点突变p53及其抗原肽重组痘苗病毒抗肿瘤效应的比较研究
作者：张克强 侯春梅 杨靖清 唐佩弦 毛宁
单位：张克强(军事医学科学院基础医学研究所，北京100850)；侯春梅(军事医学科学院基础医学研究所，北京100850)；杨靖清(军事医学科学院基础医学研究所，北京100850)；唐佩弦(军事医学科学院基础医学研究所，北京100850)；毛宁(军事医学科学院基础医学研究所，北京100850)
关键词：p53；抗原肽；重组痘苗病毒
细胞与分子免疫学杂志000323
摘要:目的比较点突变p53及其抗原肽重组痘苗病毒诱导的抗瘤免疫反应，为重组抗原疫苗用于肿瘤免疫治疗提供实验依据。方法以人135位Cys→Tyr点突变p53为肿瘤相关抗原模型，观察以表达该点突变p53蛋白的重组痘苗病毒rVVp53FL与表达包含该点突变抗原肽p53125145的重组痘苗病毒rVVp53M所诱导的CTL及对荷瘤Balb/c小鼠的免疫保护和治疗作用。结果rVVp53FL和rVVp53M均能诱导以CD8+T细胞为主的特异性CTL。用rVVp53FL与rVVp53M免疫小鼠后，接种致死剂量的P815mp53细胞，能保护部分小鼠免遭致死剂量肿瘤细胞的攻击。小鼠接种致死剂量的肿瘤细胞后，以rVVp53FL与rVVp53M治疗荷瘤小鼠，可使小鼠平均存活时间显著延长。两种疫苗的抗瘤效应无明显区别。结论来源于突变p53的抗原肽重组疫苗，可代替抗原大分子应用于肿瘤的免疫防治。
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中图号:R730.51 文献标识码：A 文章编号：1007-8738(2000)03-0248-05
Comparison of antitumor responses induced by recombinant vaccinia viruses expressing a point mutant p53 and its antigenic peptide
ZHANG Ke-qiang HOU Chun-mei YANG Jing-qing TANG Pei-xuan MAO Ning
(Institute of Basic Medical Sciences, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850,China)
Abstract:Aim To explore antitumor responses induced by recombinant vaccinia viruses expressing a point mutant p53 (rVV p53FL)and its antigenic peptide rVV p53M). Methods P815 mastocytoma transduced with a 135 Cys to Tyr point mutation p53 was used as an experimental tumor (P815 mp53) and the p53 protein as the model of tumor associated antigen. rVV p53FL and rVV p53M were used as tumor vaccine to investigate their induction of CTL and antitumor immunity. Results Immunizing Balb/c mice with rVV p53FL and rVV p53M could induce specific CTLs, which specifically lysed P815 mp53 cells. After the immunized mice were challenged with a lethal dose of P815 mp53, a part of the mice survived. The mice bearing tumor was treated with rVV p53FL and rVV p53M, which could significantly prolong the mice′ s survival time. Antitumor response induced by rVV p53M was comparable to that by rVV p53FL. Conclusion antigenic peptide derived from mutant p53 protein may replace the protein as vaccine for antitumor immunotherapy.
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Keywords： p53； antigenic peptide； recombinant vaccinia virus ▲
癌基因和抑癌基因的改变是肿瘤细胞的一种共同现象，突变的癌基因和抑癌基因产物可成为免疫系统识别和攻击的靶分子。p53突变与多种肿瘤的发生和发展密切相关，是肿瘤易感基因之一〔1〕。由于p53突变是人类肿瘤最常见的基因改变，因而成为靶向性肿瘤免疫治疗中极具吸引力的靶分子。
随着MHC分子识别和递呈抗原理论的突破，以及多个肿瘤抗原CTL所识别的抗原肽的证实，以抗原肽代替完整抗原大分子诱导抗原特异性的肿瘤主动免疫治疗已成为可能。将人工合成编码抗原肽的双链寡核苷酸微基因(minigene)，整合至痘苗病毒基因组中，构建的重组疫苗是代替人工合成抗原肽的一种有效的免疫方法〔2〕。Yanuck等〔3〕报道，来源于人肺癌p53蛋白包含135位Cys→Tyr的点突变肽p53125-145(TYSPALNKMFYQLAKTCPRQL),能够诱导H2d限制性CTL。我们在此基础上，选择该点突变p53蛋白为肿瘤相关抗原模型，建立了表达该蛋白的小鼠肿瘤细胞P815mp53，并比较了表达突变p53蛋白及其抗原肽重组疫苗诱导的抗肿瘤免疫应答。
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1 材料和方法
1.1材料X-gal和5-Br尿嘧啶脱氧核苷酸为Sigma公司产品。LipofectamineTMReagent和G148为GibcoBRL公司产品，鼠抗人p53单克隆抗体(mAb)DOII为SantCruz公司产品。pJSA1175:包含痘苗病毒基因组TK基因的左右两部分，并有极性向反的两个痘苗病毒基因的启动子(其中在
11kb启动子下游插入标记基因LacZ，7.5kb启动子下空载)，由中国预防医学科学院病毒研究所阮力教授惠赠。pRC/CMVp53:含135位Cys→Tyr点突变的人p53基因，由美国Carbone博士惠赠〔3〕。肿瘤细胞P815(H2d)来源于DBA/2小鼠肥大瘤细胞系(本室保存)。人骨肉瘤TK-143细胞和野生型痘苗病毒中国天坛761株，由中国预防医学科学院病毒研究所阮力教授惠赠。Balb/c小鼠(H2d)，6～8wk龄，雌性，由本院动物中心提供。
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1.2方法
1.2.1重组痘苗病毒的构建和鉴定①重组质粒的构建：依据抗原肽p53125145的氨基酸序列合成引物I：5′CCACCATGACGTACCCTGCCCTCAACAAG
ATGTTTTACCAACTGGCC3′和引物II：5′CTATCA
CAGCTGCACAGGTCAGGTCTTGGCCAGTTGGTAAA
ACATCTTG3′。引物I:5′端引入了Kozak序列CCACC，其后紧接起始密码子ATG；引物II：3′端加入双终止密码子TGATAG〔4〕；划线部分为引物间碱基互补配对区。用PCR合成编码该肽的寡核苷酸minigene，克隆至pGEMT载体测序分析正确后，分别将minigene和点突变的p53基因的cDNA，插入质粒pJSA1175的7.5kb启动子下游构建重组质粒pJSA1175p53M与pJSA1175-p53。②重组痘苗病毒的构建：将TK+野生型痘苗病毒按0.1pfu(plaqueformingunite)/细胞感染TK-143细胞后，采用lipofectamine共转染法将重组质粒导入TK-143细胞，经同源重组获得重组痘苗病毒。在25mg/LBudr和200mg/LX-gal双重筛选下，获得蓝色重组痘苗病毒噬斑〔5〕。挑取单个蓝斑，纯化3～5代至蓝斑纯度达100%，分别命名为rVV-p53FL和rVV-p53M。③Minigene整合与转录的检测：设计5′端引物：CCACCATGACGTACTCCCCTG和3′端引物：CAGCTGCACAGGGCAGGTCT，提取rVV-p53M基因组DNA与RNA。以PCR和RTPCR检测minigene的整合与转录。④rVV-p53FL的表达：以rVV-p53FL感染TK-143细胞48h后，提取细胞总蛋白。以野生型痘苗病毒感染的TK-143细胞作为阴性对照，用ECLWesternboltanalysissystem试剂盒进行p53蛋白的检测。
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1.2.2肿瘤细胞系P815mp53的建立将质粒pRC/CMVp53采用lipofectamine共转染法导入P815细胞，以含600mg/LG418的培养液选择抗性克隆，并以免疫细胞化学染色法初检p53蛋白的表达，所获阳性克隆进一步用有限稀释法再克隆化培养，用Westernblot检测p53蛋白的表达。挑选p53表达高、全阳性的克隆作为表达突变p53蛋白的肿瘤细胞系P815mp53，置于含600mg/LG418的DMEM培养基中培养。
1.2.3CTL杀伤活性的测定①重组痘苗病毒的免疫接种及诱导CTL：取9只小鼠，随机分为3组，分别以1×107pfuwtVV，1×107pfurVV-p53M和1×107pfurVV-p53FL经静脉免疫4wk后，常规制备免疫鼠脾细胞悬液。取5～6×109/L脾细胞，分别与经80mg/L丝裂霉素C37℃处理45min的2～3×109/L的P815-mp53细胞等体积混合，在含25×103U/LrhIL2,2×103moL/LL谷氨酸、5×105mol/Lβ巯基乙醇及100mL/L小牛血清的培养基中，于50mL/LCO2条件下37℃培养5～6d，作为效应细胞〔6〕。②杀伤试验：靶细胞P815-mp53和P815细胞为阴性对照。效应细胞：收获体外经刺激细胞刺激5d的脾细胞，用Ficoll(d=1.0717)离心，除去死细胞。将活细胞稀释成不同浓度接种于96孔U形底培养板(100μL/孔)。将100μL靶细胞(1×104)与效应细胞混合，形成不同的效靶比(E∶T)，同时做自然释放孔和最大释放孔。于37℃50mL/LCO2条件下作用18h，离心取100μL上清，以乳酸脱氢酶法测定CTL的杀伤活性〔7〕，在酶联仪上读取540/490nm处的A值，结果按以下公式计算:
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③CTL的表型分析：以2mg/L的兔抗鼠抗CD4与CD8单克隆抗体(mAb)封闭CTL的杀伤活性，观察抗CD4与抗CD8mAb对CTL杀伤活性的影响。
1.2.4重组痘苗病毒在体内抗肿瘤的实验研究〔8〕
①保护性实验:取21只小鼠，随机分为3组，分别以1×107pfuwt-VV，1×107pfurVV-p53M和1×107pfurVV-p53FL于静脉免疫4wk后，经尾静脉接种致死剂量(1×106)的P815-mp53细胞，观察各免疫组小鼠的存活时间和存活率。②治疗性实验:取21只小鼠，随机分为3组，先通过静脉接种致死剂量的P815-mp53细胞，分别在接种后的第3天和第6天，静注1×107pfuwt-VV，1×107pfurVV-p53M和1×107pfurVV-p53FL免疫治疗各实验组小鼠，记录各免疫组小鼠的存活时间和存活率。
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2 结果
2.1Minigene整合与转录的检测Minigene经同源重组整合至痘苗病毒基因组后，可随病毒基因组一同复制、转录和翻译。然后，以PCR和RTPCR检测便可扩增出70bp的DNA条带。结果表明，目的基因已整合至痘苗病毒基因组并得到正确转录(图1)。
图1Minigene整合与转录的检测
1:PCR;2:pGEMF3zf/HaeIIImarker(587,458,434,323,289,267,174,142,102,80,18and11bpfromtoptobottom);3:RTPCR.
Fig 1 Integration and transcription of minigene
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2.2rVVp53FL的表达rVVp53FL以10pfu/细胞的剂量感染TK-143细胞48h后，做Westernblot检测出p53蛋白的表达(图2)。
2.3重组痘苗病毒诱导的CTL以rVVp53FL与rVVp53M免疫，均可诱导出有较显著杀伤活性的CTL应答。CTL能特异性地杀伤P815mp53，而对P815细胞则不杀伤。二者诱导的CTL杀伤活性无显著区别(P∧0.05，图3)。
图2Westernblot检测rVVp53FL的表达
Fig 2 Expression of rVV p53FL detected by Western blot
2.4抗CD4/CD8mAb对CTL杀伤活性的影响
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加入抗CD4mAb对CTL的杀伤活性基本无影响；而杀伤体系经抗CD8mAb处理后，CTL的杀伤活性显著降低(P∨0.05)，表明这种CTL的杀伤活性主要是由CD8+T细胞所介导(表1)。
表1抗CD4/CD8mAb对CTL杀伤活性的影响(A值)
Tab1EffectsofantiCD4/CD8mAbsonCTLcytotoxicity
(E:T=100:1) rVV-p53M
rVV-p53M
anti
rVVp53FL
CD4antiCD8
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rVVp53FL
rVVp53M
antiCD4
rVVp53FL
antiCD8
0.48±0.03
0.46±0.04
0.19±0.02a
0.56±0.07
0.46±0.03
0.21±0.03a
Max:
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0.83±0.03
Min:
0.17±0.01
aP∨0.05,vsrVVs.
图3重组痘苗病毒诱导的特异性CTL应答
Fig 3 p53 specific CTL response induced by rVVs 0
2.5重组痘苗病毒的抗瘤实验
2.5.1保护性实验用rVVp53M与rVVp53FL静脉免疫4wk后，经静脉接种致死剂量(1×106)的P815mp53，免疫小鼠的存活时间延长，表明部分小鼠对致死剂量肿瘤细胞的攻击得到保护(图4)。
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图4重组痘苗病毒的保护性实验(小鼠存活曲线)
Fig 4 Survival curve of the mice immunized with rVVs
2.5.2治疗性实验采用静脉接种致死剂量的P815mp533d，建立肿瘤致死模型。与接种WtVV的小鼠的存活时间〔(22.6±4.2)d〕相比较，静脉接种rVVp53M与rVVp53FL小鼠的存活时间显著延长〔分别为：(30.3±2.5)d和(30.3±2.5)d〕(P∨0.05)；但rVVp53M与rVVp53FL治疗组小鼠的存活时间无差别(P∨0.05，图5)。
图5重组痘苗病毒治疗荷瘤小鼠的存活曲线
Fig5SurvivalcurveofthebearingtumormicetreatedwithrVVs
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3 讨论
p53突变不仅可导致肿瘤细胞发生恶性表型和功能变化，而且可诱导特异性CTL应答和循环抗体的产生〔9〕。这种结构和功能异常的p53蛋白只表达于肿瘤细胞，因而可作为肿瘤相关抗原，成为机体免疫细胞识别和攻击的靶分子。本文研究结果表明，突变的p53蛋白能够作为肿瘤免疫治疗的靶抗原。
痘苗病毒是唯一能在胞浆内复制的DNA病毒，它不会整合入宿主细胞的基因组，故无致癌性等问题。作为活疫苗使用，它能够在受感染细胞的胞浆内大量表达外源性基因产物，诱导强而持久的抗原特异性细胞和体液免疫应答〔10〕。因此，痘苗病毒已广泛作为肿瘤抗原的载体应用于肿瘤的免疫治疗。HER2/neu原癌基因的过度表达可见于多种肿瘤。以大鼠HER-2/neu为肿瘤相关抗原的研究表明,用表达该蛋白的重组痘苗病毒免疫小鼠，能诱导很强的抗瘤免疫应答，保护小鼠抵抗转导HER2/neu基因的肿瘤细胞的攻击。但在大鼠体内却不能诱导有效的抗瘤免疫应答，原因在于大鼠可产生针对自身抗原的免疫耐受。而用其胞外区或胞内区短肽免疫大鼠，则可诱导针对HER2/neu的免疫应答〔11〕，表明对于弱免疫原性的自身抗原，抗原肽较完整的大分子抗原更易诱导免疫应答。由于肿瘤抗原多为免疫原性弱的抗原，因此肽疫苗更适用于肿瘤的免疫治疗。
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CD8+CTL是最主要的效应细胞，其所识别的是由MHC-I类分子递呈的8～12个氨基酸残基组成的抗原肽〔12〕。这种抗原肽免疫原性很弱，要诱导有效的免疫应答尚需加佐剂。将人工合成的编码抗原肽的双链寡核苷酸微基因(minigene)整合到痘苗病毒基因组中，构建的抗原肽基因疫苗在体内诱导细胞免疫应答的能力较其它经典的方法强〔1〕。这种微基因疫苗的优点是,无需人工合成大剂量的抗原肽和佐剂分子辅助。对于突变的癌基因或抑癌基因，若用全长cDNA构建基因疫苗，对正常细胞具有致癌的潜在危险，而抗原肽编码微基因则无此危险。本研究表明,重组p53抗原肽诱导CTL的抗瘤效应与p53重组痘苗病毒基本相同，可克服cDNA基因疫苗潜在的致癌危险性，故抗原肽重组疫苗有望应用于肿瘤的免疫治疗。■
作者简介：张克强，男，29岁，博士北京太平路27号 ， Tel.(010)66931969 2000 by J Cell Mol Immunol Press www.immunology. net/jcmi; Email. immuedit@fmmu.edu.cn
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〔12〕 Townsend A, Bodmer H. Antigen recognition by class I restricted T lymphocytes〔J〕 . Annu Rev Immunol, 1989;7:601- 624.
收稿日期：1999-08-10
修回日期：1999-10-12, 百拇医药
单位：张克强(军事医学科学院基础医学研究所，北京100850)；侯春梅(军事医学科学院基础医学研究所，北京100850)；杨靖清(军事医学科学院基础医学研究所，北京100850)；唐佩弦(军事医学科学院基础医学研究所，北京100850)；毛宁(军事医学科学院基础医学研究所，北京100850)
关键词：p53；抗原肽；重组痘苗病毒
细胞与分子免疫学杂志000323
摘要:目的比较点突变p53及其抗原肽重组痘苗病毒诱导的抗瘤免疫反应，为重组抗原疫苗用于肿瘤免疫治疗提供实验依据。方法以人135位Cys→Tyr点突变p53为肿瘤相关抗原模型，观察以表达该点突变p53蛋白的重组痘苗病毒rVVp53FL与表达包含该点突变抗原肽p53125145的重组痘苗病毒rVVp53M所诱导的CTL及对荷瘤Balb/c小鼠的免疫保护和治疗作用。结果rVVp53FL和rVVp53M均能诱导以CD8+T细胞为主的特异性CTL。用rVVp53FL与rVVp53M免疫小鼠后，接种致死剂量的P815mp53细胞，能保护部分小鼠免遭致死剂量肿瘤细胞的攻击。小鼠接种致死剂量的肿瘤细胞后，以rVVp53FL与rVVp53M治疗荷瘤小鼠，可使小鼠平均存活时间显著延长。两种疫苗的抗瘤效应无明显区别。结论来源于突变p53的抗原肽重组疫苗，可代替抗原大分子应用于肿瘤的免疫防治。
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中图号:R730.51 文献标识码：A 文章编号：1007-8738(2000)03-0248-05
Comparison of antitumor responses induced by recombinant vaccinia viruses expressing a point mutant p53 and its antigenic peptide
ZHANG Ke-qiang HOU Chun-mei YANG Jing-qing TANG Pei-xuan MAO Ning
(Institute of Basic Medical Sciences, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850,China)
Abstract:Aim To explore antitumor responses induced by recombinant vaccinia viruses expressing a point mutant p53 (rVV p53FL)and its antigenic peptide rVV p53M). Methods P815 mastocytoma transduced with a 135 Cys to Tyr point mutation p53 was used as an experimental tumor (P815 mp53) and the p53 protein as the model of tumor associated antigen. rVV p53FL and rVV p53M were used as tumor vaccine to investigate their induction of CTL and antitumor immunity. Results Immunizing Balb/c mice with rVV p53FL and rVV p53M could induce specific CTLs, which specifically lysed P815 mp53 cells. After the immunized mice were challenged with a lethal dose of P815 mp53, a part of the mice survived. The mice bearing tumor was treated with rVV p53FL and rVV p53M, which could significantly prolong the mice′ s survival time. Antitumor response induced by rVV p53M was comparable to that by rVV p53FL. Conclusion antigenic peptide derived from mutant p53 protein may replace the protein as vaccine for antitumor immunotherapy.
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Keywords： p53； antigenic peptide； recombinant vaccinia virus ▲
癌基因和抑癌基因的改变是肿瘤细胞的一种共同现象，突变的癌基因和抑癌基因产物可成为免疫系统识别和攻击的靶分子。p53突变与多种肿瘤的发生和发展密切相关，是肿瘤易感基因之一〔1〕。由于p53突变是人类肿瘤最常见的基因改变，因而成为靶向性肿瘤免疫治疗中极具吸引力的靶分子。
随着MHC分子识别和递呈抗原理论的突破，以及多个肿瘤抗原CTL所识别的抗原肽的证实，以抗原肽代替完整抗原大分子诱导抗原特异性的肿瘤主动免疫治疗已成为可能。将人工合成编码抗原肽的双链寡核苷酸微基因(minigene)，整合至痘苗病毒基因组中，构建的重组疫苗是代替人工合成抗原肽的一种有效的免疫方法〔2〕。Yanuck等〔3〕报道，来源于人肺癌p53蛋白包含135位Cys→Tyr的点突变肽p53125-145(TYSPALNKMFYQLAKTCPRQL),能够诱导H2d限制性CTL。我们在此基础上，选择该点突变p53蛋白为肿瘤相关抗原模型，建立了表达该蛋白的小鼠肿瘤细胞P815mp53，并比较了表达突变p53蛋白及其抗原肽重组疫苗诱导的抗肿瘤免疫应答。
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1 材料和方法
1.1材料X-gal和5-Br尿嘧啶脱氧核苷酸为Sigma公司产品。LipofectamineTMReagent和G148为GibcoBRL公司产品，鼠抗人p53单克隆抗体(mAb)DOII为SantCruz公司产品。pJSA1175:包含痘苗病毒基因组TK基因的左右两部分，并有极性向反的两个痘苗病毒基因的启动子(其中在
11kb启动子下游插入标记基因LacZ，7.5kb启动子下空载)，由中国预防医学科学院病毒研究所阮力教授惠赠。pRC/CMVp53:含135位Cys→Tyr点突变的人p53基因，由美国Carbone博士惠赠〔3〕。肿瘤细胞P815(H2d)来源于DBA/2小鼠肥大瘤细胞系(本室保存)。人骨肉瘤TK-143细胞和野生型痘苗病毒中国天坛761株，由中国预防医学科学院病毒研究所阮力教授惠赠。Balb/c小鼠(H2d)，6～8wk龄，雌性，由本院动物中心提供。
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1.2方法
1.2.1重组痘苗病毒的构建和鉴定①重组质粒的构建：依据抗原肽p53125145的氨基酸序列合成引物I：5′CCACCATGACGTACCCTGCCCTCAACAAG
ATGTTTTACCAACTGGCC3′和引物II：5′CTATCA
CAGCTGCACAGGTCAGGTCTTGGCCAGTTGGTAAA
ACATCTTG3′。引物I:5′端引入了Kozak序列CCACC，其后紧接起始密码子ATG；引物II：3′端加入双终止密码子TGATAG〔4〕；划线部分为引物间碱基互补配对区。用PCR合成编码该肽的寡核苷酸minigene，克隆至pGEMT载体测序分析正确后，分别将minigene和点突变的p53基因的cDNA，插入质粒pJSA1175的7.5kb启动子下游构建重组质粒pJSA1175p53M与pJSA1175-p53。②重组痘苗病毒的构建：将TK+野生型痘苗病毒按0.1pfu(plaqueformingunite)/细胞感染TK-143细胞后，采用lipofectamine共转染法将重组质粒导入TK-143细胞，经同源重组获得重组痘苗病毒。在25mg/LBudr和200mg/LX-gal双重筛选下，获得蓝色重组痘苗病毒噬斑〔5〕。挑取单个蓝斑，纯化3～5代至蓝斑纯度达100%，分别命名为rVV-p53FL和rVV-p53M。③Minigene整合与转录的检测：设计5′端引物：CCACCATGACGTACTCCCCTG和3′端引物：CAGCTGCACAGGGCAGGTCT，提取rVV-p53M基因组DNA与RNA。以PCR和RTPCR检测minigene的整合与转录。④rVV-p53FL的表达：以rVV-p53FL感染TK-143细胞48h后，提取细胞总蛋白。以野生型痘苗病毒感染的TK-143细胞作为阴性对照，用ECLWesternboltanalysissystem试剂盒进行p53蛋白的检测。
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1.2.2肿瘤细胞系P815mp53的建立将质粒pRC/CMVp53采用lipofectamine共转染法导入P815细胞，以含600mg/LG418的培养液选择抗性克隆，并以免疫细胞化学染色法初检p53蛋白的表达，所获阳性克隆进一步用有限稀释法再克隆化培养，用Westernblot检测p53蛋白的表达。挑选p53表达高、全阳性的克隆作为表达突变p53蛋白的肿瘤细胞系P815mp53，置于含600mg/LG418的DMEM培养基中培养。
1.2.3CTL杀伤活性的测定①重组痘苗病毒的免疫接种及诱导CTL：取9只小鼠，随机分为3组，分别以1×107pfuwtVV，1×107pfurVV-p53M和1×107pfurVV-p53FL经静脉免疫4wk后，常规制备免疫鼠脾细胞悬液。取5～6×109/L脾细胞，分别与经80mg/L丝裂霉素C37℃处理45min的2～3×109/L的P815-mp53细胞等体积混合，在含25×103U/LrhIL2,2×103moL/LL谷氨酸、5×105mol/Lβ巯基乙醇及100mL/L小牛血清的培养基中，于50mL/LCO2条件下37℃培养5～6d，作为效应细胞〔6〕。②杀伤试验：靶细胞P815-mp53和P815细胞为阴性对照。效应细胞：收获体外经刺激细胞刺激5d的脾细胞，用Ficoll(d=1.0717)离心，除去死细胞。将活细胞稀释成不同浓度接种于96孔U形底培养板(100μL/孔)。将100μL靶细胞(1×104)与效应细胞混合，形成不同的效靶比(E∶T)，同时做自然释放孔和最大释放孔。于37℃50mL/LCO2条件下作用18h，离心取100μL上清，以乳酸脱氢酶法测定CTL的杀伤活性〔7〕，在酶联仪上读取540/490nm处的A值，结果按以下公式计算:
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③CTL的表型分析：以2mg/L的兔抗鼠抗CD4与CD8单克隆抗体(mAb)封闭CTL的杀伤活性，观察抗CD4与抗CD8mAb对CTL杀伤活性的影响。
1.2.4重组痘苗病毒在体内抗肿瘤的实验研究〔8〕
①保护性实验:取21只小鼠，随机分为3组，分别以1×107pfuwt-VV，1×107pfurVV-p53M和1×107pfurVV-p53FL于静脉免疫4wk后，经尾静脉接种致死剂量(1×106)的P815-mp53细胞，观察各免疫组小鼠的存活时间和存活率。②治疗性实验:取21只小鼠，随机分为3组，先通过静脉接种致死剂量的P815-mp53细胞，分别在接种后的第3天和第6天，静注1×107pfuwt-VV，1×107pfurVV-p53M和1×107pfurVV-p53FL免疫治疗各实验组小鼠，记录各免疫组小鼠的存活时间和存活率。
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2 结果
2.1Minigene整合与转录的检测Minigene经同源重组整合至痘苗病毒基因组后，可随病毒基因组一同复制、转录和翻译。然后，以PCR和RTPCR检测便可扩增出70bp的DNA条带。结果表明，目的基因已整合至痘苗病毒基因组并得到正确转录(图1)。
图1Minigene整合与转录的检测
1:PCR;2:pGEMF3zf/HaeIIImarker(587,458,434,323,289,267,174,142,102,80,18and11bpfromtoptobottom);3:RTPCR.
Fig 1 Integration and transcription of minigene
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2.2rVVp53FL的表达rVVp53FL以10pfu/细胞的剂量感染TK-143细胞48h后，做Westernblot检测出p53蛋白的表达(图2)。
2.3重组痘苗病毒诱导的CTL以rVVp53FL与rVVp53M免疫，均可诱导出有较显著杀伤活性的CTL应答。CTL能特异性地杀伤P815mp53，而对P815细胞则不杀伤。二者诱导的CTL杀伤活性无显著区别(P∧0.05，图3)。
图2Westernblot检测rVVp53FL的表达
Fig 2 Expression of rVV p53FL detected by Western blot
2.4抗CD4/CD8mAb对CTL杀伤活性的影响
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加入抗CD4mAb对CTL的杀伤活性基本无影响；而杀伤体系经抗CD8mAb处理后，CTL的杀伤活性显著降低(P∨0.05)，表明这种CTL的杀伤活性主要是由CD8+T细胞所介导(表1)。
表1抗CD4/CD8mAb对CTL杀伤活性的影响(A值)
Tab1EffectsofantiCD4/CD8mAbsonCTLcytotoxicity
(E:T=100:1) rVV-p53M
rVV-p53M
anti
rVVp53FL
CD4antiCD8
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rVVp53FL
rVVp53M
antiCD4
rVVp53FL
antiCD8
0.48±0.03
0.46±0.04
0.19±0.02a
0.56±0.07
0.46±0.03
0.21±0.03a
Max:
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0.83±0.03
Min:
0.17±0.01
aP∨0.05,vsrVVs.
图3重组痘苗病毒诱导的特异性CTL应答
Fig 3 p53 specific CTL response induced by rVVs 0
2.5重组痘苗病毒的抗瘤实验
2.5.1保护性实验用rVVp53M与rVVp53FL静脉免疫4wk后，经静脉接种致死剂量(1×106)的P815mp53，免疫小鼠的存活时间延长，表明部分小鼠对致死剂量肿瘤细胞的攻击得到保护(图4)。
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图4重组痘苗病毒的保护性实验(小鼠存活曲线)
Fig 4 Survival curve of the mice immunized with rVVs
2.5.2治疗性实验采用静脉接种致死剂量的P815mp533d，建立肿瘤致死模型。与接种WtVV的小鼠的存活时间〔(22.6±4.2)d〕相比较，静脉接种rVVp53M与rVVp53FL小鼠的存活时间显著延长〔分别为：(30.3±2.5)d和(30.3±2.5)d〕(P∨0.05)；但rVVp53M与rVVp53FL治疗组小鼠的存活时间无差别(P∨0.05，图5)。
图5重组痘苗病毒治疗荷瘤小鼠的存活曲线
Fig5SurvivalcurveofthebearingtumormicetreatedwithrVVs
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3 讨论
p53突变不仅可导致肿瘤细胞发生恶性表型和功能变化，而且可诱导特异性CTL应答和循环抗体的产生〔9〕。这种结构和功能异常的p53蛋白只表达于肿瘤细胞，因而可作为肿瘤相关抗原，成为机体免疫细胞识别和攻击的靶分子。本文研究结果表明，突变的p53蛋白能够作为肿瘤免疫治疗的靶抗原。
痘苗病毒是唯一能在胞浆内复制的DNA病毒，它不会整合入宿主细胞的基因组，故无致癌性等问题。作为活疫苗使用，它能够在受感染细胞的胞浆内大量表达外源性基因产物，诱导强而持久的抗原特异性细胞和体液免疫应答〔10〕。因此，痘苗病毒已广泛作为肿瘤抗原的载体应用于肿瘤的免疫治疗。HER2/neu原癌基因的过度表达可见于多种肿瘤。以大鼠HER-2/neu为肿瘤相关抗原的研究表明,用表达该蛋白的重组痘苗病毒免疫小鼠，能诱导很强的抗瘤免疫应答，保护小鼠抵抗转导HER2/neu基因的肿瘤细胞的攻击。但在大鼠体内却不能诱导有效的抗瘤免疫应答，原因在于大鼠可产生针对自身抗原的免疫耐受。而用其胞外区或胞内区短肽免疫大鼠，则可诱导针对HER2/neu的免疫应答〔11〕，表明对于弱免疫原性的自身抗原，抗原肽较完整的大分子抗原更易诱导免疫应答。由于肿瘤抗原多为免疫原性弱的抗原，因此肽疫苗更适用于肿瘤的免疫治疗。
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CD8+CTL是最主要的效应细胞，其所识别的是由MHC-I类分子递呈的8～12个氨基酸残基组成的抗原肽〔12〕。这种抗原肽免疫原性很弱，要诱导有效的免疫应答尚需加佐剂。将人工合成的编码抗原肽的双链寡核苷酸微基因(minigene)整合到痘苗病毒基因组中，构建的抗原肽基因疫苗在体内诱导细胞免疫应答的能力较其它经典的方法强〔1〕。这种微基因疫苗的优点是,无需人工合成大剂量的抗原肽和佐剂分子辅助。对于突变的癌基因或抑癌基因，若用全长cDNA构建基因疫苗，对正常细胞具有致癌的潜在危险，而抗原肽编码微基因则无此危险。本研究表明,重组p53抗原肽诱导CTL的抗瘤效应与p53重组痘苗病毒基本相同，可克服cDNA基因疫苗潜在的致癌危险性，故抗原肽重组疫苗有望应用于肿瘤的免疫治疗。■
作者简介：张克强，男，29岁，博士北京太平路27号 ， Tel.(010)66931969 2000 by J Cell Mol Immunol Press www.immunology. net/jcmi; Email. immuedit@fmmu.edu.cn
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收稿日期：1999-08-10
修回日期：1999-10-12, 百拇医药