肌缺血的表现, 无须长期观察。■
参考文献：
[1]黄文兴, 张世玲. 离体心脏实验法. 见:徐叔云, 卞如濂, 陈修主编. 药理实验方法学.第2版. 北京: 人民卫生出版社, 1994. 863～886
[2]中华人民共和国卫生部药政局编. 新药(西药)临床前研究指导原则汇编(药学药理学毒理学).1993.61～62
[3]Katsuhiko H, Yuzo F, Atsushi M, et al. Effect of KRN2391, a novel vasodilator, on various experimental anginal models in rats. Japan J Pha rmacol , 1993,63∶35
, 百拇医药
[4]可君. 离体血管张力实验法.见:徐叔云, 卞如濂, 陈修主编. 药理实验方法学.第2版. 北京: 人民卫生出版社，1994.983～991
[5]Yashiro Kita,Shinichi Fukuyama,Yoshimi Hirasawa. Close correlation bet ween nitric oxide formation from NO release and biological activities of these a gents in rats. Japan J Pharmacol,1995,69∶69
[6]Rein van der Zee,Toyoaki Murohara,LUO-ZhengYu,et al. Vascula rendothelial growth factor/vascular permeability factor augments nitric oxider elease from quiescent rabbit and human vascular endothelium. Circulation, 1997，95(4)∶1030
[7]周武雄. 一氧化氮的循环系统生理学. 见: 钟慈声, 孙安阳主编.一氧化氮的生物医学.上海：上海医科大学出版社, 1997.357～368
收稿日期：1999-05-05
修稿日期：1999-11-09, 百拇医药