PCR-RFLP鉴别念珠菌、曲霉和隐球菌的探讨
作者：秦振宇 吴绍熙 吕桂霞 RoyL.Hopfer 张宏 郭宁如
单位：秦振宇 吴绍熙 吕桂霞(中国医学科学院、中国协和医科大学皮肤病研究所，南京市，210042)；RoyL.Hopfer( UNC Hospitals, Universoty of North Carolina， USA)；张宏(暨南大学医学院第一附属医院皮肤科)郭宁如(中国医学科学院、中国协和医科大学皮肤病研究所，南京市，210042)
关键词：聚合酶链反应；限制性片段；长度多态；念珠菌；曲霉；隐球菌
临床皮肤科杂志000204
摘要 为快速鉴别3类医学上重要真菌——念珠菌、曲霉和隐 球菌，应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态(PCR-RFLP)的分 子生物学方法对白念珠菌、克柔念珠菌、季也蒙念珠菌、近 平滑念珠菌、热带念珠菌、乳酒念珠菌、新生隐球菌格梯变种 、新生隐球菌新生变种、罗伦隐球菌、烟曲霉、黄曲霉和杂 色曲霉进行体外研究。经PCR念珠菌、曲霉和隐球菌均扩增出31 0bp的DNA片段，再行限制性内切酶HaeIII消化后分别呈现2条、4条 和3条片段。本实验建立的PCR-RFLP技术鉴别念珠菌、曲霉和隐 球菌感染，具有快速和特异的特点，是对PCR诊断的重要补充， 有潜在的临床应用价值。
, 百拇医药
Identification of Candida, Aspergillus and Cryptococcus by using PCR- RFLP
Qin Zhenyu, Wu Shaoxi,Lu Guixia,Roy L. Hopfer, Zhang Hong,Guo Ningru
(Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Nanjing,210042)
Abstract The purpose of this study is to establish a sensitive and speedy technique to identify three medically important fungal species, Candida, Aspergillus and Cryptococcus. Twelve fungal species, including Candida albicans,Candida krusei ,Candida guilliermondii, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Candida kefyr, Cryptococcus neoformans var. gattii, Cryptococcus neoformans var. neoformans, Cryptococcus laurentii, Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus and Aspergillus versicolor were identified by using polymerase chain reaction(PCR)- restriction fragment length polymorphism(RFLP) in vitro. Amplicons were produced in all species. After the amplicons were digested by HaeIII, two fragments was made in Candida species, four in Aspergillus species, three in cryptococcus species. Collectively, the PCR- RFLP is a sensitive, specific, and fast method for detection of the medically important fungi.
, http://www.100md.com
Key words Polymerase chain reaction(PCR) Restriction fragment length polymorphism(RFLP) Candida Aspergillus Cryptococcous
医院内感染是住院患者的重要并发症。其中真菌感染的发 病率虽尚低于细菌感染，而居第二位，但死亡率更高，因此早 期诊断治疗十分重要。一个理想的深部真菌诊断方案除应能 达到快速、敏感性高及特异性强要求外，还应能区别菌属。因 为不同菌属的真菌感染用药存在差别，如念珠菌感染应首先 考虑氟康唑，而曲霉感染以两性霉素B(脂质体)治疗为主。因此 ，我们在设计的真菌特异性通用引物聚合酶链反应(PCR)系统的 基础上[1]，进一步建立PCR-限制性内切酶长度多态性(RFLP)以 鉴别3种常见的致病性真菌(念珠菌、曲霉和隐球菌)感染。现报 告如下。
1材料与方法
, http://www.100md.com
1.1菌种：菌种未注明来源者均由中国微生物菌种保藏理委 员会医学真菌中心(CCCCMID)提供。白念珠菌3株(其中两株分别由 美国Duke大学及Iowa大学惠赠)，克柔念珠菌(J931312)、季也蒙念珠 菌(J941267)、近平滑念珠菌(B66126)、热带念珠菌(CDC44)和乳酒念 珠菌(B46120)各1株(均由比利时医学真菌中心惠赠)，新生隐球菌 格梯变种(NIH18，血清型C)、新生隐球菌新生变种(NIH52，血清型 D)、罗伦隐球菌、烟曲霉和杂色曲霉各1株。
1.2菌液制备：从沙氏培养基上取单个菌落，转种入5mL的酵 母提取液中。24小时(酵母菌)或72小时(曲霉)振荡培养，离心弃 上清后加0.5mL山梨醇缓冲液[0.9M山梨醇，0.1MTris·Cl(pH8.0),0.1ME DTA]，混匀后-20℃保存。
1.3真菌DNA提取：采用酶解破壁法。简要如下，解冻后加入5 0μL0.28M2-巯基乙醇(AMRESCO)和6U消解酶(Lyticase,Sigma)，混匀后 37℃孵育1小时。离心弃上清加0.5mLTris/EDTA液[50mMTrisCl(pH8.0)， 20mMEDTA],混匀后再加入50μL10%SDS,65℃孵育20分钟。加200μL5 M醋酸钾后置冰上1小时。酚/氯仿/异戊醇抽提后，加2倍体积无 水乙醇并离心，弃去上清后干燥。加300μL含0.05mgRNA酶的TE缓冲液，37℃孵育1小时。-20℃保存。
, 百拇医药
1.4热启动PCR：反应体系中总体积50μL。其中含dNTPs(SABC)各20 0μmol/L、MgCl21mmol/L、引物(由UNCHospitals合成)各0.2pmol/mL、10×P CR缓冲液(Promega)5μL、TaqDNA聚合酶(Promega)1.5u、模板DNA1μL。 使用我们合成的一对引物(NS5和NS6)，扩增真菌18SrDNA上的一段3 10bp的保守片段，NS5AACTTAAAGGAATTGACGGAAG；NS6GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC 。将除TaqDNA聚合酶以外的其它成分充分混匀，在基因扩增仪2 400(PerkinElmer)上加热至80℃时加入TaqDNA聚合酶，按以下条件扩 增：94℃充分变性6分钟后，以94℃1min、58℃2min、72℃3min。循环 30次后，72℃充分延伸10分钟。取10μL水相扩增产物作2%琼脂 糖凝胶电泳、溴化乙锭染色，中波透射式紫外线观察、照相。 分子量标志(SABC)采用pBR322为底物，6种内切酶消化产物，参照 物片段分别为1，543bp、994bp、695bp、515bp、377bp和237bp。
, http://www.100md.com
1.5RFLP：经对GeneBank检索，念珠菌、隐球菌和曲霉扩增产物 的序列有所不同，其中分别存在1个、2个和3个限制性内切酶Ha eIII的酶切位点。取5μLPCR扩增产物、13μL灭菌水和2μL10×限 制性内切酶缓冲液(SABC混合后，加入10UHaeIII(SABC)，37℃孵育1 小时，再加入1μL0.5MEDTA终止反应。
1.6聚丙烯酰胺凝胶电泳：凝胶面积约为40cm×20cm，厚度为0. 5mm。30%丙烯酰胺[丙烯酰胺(SABC)29g，N，N’-亚甲双丙烯酰胺 (Serva)1g，加水至100mL]40mL、水39.3mL、5×TBE20mL、10%过硫酸铵( AMRESCO)0.7mL及35mLTEMED(AMRESCO)配制12%聚丙烯酰胺凝胶。将酶切 产物与6×上样缓冲液(0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液)混合，加 入聚丙烯酰胺凝胶中，300V电泳5小时后，在含0.5μg/mL溴化乙 锭的1×TB缓冲液中染色1小时。中波透射式紫外线观察、照相 。
, 百拇医药
1.7体外实验：选择热带念珠菌和新生隐球菌格梯变种，用 生理盐水将其浓度用血细胞计数器调整为5，10，2×10，2×102 ，2×103和2×105。采集正常人血，WBC5.4×109/L，RBC3.84×1012， 中性粒细胞占0.64，淋巴细胞占0.35，嗜酸性粒细胞占0.01。将等 量菌液和血混合。红细胞和血细胞裂解通过加含0.05%蛋白酶 K和0.05%吐温20的TE缓冲液至菌血。再加入2.5mg/mLDNA酶，混匀后 37℃孵育15分钟。随后离心收集真菌孢子，进一步基本按实验 步骤1.3～1.6。
1.8图像分析采用1D软件(SELEquipmentCo.Ltd)对图像进行分析。
2结果
2.1PCR结果：11种14株常见致病真菌均扩增出310bp的特异性片 段(见图1)。
, 百拇医药
2.2PCR-RFLP结果：念珠菌、曲霉和隐球菌扩增产物的聚丙烯 酰胺凝胶电泳，分别存在1个、3个和2个特异性酶切位点，片段 大小符合预测的结果(见图2)。
2.3体外实验结果：血中感染模型中，部分最低可检测出10～ 200CFU菌体(见图3)。在我们的研究中，未见血对PCR-RFLP结果产 生影响。
3" height="110" alt="t7701.gif (977 bytes)">
图1部分致病真菌PCR扩增结果：M为分子量标志(SABC)
采用pBR322为底物，6种内切酶消化产物，参照物片
段分别为1，543bp、994bp、695bp、515bp、377bp和237
, 百拇医药
bp。1为烟曲霉；2为季也蒙念珠菌；3为乳酒念珠菌； 4
为新生隐球菌格梯变种；5为克柔念珠菌；6为黄曲霉 ；
7为白念珠菌
图2部分念珠菌、曲霉和隐球菌扩增产物HaeⅢ酶切后的
聚丙烯酰胺凝胶电泳结果M为Pgem-3Zf/HaeⅢ分子
量标志(SABC)参照物片段分别为587bp、458bp、434
bp、323bp、314bp、289bp、267bp、174bp、142bp、102bp、80bpt和11bp。1为白念珠菌扩增产物；2为黄曲霉；
, http://www.100md.com
3为新生隐球菌格梯变种；4为乳酒念珠菌；5为白念珠
菌，2～5为酶切产物
图3热带念珠菌体外PCR敏感性实验结果，M为分子量标
(SABC)同图2。1～6分别为5，10，2×10，2×102，2×103和2×105CFU
3讨论
基因诊断被公认为实验诊断发展方向。有专家认为，实验 诊断经历了生化诊断、免疫诊断的发展阶段，正进入基因诊断 的新时代。前两者是根据表型诊断疾病，后者从本质上认识 疾病。在我国，PCR技术介入医学检验领域已近10年，最近，美 国FDA已批准HIV，衣原体和结核杆菌的PCR诊断试剂盒用于临床。 真菌通用PCR诊断也同样存在临床应用前景。
, http://www.100md.com
我们以前设计的真菌特异性通用引物PCR系统可用于检测23 种致病性真菌，但对细菌、支原体、螺旋体及放线菌等均未能 扩增。在此基础上，我们进一步建立PCR-RFLP，可以用于鉴别 3种常见的致病性真菌(念珠菌、曲霉和隐球菌)感染，以期能达 到指导临床诊断和早期治疗的目的。这种方法也曾用于不同 念珠菌间的鉴别[2]。在临床病例评价前，我们设计体外血感染 实验初步评价本方法的敏感性以及血中是否存在对实验结果 产生影响的抑制因素。除RFLP外，特异探针杂交[3]、单链构象 多态[4]和多重PCR被用于进一步鉴定至属甚至种的水平，以指导 临床治疗。
真菌污染是临床应用PCR的主要障碍，污染来自于在提取DNA 过程中的气生孢子和试管中所携带的孢子，因为尽管高压消毒 仍有死的孢子残留于试管上。为了最大地降低重复使用试管 的污染，我们选择了酶解法提取DNA。β-1,3-葡聚糖酶水解真 菌中β-1,3-葡聚糖连接链中的葡萄糖多聚体，形成原生质 ，通过细胞壁部分缺失，增加对渗透压的敏感性。在70年代， 出现了较为原始的裂解真菌细胞壁的蜗牛酶，但不同批号间活 性变异很大。目前使用的β-1,3-葡聚糖酶产品包括Zymolyase( 自然状态)和Lyticase(合成的β-1,3-葡聚糖酶等同物)。Lyticase 可避免Zymolyase中不纯物质如蛋白酶、甘露糖酶、淀粉酶、木糖 酶、磷酸酶和微量的DNA酶。所以本实验中采用Lyticase。我们建 立PCR-RFLP鉴别3类重要的致病性真菌的方法在体外实验中获得 较好结果。而进一步研究当简化步骤使之更适用于临床。
, 百拇医药
参考文献
1，张宏，吴绍熙，郭宁如，等.真菌特异性通用引物的聚合 酶链反应系统的实验与临床研究.中华皮肤科杂志，1998，34(5) ：282～284
2，Morace G, Sanguinetti M, Posteraro B, et al. Identification of various medically important Candida species in clinical specimens by PCR- restriction enzyme analysis. J Clin Microbiol, 1997, 35(3):667～ 672
3，Fujita S, Lasker BA, Lott TJ, et al. Microtitration plate enzyme immunoassay to detect PCR- amplified DNA from Candida species in blood. J Clin Microbiol, 1995,33(4):962～ 967
4，Walsh TJ, Francesconi A, Kasai M, et al. PCR and single- strand conformational polymorphism for recognition of medically important opportunistic fungi. J Clin Microbiol, 1995,33(12):3216～ 3220
(收稿：1999-06-18修回：1999-09-07), 百拇医药
单位：秦振宇 吴绍熙 吕桂霞(中国医学科学院、中国协和医科大学皮肤病研究所，南京市，210042)；RoyL.Hopfer( UNC Hospitals, Universoty of North Carolina， USA)；张宏(暨南大学医学院第一附属医院皮肤科)郭宁如(中国医学科学院、中国协和医科大学皮肤病研究所，南京市，210042)
关键词：聚合酶链反应；限制性片段；长度多态；念珠菌；曲霉；隐球菌
临床皮肤科杂志000204
摘要 为快速鉴别3类医学上重要真菌——念珠菌、曲霉和隐 球菌，应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态(PCR-RFLP)的分 子生物学方法对白念珠菌、克柔念珠菌、季也蒙念珠菌、近 平滑念珠菌、热带念珠菌、乳酒念珠菌、新生隐球菌格梯变种 、新生隐球菌新生变种、罗伦隐球菌、烟曲霉、黄曲霉和杂 色曲霉进行体外研究。经PCR念珠菌、曲霉和隐球菌均扩增出31 0bp的DNA片段，再行限制性内切酶HaeIII消化后分别呈现2条、4条 和3条片段。本实验建立的PCR-RFLP技术鉴别念珠菌、曲霉和隐 球菌感染，具有快速和特异的特点，是对PCR诊断的重要补充， 有潜在的临床应用价值。
, 百拇医药
Identification of Candida, Aspergillus and Cryptococcus by using PCR- RFLP
Qin Zhenyu, Wu Shaoxi,Lu Guixia,Roy L. Hopfer, Zhang Hong,Guo Ningru
(Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Nanjing,210042)
Abstract The purpose of this study is to establish a sensitive and speedy technique to identify three medically important fungal species, Candida, Aspergillus and Cryptococcus. Twelve fungal species, including Candida albicans,Candida krusei ,Candida guilliermondii, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Candida kefyr, Cryptococcus neoformans var. gattii, Cryptococcus neoformans var. neoformans, Cryptococcus laurentii, Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus and Aspergillus versicolor were identified by using polymerase chain reaction(PCR)- restriction fragment length polymorphism(RFLP) in vitro. Amplicons were produced in all species. After the amplicons were digested by HaeIII, two fragments was made in Candida species, four in Aspergillus species, three in cryptococcus species. Collectively, the PCR- RFLP is a sensitive, specific, and fast method for detection of the medically important fungi.
, http://www.100md.com
Key words Polymerase chain reaction(PCR) Restriction fragment length polymorphism(RFLP) Candida Aspergillus Cryptococcous
医院内感染是住院患者的重要并发症。其中真菌感染的发 病率虽尚低于细菌感染，而居第二位，但死亡率更高，因此早 期诊断治疗十分重要。一个理想的深部真菌诊断方案除应能 达到快速、敏感性高及特异性强要求外，还应能区别菌属。因 为不同菌属的真菌感染用药存在差别，如念珠菌感染应首先 考虑氟康唑，而曲霉感染以两性霉素B(脂质体)治疗为主。因此 ，我们在设计的真菌特异性通用引物聚合酶链反应(PCR)系统的 基础上[1]，进一步建立PCR-限制性内切酶长度多态性(RFLP)以 鉴别3种常见的致病性真菌(念珠菌、曲霉和隐球菌)感染。现报 告如下。
1材料与方法
, http://www.100md.com
1.1菌种：菌种未注明来源者均由中国微生物菌种保藏理委 员会医学真菌中心(CCCCMID)提供。白念珠菌3株(其中两株分别由 美国Duke大学及Iowa大学惠赠)，克柔念珠菌(J931312)、季也蒙念珠 菌(J941267)、近平滑念珠菌(B66126)、热带念珠菌(CDC44)和乳酒念 珠菌(B46120)各1株(均由比利时医学真菌中心惠赠)，新生隐球菌 格梯变种(NIH18，血清型C)、新生隐球菌新生变种(NIH52，血清型 D)、罗伦隐球菌、烟曲霉和杂色曲霉各1株。
1.2菌液制备：从沙氏培养基上取单个菌落，转种入5mL的酵 母提取液中。24小时(酵母菌)或72小时(曲霉)振荡培养，离心弃 上清后加0.5mL山梨醇缓冲液[0.9M山梨醇，0.1MTris·Cl(pH8.0),0.1ME DTA]，混匀后-20℃保存。
1.3真菌DNA提取：采用酶解破壁法。简要如下，解冻后加入5 0μL0.28M2-巯基乙醇(AMRESCO)和6U消解酶(Lyticase,Sigma)，混匀后 37℃孵育1小时。离心弃上清加0.5mLTris/EDTA液[50mMTrisCl(pH8.0)， 20mMEDTA],混匀后再加入50μL10%SDS,65℃孵育20分钟。加200μL5 M醋酸钾后置冰上1小时。酚/氯仿/异戊醇抽提后，加2倍体积无 水乙醇并离心，弃去上清后干燥。加300μL含0.05mgRNA酶的TE缓冲液，37℃孵育1小时。-20℃保存。
, 百拇医药
1.4热启动PCR：反应体系中总体积50μL。其中含dNTPs(SABC)各20 0μmol/L、MgCl21mmol/L、引物(由UNCHospitals合成)各0.2pmol/mL、10×P CR缓冲液(Promega)5μL、TaqDNA聚合酶(Promega)1.5u、模板DNA1μL。 使用我们合成的一对引物(NS5和NS6)，扩增真菌18SrDNA上的一段3 10bp的保守片段，NS5AACTTAAAGGAATTGACGGAAG；NS6GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC 。将除TaqDNA聚合酶以外的其它成分充分混匀，在基因扩增仪2 400(PerkinElmer)上加热至80℃时加入TaqDNA聚合酶，按以下条件扩 增：94℃充分变性6分钟后，以94℃1min、58℃2min、72℃3min。循环 30次后，72℃充分延伸10分钟。取10μL水相扩增产物作2%琼脂 糖凝胶电泳、溴化乙锭染色，中波透射式紫外线观察、照相。 分子量标志(SABC)采用pBR322为底物，6种内切酶消化产物，参照 物片段分别为1，543bp、994bp、695bp、515bp、377bp和237bp。
, http://www.100md.com
1.5RFLP：经对GeneBank检索，念珠菌、隐球菌和曲霉扩增产物 的序列有所不同，其中分别存在1个、2个和3个限制性内切酶Ha eIII的酶切位点。取5μLPCR扩增产物、13μL灭菌水和2μL10×限 制性内切酶缓冲液(SABC混合后，加入10UHaeIII(SABC)，37℃孵育1 小时，再加入1μL0.5MEDTA终止反应。
1.6聚丙烯酰胺凝胶电泳：凝胶面积约为40cm×20cm，厚度为0. 5mm。30%丙烯酰胺[丙烯酰胺(SABC)29g，N，N’-亚甲双丙烯酰胺 (Serva)1g，加水至100mL]40mL、水39.3mL、5×TBE20mL、10%过硫酸铵( AMRESCO)0.7mL及35mLTEMED(AMRESCO)配制12%聚丙烯酰胺凝胶。将酶切 产物与6×上样缓冲液(0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液)混合，加 入聚丙烯酰胺凝胶中，300V电泳5小时后，在含0.5μg/mL溴化乙 锭的1×TB缓冲液中染色1小时。中波透射式紫外线观察、照相 。
, 百拇医药
1.7体外实验：选择热带念珠菌和新生隐球菌格梯变种，用 生理盐水将其浓度用血细胞计数器调整为5，10，2×10，2×102 ，2×103和2×105。采集正常人血，WBC5.4×109/L，RBC3.84×1012， 中性粒细胞占0.64，淋巴细胞占0.35，嗜酸性粒细胞占0.01。将等 量菌液和血混合。红细胞和血细胞裂解通过加含0.05%蛋白酶 K和0.05%吐温20的TE缓冲液至菌血。再加入2.5mg/mLDNA酶，混匀后 37℃孵育15分钟。随后离心收集真菌孢子，进一步基本按实验 步骤1.3～1.6。
1.8图像分析采用1D软件(SELEquipmentCo.Ltd)对图像进行分析。
2结果
2.1PCR结果：11种14株常见致病真菌均扩增出310bp的特异性片 段(见图1)。
, 百拇医药
2.2PCR-RFLP结果：念珠菌、曲霉和隐球菌扩增产物的聚丙烯 酰胺凝胶电泳，分别存在1个、3个和2个特异性酶切位点，片段 大小符合预测的结果(见图2)。
2.3体外实验结果：血中感染模型中，部分最低可检测出10～ 200CFU菌体(见图3)。在我们的研究中，未见血对PCR-RFLP结果产 生影响。
3" height="110" alt="t7701.gif (977 bytes)">图1部分致病真菌PCR扩增结果：M为分子量标志(SABC)
采用pBR322为底物，6种内切酶消化产物，参照物片
段分别为1，543bp、994bp、695bp、515bp、377bp和237
, 百拇医药
bp。1为烟曲霉；2为季也蒙念珠菌；3为乳酒念珠菌； 4
为新生隐球菌格梯变种；5为克柔念珠菌；6为黄曲霉 ；
7为白念珠菌
图2部分念珠菌、曲霉和隐球菌扩增产物HaeⅢ酶切后的
聚丙烯酰胺凝胶电泳结果M为Pgem-3Zf/HaeⅢ分子
量标志(SABC)参照物片段分别为587bp、458bp、434
bp、323bp、314bp、289bp、267bp、174bp、142bp、102bp、80bpt和11bp。1为白念珠菌扩增产物；2为黄曲霉；
, http://www.100md.com
3为新生隐球菌格梯变种；4为乳酒念珠菌；5为白念珠
菌，2～5为酶切产物
图3热带念珠菌体外PCR敏感性实验结果，M为分子量标
(SABC)同图2。1～6分别为5，10，2×10，2×102，2×103和2×105CFU
3讨论
基因诊断被公认为实验诊断发展方向。有专家认为，实验 诊断经历了生化诊断、免疫诊断的发展阶段，正进入基因诊断 的新时代。前两者是根据表型诊断疾病，后者从本质上认识 疾病。在我国，PCR技术介入医学检验领域已近10年，最近，美 国FDA已批准HIV，衣原体和结核杆菌的PCR诊断试剂盒用于临床。 真菌通用PCR诊断也同样存在临床应用前景。
, http://www.100md.com
我们以前设计的真菌特异性通用引物PCR系统可用于检测23 种致病性真菌，但对细菌、支原体、螺旋体及放线菌等均未能 扩增。在此基础上，我们进一步建立PCR-RFLP，可以用于鉴别 3种常见的致病性真菌(念珠菌、曲霉和隐球菌)感染，以期能达 到指导临床诊断和早期治疗的目的。这种方法也曾用于不同 念珠菌间的鉴别[2]。在临床病例评价前，我们设计体外血感染 实验初步评价本方法的敏感性以及血中是否存在对实验结果 产生影响的抑制因素。除RFLP外，特异探针杂交[3]、单链构象 多态[4]和多重PCR被用于进一步鉴定至属甚至种的水平，以指导 临床治疗。
真菌污染是临床应用PCR的主要障碍，污染来自于在提取DNA 过程中的气生孢子和试管中所携带的孢子，因为尽管高压消毒 仍有死的孢子残留于试管上。为了最大地降低重复使用试管 的污染，我们选择了酶解法提取DNA。β-1,3-葡聚糖酶水解真 菌中β-1,3-葡聚糖连接链中的葡萄糖多聚体，形成原生质 ，通过细胞壁部分缺失，增加对渗透压的敏感性。在70年代， 出现了较为原始的裂解真菌细胞壁的蜗牛酶，但不同批号间活 性变异很大。目前使用的β-1,3-葡聚糖酶产品包括Zymolyase( 自然状态)和Lyticase(合成的β-1,3-葡聚糖酶等同物)。Lyticase 可避免Zymolyase中不纯物质如蛋白酶、甘露糖酶、淀粉酶、木糖 酶、磷酸酶和微量的DNA酶。所以本实验中采用Lyticase。我们建 立PCR-RFLP鉴别3类重要的致病性真菌的方法在体外实验中获得 较好结果。而进一步研究当简化步骤使之更适用于临床。
, 百拇医药
参考文献
1，张宏，吴绍熙，郭宁如，等.真菌特异性通用引物的聚合 酶链反应系统的实验与临床研究.中华皮肤科杂志，1998，34(5) ：282～284
2，Morace G, Sanguinetti M, Posteraro B, et al. Identification of various medically important Candida species in clinical specimens by PCR- restriction enzyme analysis. J Clin Microbiol, 1997, 35(3):667～ 672
3，Fujita S, Lasker BA, Lott TJ, et al. Microtitration plate enzyme immunoassay to detect PCR- amplified DNA from Candida species in blood. J Clin Microbiol, 1995,33(4):962～ 967
4，Walsh TJ, Francesconi A, Kasai M, et al. PCR and single- strand conformational polymorphism for recognition of medically important opportunistic fungi. J Clin Microbiol, 1995,33(12):3216～ 3220
(收稿：1999-06-18修回：1999-09-07), 百拇医药