PCR-RFLP技术DLA-DRB1基因分型在狗卵巢移植配型中的应用
作者：韦相才 欧汝强 王一峰 姜彦嘉 杨日普 俞水仙 张晨芳 黄最 吕孟孟
单位：韦相才 欧汝强 王一峰 姜彦嘉(广东省计划生育科学技术研究所 510600)；杨日普 俞水仙 张晨芳 黄最 吕孟孟(广州军区广州总医院 510010)
关键词：聚合酶链反应；限制性片段长度多态性 DLA-DRB1；基因分型；卵巢移植；狗
广东医学000210 【摘要】 目的 探讨狗组织相容性系统(DLA)-DRB1基因分型方法及用于狗卵巢移植配型的可行性。方法 选择特定的引物和6种限制性内切酶，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction based on restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)技术建立了DLA-DRB1基因分型的方法。用PCR方法对6只无亲缘相关的个体纯种比格狗DRB1基因扩增，通过选用HaeⅢ，HinfⅠ,MspⅠ,HhaⅠ，Sau96Ⅰ及RsaⅠ等6种限制性内切酶对该片段进行酶切分析。结果 酶切图谱显示出DLA-DRB1基因具有高度多态性。应用于3对卵巢移植狗的基因配型获得成功。结论 研究表明，该方法在狗器官移植配型中有较好的实用价值。
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Application of PCR-RFLP method in DLA-DRB1 gene-typing in dog ovary transplantation
Wei Xiangcai, Ou Ruqiang, Wang Yifeng
(Guangdong Family Planning Research Institute, Guangzhou 510600)
【Abstract】 Objective To study the application of DLA-DRB1 gene-typing technique of polymerase chain reaction based restricion fragment length polymorphism (PCR-RFLP) in dog ovary transplantation. Methods An appropriate primer pair and six kinds of restriction endonuclease were selected to analyze six unrelated beagle dogs.Results The results of Hae Ⅲ and Hinf Ⅰ digestion showed DRB1 gene had high polymorphism. This method was used in gene-typing of ovary transplantation in three pair of beagle dogs and was successful.Conclusion DLA-DRB1 gene-typing technique provides a simple, rapid and promising method in dog organ transplantation.
, 百拇医药
【Key words】 Polymerase chain reaction Restriction fragment length polymorphism DLA-DRB1 Gene-typing Ovary transplantation Dog
狗作为移植生物学的研究动物模型已经应用于多种器官的移植研究中，用狗作卵巢移植的模型更具有实际意义。狗供受体间组织配型主要通过血清学分型、细胞学分型(混合细胞培养)、生物化学分析及Southern blot印迹转移技术来确定其组织相容性。对狗白细胞抗原(DLA)系统Ⅱ类抗原基因分型报道甚少，贺永文等[1]采用PCR-RFLP技术分析了血清型和细胞型确定的8只不同DLA单倍体的纯合子狗，显示出该技术在DRB1基因中的分型价值。本文研究在此基础上探讨了无亲缘相关个体纯种狗DRB1基因高度多态性，并试用于狗卵巢移植配型。现报道如下。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 实验动物 所有狗系纯种比格狗，购于第一军医大学实验动物中心，属二级实验动物。取狗脚部静脉血2 ml用于抽提DNA。
1.2 实验方法
1.2.1 引物及PCR反应 所采用的引物参考贺永文等[1]的设计，扩增片段长度为274 bp，由上海生工公司
本课题为广东省科委重点攻关课题基金资助(编号：9622050-05)
合成。引物序列如下，引物P1：5′-CACAGCACGTTTCTTG-3′；引物P2：5′-CCGCTGCACTGTGAAGCTCT-3′。PCR反应在0.5 ml离心管中加入50 μl体积的反应体系，其中包括反应缓冲液(50 μmol KCl, 25 μmol MgCl2)，质量浓度为0.01 g/L的明胶，以及dNTP 0.2 μmol，引物各21 pmol,DNA 0.01 μg，Tag DNA聚合酶2.5 u(加拿大Sagon公司生产)。反应在PCR仪(美国Perkin-Elmer公司生产T/C1型)进行，加酶前预变性94℃ 5 min,55℃1 min时加酶，延伸72℃ 2 min。循环次数35个，循环参数如下：94℃ 1 min, 55℃ 1 min, 72 ℃ 2 min,最后一个循环延伸72℃ 7 min。
, 百拇医药
1.2.2 RELP分析 根据贺永文等[1]所选用的6种限制性内切酶，包括HaeⅢ，HinfⅠ,MspⅠ,HhaⅠ，Sau96Ⅰ及RsaⅠ等(德国Boehringer Mannheim公司产品)。各种酶在PCR产物中的酶切位点及所形成的RFLP带型，见表1。
取16 μl PCR产物(约0.02 μg)加内切酶2 μl(20 u)及2 μl相应的反应缓冲液(总体积20 μl)于37℃水浴中消化3 h。酶切产物用160 g/L聚丙烯酰胺凝胶(40×20)于260 V ， 48 mA电泳4 h，用银染色后观察结果。
表1 6种限制性内切酶的酶切位点及PCR产物酶切带型 酶类
识别序列
位点数
RFLP带形
, 百拇医药
HaeⅢ
GGCC
3
7
HinfⅠ
GANTC
1
5
MspⅠ
CCGG
4
6
HhaⅠ
, 百拇医药 GCGC
1
7
Sau96Ⅰ
GTAC
3
6
RsaⅠ
GGNCC
4
7
2 结果
2.1 6只无亲缘相关个体狗酶切图谱 用MspⅠ, HhaⅠ,Sau96Ⅰ及RsaⅠ等4种限制性内切酶酶切所得的图谱获相同的图谱，而Hinf Ⅰ，HaeⅢ酶切所得的图谱存在带型的显著差异，具有高度的多态性。
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2.2 3对卵巢移植狗PCR-RFLP基因配型结果 3对狗用HinfⅠ酶切所得配型图谱：供体1与受体1所得片段为140，106 Bp；供体2与受体2所得片段为170，110 Bp;供体3与受体3所得片段为160，110 Bp。3对卵巢移植成功狗基因配型结果见表2。
表2 3对卵巢移植成功狗基因配型结果 内切酶
带型
HhaⅠ
HinfⅠ
HaeⅢ
RsaⅠ
171
103
, http://www.100md.com 170
160
140
110
106
252
206
170
140
100
30
140
106
, 百拇医药 99
86
76
50
30
供体1
+
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受体2
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供体2
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供体3
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受体3
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, 百拇医药
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+
+
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+
3 讨论
PCR-RFLP技术已成功地应用于人类HLA基因分型及人类DNA多态性分析[2]，而在狗DLA基因分型中的报道甚少，原因之一是目前对DLAⅡ类抗原基因的结构和多态性研究不多。尽管Sarimento[3]的研究提示DLA-DRB1基因显示多态性，目前只有贺永文应用了PCR-RFLP分析了血清学和细胞学确定的DLA-DRB1基因单倍体纯合体，通过8个不同DLA单倍体纯合子参考狗和2个犬家族的分析，显示出DRB1基因的多态性，并与所研究的DLA单倍体和8个细胞学确定的DLA-D特异性相关，证实了该分型系统的价值。本研究应用于无亲缘相关的个体狗的DRB1基因研究，提示本组狗的DLA-Ⅱ类DRB1基因亦存在高度的多态性，表明该组无亲缘相关个体狗间的多态性，获得与贺永文一致的结论。
, 百拇医药
本方法用于3对狗卵巢移植配型获得成功，从而证实了该分型方法在无关个体同种狗可行性和实际应用价值。由于所选择的6种内切酶中某些内切酶显示出异源双链带型[4]，对于狗杂合子的分型极有帮助。由于对狗DLA-Ⅱ类抗原基因的认识甚少，因此，在基因分型上采用PCR-ASO，PCR-SSP， PCR-SSCP等有一定的困难方法，而这类方法在人类HLA分型及移植配型中有广泛的应用。采用PCR-RFLP分型技术尽管在技术上有一定的先进性，但对于DRB1基因，特别是杂合体情况下的分型酶切图谱的复杂性及可重复性尚不能得到高分辨的分型结果，同时，对于某些杂合子狗尚难于分辨，对此需通过设计引物时引入等位基因特异酶切位点[5]，亦可通过结合较为先进的技术如PCR-ASO，SSP方法得以完善。本研究3对移植后的卵巢发育情况良好的结果表明，在目前血清学及细胞学方法分型有一定困难时，特别对血清学相同，不同动物等位基因之间的DNA序列的差异[6]，PCR-RFLP方法能检出。证实该技术对DLA-DRB1基因分型是一种有效的具有实用价值的分型方法。
, 百拇医药
参考文献
1，贺永文，Ferencik S, Grosse Wilde H，等.用PCR-RFLP分析血清学和细胞学确定的DLA-DRB1基因单倍型及其分离. 中国免疫学杂志，1995，11(5)：286
2，Nomura N, Inoko H, Kato S, et al. PCR-RFLP: a new HLA-DNA typing method tested in bone morrow transplantation. Transplantation Proceedings, 1991, 23(1):431
3，Sarimento UM, Sarimento JI， Storb R. Allelic variation in the DR subrigion of the canine major histocompatibility complex. Immunogenetics, 1990, 32:13
, 百拇医药
4，Clay TM, Bidwell J, Howard M, et al. PCR-fingerprinting for selection of HLA matched unrelated marrow donors. Lancet, 1991, 337:1049
5，刘广贤，孔繁华.HLA基因分型的最新进展.国外医学免疫学分册，1996，1：12
6，Anderson L, Sigurdardottir S, Borsch C, et al. Evolution of MHC polymorphism: extensive sharing of polymorphic sequence motifs between human and bovine DRB alleles. Immunogenetics, 1991, 33:188
(收稿日期：1999-11-08), http://www.100md.com
单位：韦相才 欧汝强 王一峰 姜彦嘉(广东省计划生育科学技术研究所 510600)；杨日普 俞水仙 张晨芳 黄最 吕孟孟(广州军区广州总医院 510010)
关键词：聚合酶链反应；限制性片段长度多态性 DLA-DRB1；基因分型；卵巢移植；狗
广东医学000210 【摘要】 目的 探讨狗组织相容性系统(DLA)-DRB1基因分型方法及用于狗卵巢移植配型的可行性。方法 选择特定的引物和6种限制性内切酶，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction based on restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)技术建立了DLA-DRB1基因分型的方法。用PCR方法对6只无亲缘相关的个体纯种比格狗DRB1基因扩增，通过选用HaeⅢ，HinfⅠ,MspⅠ,HhaⅠ，Sau96Ⅰ及RsaⅠ等6种限制性内切酶对该片段进行酶切分析。结果 酶切图谱显示出DLA-DRB1基因具有高度多态性。应用于3对卵巢移植狗的基因配型获得成功。结论 研究表明，该方法在狗器官移植配型中有较好的实用价值。
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Application of PCR-RFLP method in DLA-DRB1 gene-typing in dog ovary transplantation
Wei Xiangcai, Ou Ruqiang, Wang Yifeng
(Guangdong Family Planning Research Institute, Guangzhou 510600)
【Abstract】 Objective To study the application of DLA-DRB1 gene-typing technique of polymerase chain reaction based restricion fragment length polymorphism (PCR-RFLP) in dog ovary transplantation. Methods An appropriate primer pair and six kinds of restriction endonuclease were selected to analyze six unrelated beagle dogs.Results The results of Hae Ⅲ and Hinf Ⅰ digestion showed DRB1 gene had high polymorphism. This method was used in gene-typing of ovary transplantation in three pair of beagle dogs and was successful.Conclusion DLA-DRB1 gene-typing technique provides a simple, rapid and promising method in dog organ transplantation.
, 百拇医药
【Key words】 Polymerase chain reaction Restriction fragment length polymorphism DLA-DRB1 Gene-typing Ovary transplantation Dog
狗作为移植生物学的研究动物模型已经应用于多种器官的移植研究中，用狗作卵巢移植的模型更具有实际意义。狗供受体间组织配型主要通过血清学分型、细胞学分型(混合细胞培养)、生物化学分析及Southern blot印迹转移技术来确定其组织相容性。对狗白细胞抗原(DLA)系统Ⅱ类抗原基因分型报道甚少，贺永文等[1]采用PCR-RFLP技术分析了血清型和细胞型确定的8只不同DLA单倍体的纯合子狗，显示出该技术在DRB1基因中的分型价值。本文研究在此基础上探讨了无亲缘相关个体纯种狗DRB1基因高度多态性，并试用于狗卵巢移植配型。现报道如下。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 实验动物 所有狗系纯种比格狗，购于第一军医大学实验动物中心，属二级实验动物。取狗脚部静脉血2 ml用于抽提DNA。
1.2 实验方法
1.2.1 引物及PCR反应 所采用的引物参考贺永文等[1]的设计，扩增片段长度为274 bp，由上海生工公司
本课题为广东省科委重点攻关课题基金资助(编号：9622050-05)
合成。引物序列如下，引物P1：5′-CACAGCACGTTTCTTG-3′；引物P2：5′-CCGCTGCACTGTGAAGCTCT-3′。PCR反应在0.5 ml离心管中加入50 μl体积的反应体系，其中包括反应缓冲液(50 μmol KCl, 25 μmol MgCl2)，质量浓度为0.01 g/L的明胶，以及dNTP 0.2 μmol，引物各21 pmol,DNA 0.01 μg，Tag DNA聚合酶2.5 u(加拿大Sagon公司生产)。反应在PCR仪(美国Perkin-Elmer公司生产T/C1型)进行，加酶前预变性94℃ 5 min,55℃1 min时加酶，延伸72℃ 2 min。循环次数35个，循环参数如下：94℃ 1 min, 55℃ 1 min, 72 ℃ 2 min,最后一个循环延伸72℃ 7 min。
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1.2.2 RELP分析 根据贺永文等[1]所选用的6种限制性内切酶，包括HaeⅢ，HinfⅠ,MspⅠ,HhaⅠ，Sau96Ⅰ及RsaⅠ等(德国Boehringer Mannheim公司产品)。各种酶在PCR产物中的酶切位点及所形成的RFLP带型，见表1。
取16 μl PCR产物(约0.02 μg)加内切酶2 μl(20 u)及2 μl相应的反应缓冲液(总体积20 μl)于37℃水浴中消化3 h。酶切产物用160 g/L聚丙烯酰胺凝胶(40×20)于260 V ， 48 mA电泳4 h，用银染色后观察结果。
表1 6种限制性内切酶的酶切位点及PCR产物酶切带型 酶类
识别序列
位点数
RFLP带形
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HaeⅢ
GGCC
3
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HinfⅠ
GANTC
1
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MspⅠ
CCGG
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6
HhaⅠ
, 百拇医药 GCGC
1
7
Sau96Ⅰ
GTAC
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GGNCC
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2 结果
2.1 6只无亲缘相关个体狗酶切图谱 用MspⅠ, HhaⅠ,Sau96Ⅰ及RsaⅠ等4种限制性内切酶酶切所得的图谱获相同的图谱，而Hinf Ⅰ，HaeⅢ酶切所得的图谱存在带型的显著差异，具有高度的多态性。
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2.2 3对卵巢移植狗PCR-RFLP基因配型结果 3对狗用HinfⅠ酶切所得配型图谱：供体1与受体1所得片段为140，106 Bp；供体2与受体2所得片段为170，110 Bp;供体3与受体3所得片段为160，110 Bp。3对卵巢移植成功狗基因配型结果见表2。
表2 3对卵巢移植成功狗基因配型结果 内切酶
带型
HhaⅠ
HinfⅠ
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3 讨论
PCR-RFLP技术已成功地应用于人类HLA基因分型及人类DNA多态性分析[2]，而在狗DLA基因分型中的报道甚少，原因之一是目前对DLAⅡ类抗原基因的结构和多态性研究不多。尽管Sarimento[3]的研究提示DLA-DRB1基因显示多态性，目前只有贺永文应用了PCR-RFLP分析了血清学和细胞学确定的DLA-DRB1基因单倍体纯合体，通过8个不同DLA单倍体纯合子参考狗和2个犬家族的分析，显示出DRB1基因的多态性，并与所研究的DLA单倍体和8个细胞学确定的DLA-D特异性相关，证实了该分型系统的价值。本研究应用于无亲缘相关的个体狗的DRB1基因研究，提示本组狗的DLA-Ⅱ类DRB1基因亦存在高度的多态性，表明该组无亲缘相关个体狗间的多态性，获得与贺永文一致的结论。
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本方法用于3对狗卵巢移植配型获得成功，从而证实了该分型方法在无关个体同种狗可行性和实际应用价值。由于所选择的6种内切酶中某些内切酶显示出异源双链带型[4]，对于狗杂合子的分型极有帮助。由于对狗DLA-Ⅱ类抗原基因的认识甚少，因此，在基因分型上采用PCR-ASO，PCR-SSP， PCR-SSCP等有一定的困难方法，而这类方法在人类HLA分型及移植配型中有广泛的应用。采用PCR-RFLP分型技术尽管在技术上有一定的先进性，但对于DRB1基因，特别是杂合体情况下的分型酶切图谱的复杂性及可重复性尚不能得到高分辨的分型结果，同时，对于某些杂合子狗尚难于分辨，对此需通过设计引物时引入等位基因特异酶切位点[5]，亦可通过结合较为先进的技术如PCR-ASO，SSP方法得以完善。本研究3对移植后的卵巢发育情况良好的结果表明，在目前血清学及细胞学方法分型有一定困难时，特别对血清学相同，不同动物等位基因之间的DNA序列的差异[6]，PCR-RFLP方法能检出。证实该技术对DLA-DRB1基因分型是一种有效的具有实用价值的分型方法。
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参考文献
1，贺永文，Ferencik S, Grosse Wilde H，等.用PCR-RFLP分析血清学和细胞学确定的DLA-DRB1基因单倍型及其分离. 中国免疫学杂志，1995，11(5)：286
2，Nomura N, Inoko H, Kato S, et al. PCR-RFLP: a new HLA-DNA typing method tested in bone morrow transplantation. Transplantation Proceedings, 1991, 23(1):431
3，Sarimento UM, Sarimento JI， Storb R. Allelic variation in the DR subrigion of the canine major histocompatibility complex. Immunogenetics, 1990, 32:13
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4，Clay TM, Bidwell J, Howard M, et al. PCR-fingerprinting for selection of HLA matched unrelated marrow donors. Lancet, 1991, 337:1049
5，刘广贤，孔繁华.HLA基因分型的最新进展.国外医学免疫学分册，1996，1：12
6，Anderson L, Sigurdardottir S, Borsch C, et al. Evolution of MHC polymorphism: extensive sharing of polymorphic sequence motifs between human and bovine DRB alleles. Immunogenetics, 1991, 33:188
(收稿日期：1999-11-08), http://www.100md.com