反相HPLC测定人血浆中阿尼西坦的代谢物
作者：黄莹 徐为人 史穗宝 只德广 刘昌孝
单位：天津药物研究院药理室，天津300193
关键词：阿尼西坦；对甲氧基苯甲酰氨基丁酸
中国新药杂志000415
摘要 目的：建立反相HPLC测定人体中阿尼西坦血药浓度的方法。方法：12名健康志愿者单剂量口服阿尼西坦400mg后，用反相HPLC 研究血中对甲氧基苯甲酰氨基丁酸(PNBA)的浓度及代谢动力学过程，经3P87软件处理数据。结果：该方法经线性、精密性和准确度验证，日内变异系数(n=5)及日间变异系数(n=6)均在10%以内，检 测限量为0.1μg/ml,Cmax达17.5μg/ml,Tmax为23min,AUC为727(μg.min)/ml 。结论：此方法的可靠性较好，比直接测定阿尼西坦浓度更方便，有 实际意义。
, 百拇医药
THE DETERMINATION OF ANIRACETAM METABOLITE IN HUMAN PLASMA
BY REVERSE-PHASE HPLC
Huang Ying Xu Weiren Shi Suibao et al.
(Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, State Drug Administratio n, Tianjin 300193)
ABSTRACT OBJECTIVE: A convenient and accurate method, reverse-phase HPLC method is establis hed to detect the concentration of aniracetam metabolite, N-anisoyl-GABA (II) (PNBA). METHODS: After oral administrate of aniracetam to humans, it is rapidly, extensively and mainly metabolized to active metabolite, N-anisoyl-G A BA, with very low concentration of aniracetam in plasma. It is reasonable to eva luated the bioavailability of aniracetam formulations by measuring PNBA and to a nalyze the plasma samples of twelve healthy volunteers. RESULTS: The method was validated by linerity, precision and accu racy tests. The limit of quantitation was 0.1μg/ml. The RSD was <10% in intra- day and day-by-day tests. The result of Cmax was 17.5μg/ml, Tmax 23min and AUC 727 (μg.min)/ml.CONCLUSIONS: It is indirect, true and convenient to study the ani racetam metabolite by this method. It is more reliable than other direct methods .
, 百拇医药
KEY WORDS Aniracetam; PNBA
阿尼西坦为脑功能改善剂，治疗中老年记忆减退及脑血管病后的记忆减退。文献 报道[1]口服阿尼西坦后血药浓度很低，一般的色谱条件无法准确地对其进行检测 ，常用的 阿尼西坦分析方法有气质联用法、14C 同位素标记放射性检测法和内标法[2 ]，但 由于上述仪器不普及而且分析操作复杂，所以不便于应用[3]。我们以HPLC研究 了血清中阿尼西坦 代谢产物对甲氧基苯甲酰氨基丁酸(PNBA)的测定方法，并测定了健康人口服阿尼西 坦的动力学过程。
材料与方法
1 材料
试剂：PNBA(自制，含量99.0%)，乙腈(一级色谱纯，天津市四友生物医学技术有限公 司，批号810093545，)，二甲基甲酰胺(DMF，天津南开大学分校特种试剂厂，批号920515) 。
, 百拇医药
药品：阿尼西坦胶囊(三乐喜，无锡艾西恩制药有限公司，批号980701)。
仪器：HPLC：WATERS 515泵，717自动进样器，RAININ紫外检测器；高速台式离心机(TGL- 16C型，上海安亭科学仪器厂)。
2 方法
2.1 色谱条件 流动相：乙腈-水-磷酸=20∶80∶0.1，脱气后经0.45 μm微孔滤膜滤过 ，流速为1.0 ml/min;固定相：C18柱(5 μm)，4.6mm×250mm，BECKMAN产品，批号1U E5957;检测器：UV 250 nm，0.005AUFS;进样量：10 μl。
2.2 标准曲线的制备 在1.5 ml塑料离心管中各加入900 μl空白血浆，再加入100 μl不 同浓度的PNBA溶液，复管操作，配成0.10，0.20，0.50，1.0，2.0，5.0，10.0和20.0 μg/ml 8个浓度的标准血浆样品，处理测定，以峰面积(A)对其浓度(C)作标准曲线,所得标 准曲线为C=0.000268A+0.053,r=0.99994,检测限量为0.1μg/ml。
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2.3 回收率 在15个含900 μl空白血浆的离心管中加入100 μl不同浓度的PNBA溶液，配 成0.50，2.0和10.0 μg/ml 3个浓度各5管，重复处理测定，以对照品同浓度溶液的峰面 积确定绝对回收率。
2.4 日内和日间变异系数 标准曲线中0.50，2.0和10.0 μg/ml的3个浓度，连续重复进 样5次，测定日内变异系数；每个浓度的2个样品每天进样1次，连续3d，测定日间变异系数 。
2.5 血样处理存放 志愿者静脉血约2 ml以20 μl肝素(25 u/ml)抗凝后分离得到血浆样 品，定量取400 μl，加入400 μl DMF充分混匀，放置30 min，以14 000 r/mi n离心10 min,沉淀蛋白，3d内用HPLC测定样品中PNBA浓度，进样量10μl，以标准曲线计 算 含量。
2.6 生物利用度测定 确认12名健康男性为受试对象，年龄为22～40岁，体重在53～80 k g之间。在试验前1周内受试者停服一切药品，食用低脂肪食品，受试期间禁忌烟酒。 受试者禁食12 h后，单剂量给药400mg,于早晨8∶00服用，200 ml 温开水送服。分别于服药前及服药后5，10，20，30，45，60，90，120和180min采取静脉血 约2 ml，以20 μl的肝素钠抗凝，离心4 000 r/min，2 min，分离血浆，血浆样品 处理方法同“2.5”项，取上清液10 μl直接进样测定血药浓度。
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3 统计学处理
以3P87软件拟合药代参数，计算AUC，Tmax和Cmax。
结果
1 血浆回收率
见表1。
表1 血浆回收率(
±s，n=5) 浓度
(μg/ml)
测定浓度
(μg/ml)
回收率
(%)
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RSD
(%)
0.50
0.46±0.01
91.5
2.0
2.0
1.87±0.02
93.7
0.9
10.0
9.63±0.13
96.3
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1.3
2 日内及日间变异系数
见表2。日内测定的准确性和重现性较好，样品比较稳定，3d内PNBA浓度几乎没有变化， RSD均在10%以内。表2 日内及日间变异系数(±s，n=6 ) PNBA
(μg/ml)
日内测定
(μg/ml)
RSD
(%)
日间测定
(μg/ml)
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RSD
(%)
0.50
0.51±0.00
1.74
0.47±0.04
9.41
2.0
2.01±0.02
1.18
1.92±0.06
3.57
10.0
, 百拇医药
10.2±0.05
0.59
10.2±0.05
0.48
3 药时曲线及药代动力学参数
12名健康志愿者给药后，测得血中PNBA药时曲线如图1所示。经3P87软件拟合确定，符合一级吸收一房室消除的动力学模型；以每个个体的血浓时间数据计算药代参数，结果见表3。
图1 志愿受试者单剂量口服阿尼西坦
胶囊的平均药时曲线
表3 单剂量口服阿尼西坦后药时曲线拟合的药代参数 参数±s
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A (μg/ml)
44.9±20.5
ke (min-1
0.038±0.012
ka (min-1
4.967±15.87
AUC〔(mg.min)/ml〕
727.2±135.1
t1/2ka(min)
7.074±4.913
, http://www.100md.com
t1/2ke(min)
19.82±5.93
Cmax (μg/ml)
17.5±5.5
Tmax (min)
22.9±9.6
CL/F (L/min)
0.601±0.109
V/F (L)
16.76±4.30
讨论 我们参考文献1的HPLC检测条件测定了人血浆中阿尼西坦的浓度，由于口服阿尼 西 坦后，血中原形药物浓度极低，Cmax在20 ng/ml以下[1]，20min后就检测不 到了，结果并不理想。据文献报道[3]，在常温下，血清和标准溶液中的阿尼西 坦稳定性均较差。
, 百拇医药
阿尼西坦的主要代谢产物为PNBA(约70%)和吡咯烷酮(约30%) ，两者均为活性产物。我们建 立了反相HPLC测定PNBA的方法，研究结果表明：PNBA的血浆样品，其线性、回收率及重现性 良好，日内及日间变异系数均在10%以内，方法的可靠性较好。因此，测定血中阿尼西坦代 谢产物PNBA的浓度比直接测定阿尼西坦更方便，有实际意义。
参考文献
1，Guenzi A， Zanetti M. Determination of aniracetam and its main metabolite, N-anisoyl-GABA, in human plasma by high-performance liquid chromatography, J Chromatogr Biomed Appl， 1990， 530∶397
2，邵 东. 阿尼西坦及其胶囊的HPLC测定.中国医药工业杂志，1995，26(7)∶324
3，崔秀生. 高效液相色谱法分析血清中微量阿尼西坦.首都医科大学学报，1996 ，17(2)∶130
收稿：1999-09-29
修回：1999-12-27, 百拇医药
单位：天津药物研究院药理室，天津300193
关键词：阿尼西坦；对甲氧基苯甲酰氨基丁酸
中国新药杂志000415
摘要 目的：建立反相HPLC测定人体中阿尼西坦血药浓度的方法。方法：12名健康志愿者单剂量口服阿尼西坦400mg后，用反相HPLC 研究血中对甲氧基苯甲酰氨基丁酸(PNBA)的浓度及代谢动力学过程，经3P87软件处理数据。结果：该方法经线性、精密性和准确度验证，日内变异系数(n=5)及日间变异系数(n=6)均在10%以内，检 测限量为0.1μg/ml,Cmax达17.5μg/ml,Tmax为23min,AUC为727(μg.min)/ml 。结论：此方法的可靠性较好，比直接测定阿尼西坦浓度更方便，有 实际意义。
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THE DETERMINATION OF ANIRACETAM METABOLITE IN HUMAN PLASMA
BY REVERSE-PHASE HPLC
Huang Ying Xu Weiren Shi Suibao et al.
(Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, State Drug Administratio n, Tianjin 300193)
ABSTRACT OBJECTIVE: A convenient and accurate method, reverse-phase HPLC method is establis hed to detect the concentration of aniracetam metabolite, N-anisoyl-GABA (II) (PNBA). METHODS: After oral administrate of aniracetam to humans, it is rapidly, extensively and mainly metabolized to active metabolite, N-anisoyl-G A BA, with very low concentration of aniracetam in plasma. It is reasonable to eva luated the bioavailability of aniracetam formulations by measuring PNBA and to a nalyze the plasma samples of twelve healthy volunteers. RESULTS: The method was validated by linerity, precision and accu racy tests. The limit of quantitation was 0.1μg/ml. The RSD was <10% in intra- day and day-by-day tests. The result of Cmax was 17.5μg/ml, Tmax 23min and AUC 727 (μg.min)/ml.CONCLUSIONS: It is indirect, true and convenient to study the ani racetam metabolite by this method. It is more reliable than other direct methods .
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KEY WORDS Aniracetam; PNBA
阿尼西坦为脑功能改善剂，治疗中老年记忆减退及脑血管病后的记忆减退。文献 报道[1]口服阿尼西坦后血药浓度很低，一般的色谱条件无法准确地对其进行检测 ，常用的 阿尼西坦分析方法有气质联用法、14C 同位素标记放射性检测法和内标法[2 ]，但 由于上述仪器不普及而且分析操作复杂，所以不便于应用[3]。我们以HPLC研究 了血清中阿尼西坦 代谢产物对甲氧基苯甲酰氨基丁酸(PNBA)的测定方法，并测定了健康人口服阿尼西 坦的动力学过程。
材料与方法
1 材料
试剂：PNBA(自制，含量99.0%)，乙腈(一级色谱纯，天津市四友生物医学技术有限公 司，批号810093545，)，二甲基甲酰胺(DMF，天津南开大学分校特种试剂厂，批号920515) 。
, 百拇医药
药品：阿尼西坦胶囊(三乐喜，无锡艾西恩制药有限公司，批号980701)。
仪器：HPLC：WATERS 515泵，717自动进样器，RAININ紫外检测器；高速台式离心机(TGL- 16C型，上海安亭科学仪器厂)。
2 方法
2.1 色谱条件 流动相：乙腈-水-磷酸=20∶80∶0.1，脱气后经0.45 μm微孔滤膜滤过 ，流速为1.0 ml/min;固定相：C18柱(5 μm)，4.6mm×250mm，BECKMAN产品，批号1U E5957;检测器：UV 250 nm，0.005AUFS;进样量：10 μl。
2.2 标准曲线的制备 在1.5 ml塑料离心管中各加入900 μl空白血浆，再加入100 μl不 同浓度的PNBA溶液，复管操作，配成0.10，0.20，0.50，1.0，2.0，5.0，10.0和20.0 μg/ml 8个浓度的标准血浆样品，处理测定，以峰面积(A)对其浓度(C)作标准曲线,所得标 准曲线为C=0.000268A+0.053,r=0.99994,检测限量为0.1μg/ml。
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2.3 回收率 在15个含900 μl空白血浆的离心管中加入100 μl不同浓度的PNBA溶液，配 成0.50，2.0和10.0 μg/ml 3个浓度各5管，重复处理测定，以对照品同浓度溶液的峰面 积确定绝对回收率。
2.4 日内和日间变异系数 标准曲线中0.50，2.0和10.0 μg/ml的3个浓度，连续重复进 样5次，测定日内变异系数；每个浓度的2个样品每天进样1次，连续3d，测定日间变异系数 。
2.5 血样处理存放 志愿者静脉血约2 ml以20 μl肝素(25 u/ml)抗凝后分离得到血浆样 品，定量取400 μl，加入400 μl DMF充分混匀，放置30 min，以14 000 r/mi n离心10 min,沉淀蛋白，3d内用HPLC测定样品中PNBA浓度，进样量10μl，以标准曲线计 算 含量。
2.6 生物利用度测定 确认12名健康男性为受试对象，年龄为22～40岁，体重在53～80 k g之间。在试验前1周内受试者停服一切药品，食用低脂肪食品，受试期间禁忌烟酒。 受试者禁食12 h后，单剂量给药400mg,于早晨8∶00服用，200 ml 温开水送服。分别于服药前及服药后5，10，20，30，45，60，90，120和180min采取静脉血 约2 ml，以20 μl的肝素钠抗凝，离心4 000 r/min，2 min，分离血浆，血浆样品 处理方法同“2.5”项，取上清液10 μl直接进样测定血药浓度。
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3 统计学处理
以3P87软件拟合药代参数，计算AUC，Tmax和Cmax。
结果
1 血浆回收率
见表1。
表1 血浆回收率(
±s，n=5) 浓度(μg/ml)
测定浓度
(μg/ml)
回收率
(%)
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RSD
(%)
0.50
0.46±0.01
91.5
2.0
2.0
1.87±0.02
93.7
0.9
10.0
9.63±0.13
96.3
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1.3
2 日内及日间变异系数
见表2。日内测定的准确性和重现性较好，样品比较稳定，3d内PNBA浓度几乎没有变化， RSD均在10%以内。表2 日内及日间变异系数(
±s，n=6 ) PNBA(μg/ml)
日内测定
(μg/ml)
RSD
(%)
日间测定
(μg/ml)
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RSD
(%)
0.50
0.51±0.00
1.74
0.47±0.04
9.41
2.0
2.01±0.02
1.18
1.92±0.06
3.57
10.0
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10.2±0.05
0.59
10.2±0.05
0.48
3 药时曲线及药代动力学参数
12名健康志愿者给药后，测得血中PNBA药时曲线如图1所示。经3P87软件拟合确定，符合一级吸收一房室消除的动力学模型；以每个个体的血浓时间数据计算药代参数，结果见表3。
图1 志愿受试者单剂量口服阿尼西坦
胶囊的平均药时曲线
表3 单剂量口服阿尼西坦后药时曲线拟合的药代参数 参数
±s, http://www.100md.com
A (μg/ml)
44.9±20.5
ke (min-1
0.038±0.012
ka (min-1
4.967±15.87
AUC〔(mg.min)/ml〕
727.2±135.1
t1/2ka(min)
7.074±4.913
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t1/2ke(min)
19.82±5.93
Cmax (μg/ml)
17.5±5.5
Tmax (min)
22.9±9.6
CL/F (L/min)
0.601±0.109
V/F (L)
16.76±4.30
讨论 我们参考文献1的HPLC检测条件测定了人血浆中阿尼西坦的浓度，由于口服阿尼 西 坦后，血中原形药物浓度极低，Cmax在20 ng/ml以下[1]，20min后就检测不 到了，结果并不理想。据文献报道[3]，在常温下，血清和标准溶液中的阿尼西 坦稳定性均较差。
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阿尼西坦的主要代谢产物为PNBA(约70%)和吡咯烷酮(约30%) ，两者均为活性产物。我们建 立了反相HPLC测定PNBA的方法，研究结果表明：PNBA的血浆样品，其线性、回收率及重现性 良好，日内及日间变异系数均在10%以内，方法的可靠性较好。因此，测定血中阿尼西坦代 谢产物PNBA的浓度比直接测定阿尼西坦更方便，有实际意义。
参考文献
1，Guenzi A， Zanetti M. Determination of aniracetam and its main metabolite, N-anisoyl-GABA, in human plasma by high-performance liquid chromatography, J Chromatogr Biomed Appl， 1990， 530∶397
2，邵 东. 阿尼西坦及其胶囊的HPLC测定.中国医药工业杂志，1995，26(7)∶324
3，崔秀生. 高效液相色谱法分析血清中微量阿尼西坦.首都医科大学学报，1996 ，17(2)∶130
收稿：1999-09-29
修回：1999-12-27, 百拇医药