人肿瘤坏死因子与人纤溶酶原饼环区5融合基因原核载体的构建
作者：范彬 颜真 张英起 苏成芝
单位：范彬(第四军医大学生物技术中心，陕西西安 710032)；颜真(第四军医大学生物技术中心，陕西西安 710032)；张英起(第四军医大学生物技术中心，陕西西安 710032)；苏成芝(第四军医大学生物技术中心，陕西西安 710032)
关键词：hTNF α ； 纤溶酶原； 肿瘤治疗
细胞与分子免疫学杂志000305
中图号： Q784 文献标识码： A 文章编号：1007-8738(2000)03-0198-02▲
人肿瘤坏死因子α(humantumornecrosisfactor-α，hTNF-α)是由单核巨噬细胞分泌的，杀伤肿瘤细胞活性最强的一种细胞因子，特异性强，不损伤正常细胞。我们通过分子生物学技术获得的新型hTNF-α(nhTNF-α)〔1〕较天然hTNF-α的活性提高了100倍，而毒性却为天然hTNF-α的1/3。人纤溶酶原饼环区5(humanplasminogenkringle5，hPgnK5)蛋白〔2〕可特异性地抑制肿瘤新生血管内皮细胞的生长，进而达到抑制肿瘤生长，治疗肿瘤的良好效果，是目前通过抑制肿瘤新生血管生长治疗肿瘤的蛋白药物中较有前景的一种。我们通过PCR反应，去除nhTNF-α3′端终止码，再将其连入pGEM3ZF(-)hPgnK5基因位点前，获得nhTNF-α和hPgnK5的融合基因，序列分析正确，为进一步在原核系统中表达该融合蛋白打下了基础。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1材料nhTNF-α基因〔1〕和hPgnK5基因〔3〕为本室构建。EcoRI，BamHI，PstI和TaqDNA聚合酶均为Gibco公司产品。pGEM3ZF(-)和JM109为本室保存。质粒纯化试剂盒与核酸片段纯化试剂盒为Promega产品。PCR引物由上海博亚公司合成。
1.2方法
1.2.1nhTNF-α基因的改造以含nhTNF-α的质粒为模板，用下列引物(A，B)进行PCR反应。引物A与nrhTNF-α5′端对应，引物B与nrhTNF-α3′端对应，并引入了凝血酶作用位点的编码序列。PCR反应的条件为：94℃60s，58℃60s，72℃60s，共30个循环。
引物A:5′CGGAATTCATGCGCAAACGTA3′；
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引物B:5′CGGGATCCACGCGGAACCAGGAAGGC
AATGATCCCAAAGTA3′.
1.2.2DNA重组及序列测定参照《分子克隆》〔4〕将PCR扩增产物经纯化，EcoRI和BamHI酶切消化，回收后与经上述酶处理的质粒pGEM3ZF(-)和hPgnK5连接，转化JM109细胞，筛选菌落，酶切获得插入片段大小正确的融合基因原核载体，并进行测序。
2 结果
2.1nhTNF-α基因的改造以nhTNF-α质粒为模板，经PCR扩增，获得1条约为470bp的核酸片段，符合预计的结果(图1)。
图1PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析
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1：nhTNFαPCR扩增产物；2：DNAmarker.
2.2融合基因的构建将经PCR扩增的nhTNF-α核酸片段回收，经EcoRI和BamHI消化、回收并纯化后，与经上述酶处理过的质粒pGEM3ZF(-)/hPgnK5连接，引入JM109细胞中。随机挑选克隆，以EcoRI和PstI酶切鉴定，获得大小约为770bp的酶切片段，符合预计的结果(图2)。
图2pGEM3ZF(-)/nhTNF-α/hPgnK5的酶切鉴定
1：pGEM3ZF(-)/nhTNF-α/hPgnK5；2：pGEM3ZF(-)/hPgnK5；3：DNAmarker.
2.3融合基因的序列分析用DNA全序列分析仪分析重组质粒。结果显示，nhTNFα经PCR反应后，除去了终止码并正确引入凝血酶作用蛋白基因序列，与hPgnK5基因正确连接。两端为EcoRI和PstI的酶切位点，整条核酸序列共777bp，读框正确，其结果如下：
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GAATTCATGCGCAAACGTAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGG(60)
EcoRI
CAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGA(120)
GATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTC(180)
AAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCC(240)
GTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAG(300)
, 百拇医药
ACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTC(360)
CAGCTGGAGAAGGGTGACCGACTCAGCGCTGAGATCAATCGGCCCGACTATCTCGACTTT(420)
GCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGCCTTCCTGGTTCCGCGTGGATCCATG(480)
BamHI
GTGCTGCTTCCGGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAA(540)
GGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCC(600)
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CAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAA(660)
AAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAAT(720)
CCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTAACTGCAG(777)
pstI
3 讨论
TNF-α可有效地杀伤并抑制肿瘤细胞，但不能阻断肿瘤新生血管给肿瘤供给营养；而hPgnK5蛋白虽可抑制肿瘤血管生长，进而使肿瘤体积消退，却不能根除肿瘤细胞。因此，我们将nhTNF-α与hPgnK5基因构建在一起，希望能够得到既有杀伤肿瘤细胞又可抑制肿瘤新生血管的融合蛋白。已有工作表明，单纯克隆与表达K5蛋白均有困难。Cao〔2〕和Lu〔5〕有关K5蛋白的工作是用鼠源性的带6个His的K5蛋白进行的，而Ji〔6〕的工作是首先表达K4-K5蛋白，再经弹性酶切割获得K5蛋白而完成的。我们在获得K5基因后，进行蛋白单独表达的尝试也证明了这点。因此，我们在nhTNF-α与hPgnK5基因之间，引入凝血酶作用位点的编码序列，希望在获得双功能蛋白的同时，通过凝血酶的切割，获得单独的K5蛋白，以更好地研究其功能。■
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作者简介： 范彬，男，34岁，讲师，博士生西安市长乐西路17号 ，Tel.(029)3374774-404
参考文献:
〔1〕 杨 辉 ， 张 英 起 ， 李 芳 梅 , 等 . 大 肠 杆 菌 表 达 人 新 型 肿 瘤 坏 死 因 子 的 纯 化 〔J〕 . 第 四 军 医 大 学 学 报 , 1997; 18(3): 221 224.
〔2〕 Cao Y, Chen A, An SS, et al. Kringle 5 of plasminogen is a novel inhibitor of endothelial cell growth〔J〕 . J Biol Chem, 1997; 272 (36): 22924 22928.
〔3〕 范 彬 , 颜 真 , 张 英 起 , 等 . 人 纤 溶 酶 原 饼 环 区 5基 因 的 化 学 合 成 与 原 核 载 体 的 构 建 〔J〕 . 第 四 军 医 大 学 学 报 , 2000; 21(2): 248 249.
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〔4〕 J. 萨 姆 布 鲁 克 ， EF.弗 里 奇 ， T.曼 尼 阿 蒂 斯 (侯 云 德 译 ).分 子 克 隆 实 验 指 南 〔M〕 . 第 2版 .北 京 ： 科 学 出 版 社 ， 1992： 19 59.
〔5〕 Lu H, Dhanabal M, Volk R, et al. Kringle 5 causes cell cycle arrest and apoptosis of endothelial cells〔J〕 . Biochem Biophys Res Commun, 1999; 258(3):668 673.
〔6〕 Ji WR, Barrientos LG, Llinas M, et al. Selective inhibiton by kringle 5 of human plasminogen on endothlial cell migration, an important process in angiogenesi
〔J〕 . Biochem Biophys Res Commun, 1998;247(2):414 419.
收稿日期：1999-12-28
修回日期：2000-01-25, 百拇医药
单位：范彬(第四军医大学生物技术中心，陕西西安 710032)；颜真(第四军医大学生物技术中心，陕西西安 710032)；张英起(第四军医大学生物技术中心，陕西西安 710032)；苏成芝(第四军医大学生物技术中心，陕西西安 710032)
关键词：hTNF α ； 纤溶酶原； 肿瘤治疗
细胞与分子免疫学杂志000305
中图号： Q784 文献标识码： A 文章编号：1007-8738(2000)03-0198-02▲
人肿瘤坏死因子α(humantumornecrosisfactor-α，hTNF-α)是由单核巨噬细胞分泌的，杀伤肿瘤细胞活性最强的一种细胞因子，特异性强，不损伤正常细胞。我们通过分子生物学技术获得的新型hTNF-α(nhTNF-α)〔1〕较天然hTNF-α的活性提高了100倍，而毒性却为天然hTNF-α的1/3。人纤溶酶原饼环区5(humanplasminogenkringle5，hPgnK5)蛋白〔2〕可特异性地抑制肿瘤新生血管内皮细胞的生长，进而达到抑制肿瘤生长，治疗肿瘤的良好效果，是目前通过抑制肿瘤新生血管生长治疗肿瘤的蛋白药物中较有前景的一种。我们通过PCR反应，去除nhTNF-α3′端终止码，再将其连入pGEM3ZF(-)hPgnK5基因位点前，获得nhTNF-α和hPgnK5的融合基因，序列分析正确，为进一步在原核系统中表达该融合蛋白打下了基础。
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1 材料和方法
1.1材料nhTNF-α基因〔1〕和hPgnK5基因〔3〕为本室构建。EcoRI，BamHI，PstI和TaqDNA聚合酶均为Gibco公司产品。pGEM3ZF(-)和JM109为本室保存。质粒纯化试剂盒与核酸片段纯化试剂盒为Promega产品。PCR引物由上海博亚公司合成。
1.2方法
1.2.1nhTNF-α基因的改造以含nhTNF-α的质粒为模板，用下列引物(A，B)进行PCR反应。引物A与nrhTNF-α5′端对应，引物B与nrhTNF-α3′端对应，并引入了凝血酶作用位点的编码序列。PCR反应的条件为：94℃60s，58℃60s，72℃60s，共30个循环。
引物A:5′CGGAATTCATGCGCAAACGTA3′；
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引物B:5′CGGGATCCACGCGGAACCAGGAAGGC
AATGATCCCAAAGTA3′.
1.2.2DNA重组及序列测定参照《分子克隆》〔4〕将PCR扩增产物经纯化，EcoRI和BamHI酶切消化，回收后与经上述酶处理的质粒pGEM3ZF(-)和hPgnK5连接，转化JM109细胞，筛选菌落，酶切获得插入片段大小正确的融合基因原核载体，并进行测序。
2 结果
2.1nhTNF-α基因的改造以nhTNF-α质粒为模板，经PCR扩增，获得1条约为470bp的核酸片段，符合预计的结果(图1)。
图1PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析
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1：nhTNFαPCR扩增产物；2：DNAmarker.
2.2融合基因的构建将经PCR扩增的nhTNF-α核酸片段回收，经EcoRI和BamHI消化、回收并纯化后，与经上述酶处理过的质粒pGEM3ZF(-)/hPgnK5连接，引入JM109细胞中。随机挑选克隆，以EcoRI和PstI酶切鉴定，获得大小约为770bp的酶切片段，符合预计的结果(图2)。
图2pGEM3ZF(-)/nhTNF-α/hPgnK5的酶切鉴定
1：pGEM3ZF(-)/nhTNF-α/hPgnK5；2：pGEM3ZF(-)/hPgnK5；3：DNAmarker.
2.3融合基因的序列分析用DNA全序列分析仪分析重组质粒。结果显示，nhTNFα经PCR反应后，除去了终止码并正确引入凝血酶作用蛋白基因序列，与hPgnK5基因正确连接。两端为EcoRI和PstI的酶切位点，整条核酸序列共777bp，读框正确，其结果如下：
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GAATTCATGCGCAAACGTAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGG(60)
EcoRI
CAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGA(120)
GATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTC(180)
AAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCC(240)
GTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAG(300)
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ACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTC(360)
CAGCTGGAGAAGGGTGACCGACTCAGCGCTGAGATCAATCGGCCCGACTATCTCGACTTT(420)
GCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGCCTTCCTGGTTCCGCGTGGATCCATG(480)
BamHI
GTGCTGCTTCCGGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAA(540)
GGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCC(600)
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CAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAA(660)
AAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAAT(720)
CCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTAACTGCAG(777)
pstI
3 讨论
TNF-α可有效地杀伤并抑制肿瘤细胞，但不能阻断肿瘤新生血管给肿瘤供给营养；而hPgnK5蛋白虽可抑制肿瘤血管生长，进而使肿瘤体积消退，却不能根除肿瘤细胞。因此，我们将nhTNF-α与hPgnK5基因构建在一起，希望能够得到既有杀伤肿瘤细胞又可抑制肿瘤新生血管的融合蛋白。已有工作表明，单纯克隆与表达K5蛋白均有困难。Cao〔2〕和Lu〔5〕有关K5蛋白的工作是用鼠源性的带6个His的K5蛋白进行的，而Ji〔6〕的工作是首先表达K4-K5蛋白，再经弹性酶切割获得K5蛋白而完成的。我们在获得K5基因后，进行蛋白单独表达的尝试也证明了这点。因此，我们在nhTNF-α与hPgnK5基因之间，引入凝血酶作用位点的编码序列，希望在获得双功能蛋白的同时，通过凝血酶的切割，获得单独的K5蛋白，以更好地研究其功能。■
, http://www.100md.com
作者简介： 范彬，男，34岁，讲师，博士生西安市长乐西路17号 ，Tel.(029)3374774-404
参考文献:
〔1〕 杨 辉 ， 张 英 起 ， 李 芳 梅 , 等 . 大 肠 杆 菌 表 达 人 新 型 肿 瘤 坏 死 因 子 的 纯 化 〔J〕 . 第 四 军 医 大 学 学 报 , 1997; 18(3): 221 224.
〔2〕 Cao Y, Chen A, An SS, et al. Kringle 5 of plasminogen is a novel inhibitor of endothelial cell growth〔J〕 . J Biol Chem, 1997; 272 (36): 22924 22928.
〔3〕 范 彬 , 颜 真 , 张 英 起 , 等 . 人 纤 溶 酶 原 饼 环 区 5基 因 的 化 学 合 成 与 原 核 载 体 的 构 建 〔J〕 . 第 四 军 医 大 学 学 报 , 2000; 21(2): 248 249.
, http://www.100md.com
〔4〕 J. 萨 姆 布 鲁 克 ， EF.弗 里 奇 ， T.曼 尼 阿 蒂 斯 (侯 云 德 译 ).分 子 克 隆 实 验 指 南 〔M〕 . 第 2版 .北 京 ： 科 学 出 版 社 ， 1992： 19 59.
〔5〕 Lu H, Dhanabal M, Volk R, et al. Kringle 5 causes cell cycle arrest and apoptosis of endothelial cells〔J〕 . Biochem Biophys Res Commun, 1999; 258(3):668 673.
〔6〕 Ji WR, Barrientos LG, Llinas M, et al. Selective inhibiton by kringle 5 of human plasminogen on endothlial cell migration, an important process in angiogenesi
〔J〕 . Biochem Biophys Res Commun, 1998;247(2):414 419.
收稿日期：1999-12-28
修回日期：2000-01-25, 百拇医药