肝细胞微粒体的制备和细胞色素P450氧化酶活性测定
作者：唐跃年 张顺国 李 岚 张宛陵
单位：唐跃年 张顺国 李 岚 张宛陵 上海第二医科大学附属新华医院
关键词：人肝细胞微粒体；细胞色素P450；细胞色素b5
中国医院药学杂志981203 摘要 目的:为测定人肝细胞微粒体细胞色素P450氧化酶的活性。方法:用差速离心法制备3例人肝细胞微粒体。结果:细胞色素P450的含量为0.523±0.005 nmol.mg-1；细胞色素b5为0.285±0.025nmol.mg-1；氨基比林N-脱甲基酶的活力为0.5±0.6 nmol.mg-1；乙基吗啡N-脱甲基酶活力为0.98±0.08 nmol.mg-1。结论:P450酶活性影响因素较多，个体差异大。临床用药时应考虑患者的个体情况。
, 百拇医药
目前，对药物代谢的研究国内外许多文献均已进入肝微粒体水平[1～3]。由于人体肝微粒体所含的各种酶活性影响因素很多，不同种族、不同个体间的酶活性在质和量上有很大差异。这些差异的存在，对临床病人的治疗和诊断正日趋显得重要起来[4～5]。本文测定了3例我国正常人肝细胞微粒体内细胞色素P450氧化酶的活性。
1 试剂与仪器
1.1 试剂 氨基比林(上海浦东九福药业公司)；乙基吗啡(青海制药厂)；葡萄糖6-磷酸、葡萄糖6-磷酸脱氢酶、NADP、NADPH、牛血清白蛋白均为市售生化试剂；其它化学试剂均为AR或CP级纯。
1.2 仪器 Hitachi80P-7制备型超速离心机；美国HP-8453紫外检测仪；GF-1控时调速式高速分散器(江苏海门其林医用仪器厂)；SHZ-82型水浴衡温震荡器(江苏太仓县医疗器械厂)。
, 百拇医药
2 方法
2.1 肝微粒体的制备 3例人肝脏样本均来自我国成年男性个体，其中2例取自肾移植供肾者，肝脏于死亡后3 h内取出，另1例取自交通事故死亡者，于死亡后8 h内取出。所有肝脏取出后，均用干冰转移到-120 ℃冰箱内储存。
2.2 人肝微粒体制备[6] 取部分肝组织剪成碎块，用含KCl(0.15mol.L-1)的磷酸缓冲液(0.1 mol.L-1，pH7.4)反复冲洗除掉组织中的血液成份，最后按1∶4(W/V)加入上述KCl-磷酸缓冲溶液，用内切式组织匀浆机制成肝匀浆。将制备好的肝匀浆在超速离心机上离心(9 000 r.min-1)15 min。取上清液再离心(100 000 r.min-1)60 min，弃去上清液，得粉红色沉淀(即肝微粒体)，将其悬浮于含30%甘油(v/v)的KCl-磷酸缓冲溶液中。放入-120 ℃冰箱中储存备用。以上所有操作均在冰浴中进行。微粒体蛋白浓度按Lowry法测定。
, 百拇医药
2.3 细胞色素P450和b5的含量测定 微粒体中P450含量按Omura和Sato分光光度法测定。即将微粒体用KCL-磷酸缓冲溶液稀释成1.0 mg.ml-1，加入数毫克连二亚硫酸钠，混匀，1 min后等份到参照杯和样品杯中，在紫外分光光度仪上先扫描基线，然后在样品杯中通入CO约1 min，稳定5 min后在400～500 nm波长范围内扫描，得还原型细胞色素P450-CO复合物的吸收光谱图，记录450和480 nm波长处的吸收值，按以下公式计算P450含量。
2.4 细胞色素b5测定 将微粒体用KCl-磷酸缓冲溶液稀释成1.0 mg.ml，等分到参照杯和样品杯中，在紫外分光光度仪上先扫描基线，然后在样品池中加入数毫克连二亚硫酸钠，混匀，在400～500 nm波长范围内扫描，记录423和500 nm波长处的吸收值，按以下公式计算b5含量。
, 百拇医药
2.5 氨基比林N-脱甲基酶(ADM)和乙基吗啡N-脱甲基酶(EDM)的活力测定 反应体系含NADPH0.1 mmol.L-1、G6P10 mmol.L-1、G6PD2.0 Ku.L-1、MgCl5 mmol.L-1、人肝微粒体1g.L-1、底物ADM10 mmol.L-1或EDM5 mmol.L-1，用磷酸缓冲液(0.1 mol.L-1，pH7.4)将反应体积稀释到1.0 ml。于37 ℃水浴振荡孵育30 min后，即加入20% ZnSO4溶液0.5 ml、饱和Ba(OH2)溶液1.5 ml终止反应，并沉淀蛋白质，离心(3 000 r.min-1)10 min。取上清液2 ml，加入NaSH试剂1 ml，于37 ℃水浴加温震荡40 min，冷却，在415 nm波长处测定A值，计算甲醛的生成量。以甲醛的生成速率(nmol.mg-1.min-1)表示肝微粒体N-脱甲基酶的活力。
, 百拇医药
3 结果
3.1 细胞色素P450及细胞色素b5含量 人肝微粒体细胞色素P450和细胞色素b5含量分别为0.052±0.005和0.285±0.025 nmol.g-1，RSD为8.85%和8.84%。细胞色素P450含量约为细胞色素b5的18.38%(见表1)。
表1 肝微粒体酶活性 肝
编
号
P450
nmol.g-1
b5
nmol.g-1
, 百拇医药
ADM
nmol.mg-1
.min-1
EDM
nmol.mg-1
.min-1
M1
0.0458
0.320
0.561
, 百拇医药 1.092
M2
0.0557
0.268
0.441
0.884
M3
0.0554
0.266
0.570
0.977
±s
0.052±0.005
, 百拇医药
0.285±0.025
0.52±0.06
0.98±0.08
3.2 几种单加氧化酶的活性 ADM、EDM的羟化酶活力见表1。ADM、EDM活性个体差异较小，RSD分别为11.21%、8.65%。4 讨论
4.1 血红蛋白对P450酶测定干扰的消除 人体肝微粒体细胞色素P450的含量测定一般采用经连二亚硫酸钠还原的肝微粒体悬浮液的CO-差光谱计算。但是由于在标本收集时，很难用门静脉灌洗，所以在制备微粒体时，混有较多的血红蛋白，在测定P450酶的浓度时血红蛋白-CO复合物可干扰还原型P450-CO复合物的吸收光谱。为此，本实验用通CO微粒体悬浮液的连二亚硫酸钠差光谱计算，可消除血红蛋白对测定的干扰。
4.2 实验室指标的相关性分析 本文所测的几例成人肝微粒体内P450、b5的含量明显低于白种人。国外报道P450与b5的含量接近，而本实验结果P450含量仅为b5的18.38%。ADM和EDM的活性也与文献报道有出入。由于细胞色素P450氧化酶的活性受遗传、环境、个体的饮食习惯、营养状况、嗜好及药物等因素的影响，个体差异较大。加上P450同功酶底物的交叉性及本实验例数很少，因此在本实验条件下，样本数太少，难以从这些酶活性的相关性中得出其规律性。
, http://www.100md.com
参考文献
1 匡唐永，楼雅卿.体外测定人肝微粒体中安定代谢产物(去甲基安定和羟安定)含量的方法学研究.中国临床药理学杂志，1993，9：30
2 Hall SD,Guegerich FP,Branch RA,et al.Characterization and inhibition of mephenytoin 4-hydroxylase activity in human liver microsomes.J Pharmacol Exp Ther,1987,240:216
3 Skjelbo E,Brosen K.Inhibitors of imipramine metabolism by human liver microsomes.Br J Clin Pharmacol,1992,34:256
4 许振华，周宏灏.细胞色素氧化酶P4501A2与药物代谢.中国临床药理学杂志，1996，12：115
5 王军升，许振华，周宏灏.细胞色素氧化酶P4503A4与药物代射.中国临床药理学杂志，1996，12：231
6 Ven Bahr C,Groth CG,Jansson H,et al.Drug metabolism in human liver in vitro:Establishment of a human liver bank,Clin Pharmacol Ther,1980,27:711
(1997年11月20日收稿), http://www.100md.com
单位：唐跃年 张顺国 李 岚 张宛陵 上海第二医科大学附属新华医院
关键词：人肝细胞微粒体；细胞色素P450；细胞色素b5
中国医院药学杂志981203 摘要 目的:为测定人肝细胞微粒体细胞色素P450氧化酶的活性。方法:用差速离心法制备3例人肝细胞微粒体。结果:细胞色素P450的含量为0.523±0.005 nmol.mg-1；细胞色素b5为0.285±0.025nmol.mg-1；氨基比林N-脱甲基酶的活力为0.5±0.6 nmol.mg-1；乙基吗啡N-脱甲基酶活力为0.98±0.08 nmol.mg-1。结论:P450酶活性影响因素较多，个体差异大。临床用药时应考虑患者的个体情况。
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目前，对药物代谢的研究国内外许多文献均已进入肝微粒体水平[1～3]。由于人体肝微粒体所含的各种酶活性影响因素很多，不同种族、不同个体间的酶活性在质和量上有很大差异。这些差异的存在，对临床病人的治疗和诊断正日趋显得重要起来[4～5]。本文测定了3例我国正常人肝细胞微粒体内细胞色素P450氧化酶的活性。
1 试剂与仪器
1.1 试剂 氨基比林(上海浦东九福药业公司)；乙基吗啡(青海制药厂)；葡萄糖6-磷酸、葡萄糖6-磷酸脱氢酶、NADP、NADPH、牛血清白蛋白均为市售生化试剂；其它化学试剂均为AR或CP级纯。
1.2 仪器 Hitachi80P-7制备型超速离心机；美国HP-8453紫外检测仪；GF-1控时调速式高速分散器(江苏海门其林医用仪器厂)；SHZ-82型水浴衡温震荡器(江苏太仓县医疗器械厂)。
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2 方法
2.1 肝微粒体的制备 3例人肝脏样本均来自我国成年男性个体，其中2例取自肾移植供肾者，肝脏于死亡后3 h内取出，另1例取自交通事故死亡者，于死亡后8 h内取出。所有肝脏取出后，均用干冰转移到-120 ℃冰箱内储存。
2.2 人肝微粒体制备[6] 取部分肝组织剪成碎块，用含KCl(0.15mol.L-1)的磷酸缓冲液(0.1 mol.L-1，pH7.4)反复冲洗除掉组织中的血液成份，最后按1∶4(W/V)加入上述KCl-磷酸缓冲溶液，用内切式组织匀浆机制成肝匀浆。将制备好的肝匀浆在超速离心机上离心(9 000 r.min-1)15 min。取上清液再离心(100 000 r.min-1)60 min，弃去上清液，得粉红色沉淀(即肝微粒体)，将其悬浮于含30%甘油(v/v)的KCl-磷酸缓冲溶液中。放入-120 ℃冰箱中储存备用。以上所有操作均在冰浴中进行。微粒体蛋白浓度按Lowry法测定。
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2.3 细胞色素P450和b5的含量测定 微粒体中P450含量按Omura和Sato分光光度法测定。即将微粒体用KCL-磷酸缓冲溶液稀释成1.0 mg.ml-1，加入数毫克连二亚硫酸钠，混匀，1 min后等份到参照杯和样品杯中，在紫外分光光度仪上先扫描基线，然后在样品杯中通入CO约1 min，稳定5 min后在400～500 nm波长范围内扫描，得还原型细胞色素P450-CO复合物的吸收光谱图，记录450和480 nm波长处的吸收值，按以下公式计算P450含量。
2.4 细胞色素b5测定 将微粒体用KCl-磷酸缓冲溶液稀释成1.0 mg.ml，等分到参照杯和样品杯中，在紫外分光光度仪上先扫描基线，然后在样品池中加入数毫克连二亚硫酸钠，混匀，在400～500 nm波长范围内扫描，记录423和500 nm波长处的吸收值，按以下公式计算b5含量。
, 百拇医药
2.5 氨基比林N-脱甲基酶(ADM)和乙基吗啡N-脱甲基酶(EDM)的活力测定 反应体系含NADPH0.1 mmol.L-1、G6P10 mmol.L-1、G6PD2.0 Ku.L-1、MgCl5 mmol.L-1、人肝微粒体1g.L-1、底物ADM10 mmol.L-1或EDM5 mmol.L-1，用磷酸缓冲液(0.1 mol.L-1，pH7.4)将反应体积稀释到1.0 ml。于37 ℃水浴振荡孵育30 min后，即加入20% ZnSO4溶液0.5 ml、饱和Ba(OH2)溶液1.5 ml终止反应，并沉淀蛋白质，离心(3 000 r.min-1)10 min。取上清液2 ml，加入NaSH试剂1 ml，于37 ℃水浴加温震荡40 min，冷却，在415 nm波长处测定A值，计算甲醛的生成量。以甲醛的生成速率(nmol.mg-1.min-1)表示肝微粒体N-脱甲基酶的活力。
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3 结果
3.1 细胞色素P450及细胞色素b5含量 人肝微粒体细胞色素P450和细胞色素b5含量分别为0.052±0.005和0.285±0.025 nmol.g-1，RSD为8.85%和8.84%。细胞色素P450含量约为细胞色素b5的18.38%(见表1)。
表1 肝微粒体酶活性 肝
编
号
P450
nmol.g-1
b5
nmol.g-1
, 百拇医药
ADM
nmol.mg-1
.min-1
EDM
nmol.mg-1
.min-1
M1
0.0458
0.320
0.561
, 百拇医药 1.092
M2
0.0557
0.268
0.441
0.884
M3
0.0554
0.266
0.570
0.977
±s0.052±0.005
, 百拇医药
0.285±0.025
0.52±0.06
0.98±0.08
3.2 几种单加氧化酶的活性 ADM、EDM的羟化酶活力见表1。ADM、EDM活性个体差异较小，RSD分别为11.21%、8.65%。4 讨论
4.1 血红蛋白对P450酶测定干扰的消除 人体肝微粒体细胞色素P450的含量测定一般采用经连二亚硫酸钠还原的肝微粒体悬浮液的CO-差光谱计算。但是由于在标本收集时，很难用门静脉灌洗，所以在制备微粒体时，混有较多的血红蛋白，在测定P450酶的浓度时血红蛋白-CO复合物可干扰还原型P450-CO复合物的吸收光谱。为此，本实验用通CO微粒体悬浮液的连二亚硫酸钠差光谱计算，可消除血红蛋白对测定的干扰。
4.2 实验室指标的相关性分析 本文所测的几例成人肝微粒体内P450、b5的含量明显低于白种人。国外报道P450与b5的含量接近，而本实验结果P450含量仅为b5的18.38%。ADM和EDM的活性也与文献报道有出入。由于细胞色素P450氧化酶的活性受遗传、环境、个体的饮食习惯、营养状况、嗜好及药物等因素的影响，个体差异较大。加上P450同功酶底物的交叉性及本实验例数很少，因此在本实验条件下，样本数太少，难以从这些酶活性的相关性中得出其规律性。
, http://www.100md.com
参考文献
1 匡唐永，楼雅卿.体外测定人肝微粒体中安定代谢产物(去甲基安定和羟安定)含量的方法学研究.中国临床药理学杂志，1993，9：30
2 Hall SD,Guegerich FP,Branch RA,et al.Characterization and inhibition of mephenytoin 4-hydroxylase activity in human liver microsomes.J Pharmacol Exp Ther,1987,240:216
3 Skjelbo E,Brosen K.Inhibitors of imipramine metabolism by human liver microsomes.Br J Clin Pharmacol,1992,34:256
4 许振华，周宏灏.细胞色素氧化酶P4501A2与药物代谢.中国临床药理学杂志，1996，12：115
5 王军升，许振华，周宏灏.细胞色素氧化酶P4503A4与药物代射.中国临床药理学杂志，1996，12：231
6 Ven Bahr C,Groth CG,Jansson H,et al.Drug metabolism in human liver in vitro:Establishment of a human liver bank,Clin Pharmacol Ther,1980,27:711
(1997年11月20日收稿), http://www.100md.com