银屑病患者皮损中端粒酶活性的测定
作者：程浩 茅晓红 张行 蔡心涵 孙国均 郑树
单位：310009 杭州，浙江医科大学附属第二医院皮肤科(程浩 茅晓红 孙国均)；浙江医科大学肿瘤研究所(张行 蔡心涵 郑树)
关键词：银屑病；DNA核苷酸外转移酶
中华皮肤科杂志980202.htm 【摘要】 目的 探讨银屑病的端粒酶活性表达情况。方法 采用端粒重复序列扩增文件——酶标法(TRAP-ELISA)测定银屑病皮损中端粒酶活性。结果 银屑病皮损中有一定水平的端粒酶活性，但其水平显著低于肿瘤组织和细胞株。结论 端粒酶不仅可在恶性肿瘤表达，也可在一些非恶性皮肤病组织表达；并且认为银屑病皮损中端粒酶活性的增加可能与银屑病发病机理尤其是表皮细胞的持续过度分化有某种关联。
Detection of Telomerase Activity in the Lesion of Psoriasis Cheng Hao, Mao Xiaohong, Zhang Xing, et al. Department of Dermatology, Second Affliated Hospital and Cancer Research Institute, Zhejiang Medical University, Hangzhou 310009
, http://www.100md.com
【Abstract】 Objective To investigate telomerase activity in patients with psoriasis. Methods The telomerase activity in the skin lesions of patients was detected by TRAP (Telomeric repeat amplification protocol)——ELISA which is based upon PCR amplification of the initial telomerase product and detected by ELISA. Results Telomerase activity was detected in the lesions of psoriatic patients, but the level of it was lower in comparison with that in tissues of malignant tumor and K562 cell line. Conclusion These findings support that the increase of telomerase activity may be linked to the pathogenesis of psoriasis and that the telomerase activity can be detected not only in malignant tumors but also in nonmalignant skin diseases.
, 百拇医药
【Key words】 Psoriasis DNA nucleotidylexotransferase
端粒是真核细胞线状DNA末端的一组6个核苷酸的重复序列5′-TTAGGG-3′，它可能有很多重要功能，如对维持染色体的稳定性、一致性、复制和功能等。尤其被认为在保护基因组DNA免受降解和有害的重组事件如端端融合、重排、染色体移位和染色体缺失方面具有重要作用。端粒酶是一种核糖核苷酸蛋白酶，它可以合成端粒的重复序列并连接到染色体末端，从而维持端粒长度。正常体细胞在出生后不久即不再表达端粒酶，但在人体的永生细胞及肿瘤细胞中可有端粒酶激活并使端粒延长，以有效地防止细胞老化及死亡。肿瘤细胞株的这种特性提示，端粒酶的激活或重新表达可能是细胞或肿瘤细胞生长和永生所必须。因此，多数学者认为测定端粒酶活性有助于了解细胞的生长与增殖，并且可以作为诊断肿瘤的一项有效指标[1，2]。近来研究又发现，尽管端粒酶活性主要在大多数肿瘤中表达，但在某些非恶性皮肤病中也有表达的迹象[3，4]。为了进一步探讨这些发现，我们测定银屑病，一种非恶性但有高度增生的皮肤病中端粒酶活性的表达情况。
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材料和方法
临床资料：20例经临床及病理确诊的寻常型银屑病患者，男16例，女4例；年龄17～64岁；病程0.5～31年；斑块状13例，点滴状7例。对照组为来自外科整形术的非暴露部位正常皮肤(5例)、蕈样肉芽肿(1例)、乳房外Paget病(1例)和肺癌手术标本(3例)。患者皮损经局麻后用环钻钻取，并一分为二，一块送常规组织学检查，另一块置于一1.5ml的离心管中后投入液氮，于-80℃保存。
组织RNA抽提：组织标本于冰上用外科剪剪成薄片后置含200μl冰裂解液[(10mmol/L PMSF, 1mmol/L Tris pH7.5, 1mmol/L MgCl2, 1mmol/L EGTA, 0.5%(w∶v) CHASP, 10%(v∶v)甘油]的离心管中，冰上混匀并置冰上30分钟。然后把裂解产物在4℃ 15 000g离心30分钟，移上清液至另一Eppendorf管并保存于-80℃。标本深低温保存前先用双缩脲法(Biuret)测蛋白浓度。提取物可通过加热65℃ 10分钟使端粒酶失活作为阴性对照。
, 百拇医药
端粒酶活性检测：使用端粒酶PCR-ELISA药盒(Boehringer Mannheim Co.Cat.No.185466)，它把一种生物素化的引物引入端粒重复放大程序(telomeric repeat amplification protocol, TRAP)TRAP法中并用ELISA法测定PCR产物。简言之，即在含反应混合物(包括生物素标记的P1-TS引物和P2引物[2]，Taq酶等)的反应试管中进行TRAP反应，进而用酶标法测定扩增产物。具体步骤为①在1ml试管中依次加入25μl的反应混合液、1～3μl的细胞提取液(RNA酶)或1～50μg总蛋白的组织样本，加水至50μl并加石蜡油封闭。②将反应管置于DNA扩增仪(Perkin Elmer 480)中，并按以下步骤进行引物的延伸及扩增反应：25℃ 30分钟使引物延伸、90℃ 5分钟端粒酶灭活、94℃ 30秒变性、50℃ 30秒退火、72℃ 90秒延伸，共循环30个周期后再72℃延伸10分钟。③PCR扩增产物的变性与杂交。④上述产物在酶标包被板上与抗地高辛-过氧化物酶(anti-dig-pod)、TMB底物及反应终止剂共同孵育后用ELISA计数器(Σ960)测定其在波长为450nm的吸光度(A值)，此即为PCR产物的定量分析。我们同时使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及银染法来分析PCR产物，使6个核苷酸长的重复片段产物显影成多条带的梯形图。用K562细胞株作为端粒酶活性的阳性对照。统计学处理用POMS统计系统。
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结 果
银屑病皮损中的端粒酶活性：对20例银屑病患者皮损的端粒酶活性测定发现，18例皮损的端粒酶活性为阳性，且表现为较高水平(A值0.001～0.159，平均0.051)。值得注意的是，其中13例点滴状银屑病皮损中端粒酶活性(A值0.026～0.158，平均0.070)似较斑块状银屑病皮损(A值0.001～0.159，平均0.041)高，但无统计学差异(t=1.3304，P=0.02)。我们还测定了1例蕈样肉芽肿(A值0.063)，1例乳房外Paget病(A值0.233)及3例肺癌(A值0.091～0.66，平均0.332)的端粒酶活性，发现其值均比银屑病患者高得多，而作为阳性对照的K562细胞株的端粒酶活性更高(A值0.81～1.41，平均0.982)。TRAP产物的电泳和银染结果是直观的六个碱基对(Bp)的重复条带形成的梯形图，条带的相对数量和显色强弱也能反映端粒酶的活性，在本实验中电泳显色结果亦与酶标结果相符。见图1、2。
正常皮肤中端粒酶活性的表达：测定5例正常非暴露部位(髋、肘窝、背、臀)皮肤中的端粒酶活性，意外地发现其中2例有阳性的端粒酶活性(A值分别为0.024和0.005)，但该5例标本的端粒酶活性水平均很低，约是银屑病患者的1/10，且有统计学差异(P<0.01，t′=3.7686)。见图1、2。
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1乳房湿疹样癌 2正常皮肤 3、4银屑病 5蕈样肉芽肿
图1 来自不同皮肤标本的端粒酶产物，一种六核苷酸重复片段，其在电泳和银染后形成多条带的梯形图
1～3正常皮肤 4阴性对照 5K562细胞
图2 端粒酶活性在正常皮肤和K562细胞中的表达
讨 论
我们的研究结果表明，除了已知的恶性肿瘤可有端粒酶活性的表达外，在非恶性皮肤病皮损中确实也能测到一定水平的端粒酶活性，这与Yasumoto和Talor的报道一致[3，4]，尽管在非恶性病变中的端粒酶活性较恶性病变者低得多。在非恶性皮肤病皮损中测得端粒酶活性，提示非恶性的上皮细胞亦可有一定的端粒酶活性的激活，并推测与引起病理改变的表皮增生有密切关联。但其机制还不清楚，即在此种情形下端粒酶的表达又是通过何种途径而激活还不得而知。
, 百拇医药
至于发现5例正常非暴露部位的皮肤标本中有2例也可测到端粒酶活性，尚未找到合理解释。在别人的研究中，只有紫外线照射部位的皮肤才表达端粒酶活性，而非暴露部位皮肤并不表达。有学者对紫外线照射组织进行的研究提出，紫外线可能是通过诱导某些能同时影响角朊细胞与白细胞的因素来调节端粒酶的活性[4～6]。
总之，实验结果表明，端粒酶活性不仅能在恶性组织中表达，而且也能在某些良性增殖或炎性组织中有一定水平的表达，如也可在银屑病中表达。但对于这种情况下的端粒酶表达意义还不清楚，是否有效的端粒酶抑制剂能抑制表皮细胞的过度增殖而能治疗银屑病仍有待进一步探讨。
参 考 文 献
1 Bacchetti S, Counter CM. Telomeres and telomerase in human cancer. Int J Oncol, 1995,7∶423-428.
, http://www.100md.com
2 Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994,226∶2011-2015.
3 Yasumoto S, Kikuchi K, Tahara H, et al. Telomerase activity in normal human epithelial cells. Oncogene, 1996,13∶433-437.
4 Taylor RS, Ramirez RD, Ogoshi M, et al. Detection of telomerase activity in malignant and nonmalignant skin conditions. J Invest Dermatol, 1996,106∶759-765.
5 Cruz PD Jr. Ultraviolet B(UVB)-induced immunosuppression: biologic, cellular and molecular effects. Adv Dermatol, 1994,9∶79-95.
6 Ueda M, Ouhtit A, Bito T, et al. Evidence for UV-associated activation of telomerase in human skin. Cancer Res, 1997,57∶370-374.
(收稿：1997-08-19 修回：1997-11-03), 百拇医药
单位：310009 杭州，浙江医科大学附属第二医院皮肤科(程浩 茅晓红 孙国均)；浙江医科大学肿瘤研究所(张行 蔡心涵 郑树)
关键词：银屑病；DNA核苷酸外转移酶
中华皮肤科杂志980202.htm 【摘要】 目的 探讨银屑病的端粒酶活性表达情况。方法 采用端粒重复序列扩增文件——酶标法(TRAP-ELISA)测定银屑病皮损中端粒酶活性。结果 银屑病皮损中有一定水平的端粒酶活性，但其水平显著低于肿瘤组织和细胞株。结论 端粒酶不仅可在恶性肿瘤表达，也可在一些非恶性皮肤病组织表达；并且认为银屑病皮损中端粒酶活性的增加可能与银屑病发病机理尤其是表皮细胞的持续过度分化有某种关联。
Detection of Telomerase Activity in the Lesion of Psoriasis Cheng Hao, Mao Xiaohong, Zhang Xing, et al. Department of Dermatology, Second Affliated Hospital and Cancer Research Institute, Zhejiang Medical University, Hangzhou 310009
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【Abstract】 Objective To investigate telomerase activity in patients with psoriasis. Methods The telomerase activity in the skin lesions of patients was detected by TRAP (Telomeric repeat amplification protocol)——ELISA which is based upon PCR amplification of the initial telomerase product and detected by ELISA. Results Telomerase activity was detected in the lesions of psoriatic patients, but the level of it was lower in comparison with that in tissues of malignant tumor and K562 cell line. Conclusion These findings support that the increase of telomerase activity may be linked to the pathogenesis of psoriasis and that the telomerase activity can be detected not only in malignant tumors but also in nonmalignant skin diseases.
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【Key words】 Psoriasis DNA nucleotidylexotransferase
端粒是真核细胞线状DNA末端的一组6个核苷酸的重复序列5′-TTAGGG-3′，它可能有很多重要功能，如对维持染色体的稳定性、一致性、复制和功能等。尤其被认为在保护基因组DNA免受降解和有害的重组事件如端端融合、重排、染色体移位和染色体缺失方面具有重要作用。端粒酶是一种核糖核苷酸蛋白酶，它可以合成端粒的重复序列并连接到染色体末端，从而维持端粒长度。正常体细胞在出生后不久即不再表达端粒酶，但在人体的永生细胞及肿瘤细胞中可有端粒酶激活并使端粒延长，以有效地防止细胞老化及死亡。肿瘤细胞株的这种特性提示，端粒酶的激活或重新表达可能是细胞或肿瘤细胞生长和永生所必须。因此，多数学者认为测定端粒酶活性有助于了解细胞的生长与增殖，并且可以作为诊断肿瘤的一项有效指标[1，2]。近来研究又发现，尽管端粒酶活性主要在大多数肿瘤中表达，但在某些非恶性皮肤病中也有表达的迹象[3，4]。为了进一步探讨这些发现，我们测定银屑病，一种非恶性但有高度增生的皮肤病中端粒酶活性的表达情况。
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材料和方法
临床资料：20例经临床及病理确诊的寻常型银屑病患者，男16例，女4例；年龄17～64岁；病程0.5～31年；斑块状13例，点滴状7例。对照组为来自外科整形术的非暴露部位正常皮肤(5例)、蕈样肉芽肿(1例)、乳房外Paget病(1例)和肺癌手术标本(3例)。患者皮损经局麻后用环钻钻取，并一分为二，一块送常规组织学检查，另一块置于一1.5ml的离心管中后投入液氮，于-80℃保存。
组织RNA抽提：组织标本于冰上用外科剪剪成薄片后置含200μl冰裂解液[(10mmol/L PMSF, 1mmol/L Tris pH7.5, 1mmol/L MgCl2, 1mmol/L EGTA, 0.5%(w∶v) CHASP, 10%(v∶v)甘油]的离心管中，冰上混匀并置冰上30分钟。然后把裂解产物在4℃ 15 000g离心30分钟，移上清液至另一Eppendorf管并保存于-80℃。标本深低温保存前先用双缩脲法(Biuret)测蛋白浓度。提取物可通过加热65℃ 10分钟使端粒酶失活作为阴性对照。
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端粒酶活性检测：使用端粒酶PCR-ELISA药盒(Boehringer Mannheim Co.Cat.No.185466)，它把一种生物素化的引物引入端粒重复放大程序(telomeric repeat amplification protocol, TRAP)TRAP法中并用ELISA法测定PCR产物。简言之，即在含反应混合物(包括生物素标记的P1-TS引物和P2引物[2]，Taq酶等)的反应试管中进行TRAP反应，进而用酶标法测定扩增产物。具体步骤为①在1ml试管中依次加入25μl的反应混合液、1～3μl的细胞提取液(RNA酶)或1～50μg总蛋白的组织样本，加水至50μl并加石蜡油封闭。②将反应管置于DNA扩增仪(Perkin Elmer 480)中，并按以下步骤进行引物的延伸及扩增反应：25℃ 30分钟使引物延伸、90℃ 5分钟端粒酶灭活、94℃ 30秒变性、50℃ 30秒退火、72℃ 90秒延伸，共循环30个周期后再72℃延伸10分钟。③PCR扩增产物的变性与杂交。④上述产物在酶标包被板上与抗地高辛-过氧化物酶(anti-dig-pod)、TMB底物及反应终止剂共同孵育后用ELISA计数器(Σ960)测定其在波长为450nm的吸光度(A值)，此即为PCR产物的定量分析。我们同时使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及银染法来分析PCR产物，使6个核苷酸长的重复片段产物显影成多条带的梯形图。用K562细胞株作为端粒酶活性的阳性对照。统计学处理用POMS统计系统。
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结 果
银屑病皮损中的端粒酶活性：对20例银屑病患者皮损的端粒酶活性测定发现，18例皮损的端粒酶活性为阳性，且表现为较高水平(A值0.001～0.159，平均0.051)。值得注意的是，其中13例点滴状银屑病皮损中端粒酶活性(A值0.026～0.158，平均0.070)似较斑块状银屑病皮损(A值0.001～0.159，平均0.041)高，但无统计学差异(t=1.3304，P=0.02)。我们还测定了1例蕈样肉芽肿(A值0.063)，1例乳房外Paget病(A值0.233)及3例肺癌(A值0.091～0.66，平均0.332)的端粒酶活性，发现其值均比银屑病患者高得多，而作为阳性对照的K562细胞株的端粒酶活性更高(A值0.81～1.41，平均0.982)。TRAP产物的电泳和银染结果是直观的六个碱基对(Bp)的重复条带形成的梯形图，条带的相对数量和显色强弱也能反映端粒酶的活性，在本实验中电泳显色结果亦与酶标结果相符。见图1、2。
正常皮肤中端粒酶活性的表达：测定5例正常非暴露部位(髋、肘窝、背、臀)皮肤中的端粒酶活性，意外地发现其中2例有阳性的端粒酶活性(A值分别为0.024和0.005)，但该5例标本的端粒酶活性水平均很低，约是银屑病患者的1/10，且有统计学差异(P<0.01，t′=3.7686)。见图1、2。
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1乳房湿疹样癌 2正常皮肤 3、4银屑病 5蕈样肉芽肿
图1 来自不同皮肤标本的端粒酶产物，一种六核苷酸重复片段，其在电泳和银染后形成多条带的梯形图
1～3正常皮肤 4阴性对照 5K562细胞
图2 端粒酶活性在正常皮肤和K562细胞中的表达
讨 论
我们的研究结果表明，除了已知的恶性肿瘤可有端粒酶活性的表达外，在非恶性皮肤病皮损中确实也能测到一定水平的端粒酶活性，这与Yasumoto和Talor的报道一致[3，4]，尽管在非恶性病变中的端粒酶活性较恶性病变者低得多。在非恶性皮肤病皮损中测得端粒酶活性，提示非恶性的上皮细胞亦可有一定的端粒酶活性的激活，并推测与引起病理改变的表皮增生有密切关联。但其机制还不清楚，即在此种情形下端粒酶的表达又是通过何种途径而激活还不得而知。
, 百拇医药
至于发现5例正常非暴露部位的皮肤标本中有2例也可测到端粒酶活性，尚未找到合理解释。在别人的研究中，只有紫外线照射部位的皮肤才表达端粒酶活性，而非暴露部位皮肤并不表达。有学者对紫外线照射组织进行的研究提出，紫外线可能是通过诱导某些能同时影响角朊细胞与白细胞的因素来调节端粒酶的活性[4～6]。
总之，实验结果表明，端粒酶活性不仅能在恶性组织中表达，而且也能在某些良性增殖或炎性组织中有一定水平的表达，如也可在银屑病中表达。但对于这种情况下的端粒酶表达意义还不清楚，是否有效的端粒酶抑制剂能抑制表皮细胞的过度增殖而能治疗银屑病仍有待进一步探讨。
参 考 文 献
1 Bacchetti S, Counter CM. Telomeres and telomerase in human cancer. Int J Oncol, 1995,7∶423-428.
, http://www.100md.com
2 Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994,226∶2011-2015.
3 Yasumoto S, Kikuchi K, Tahara H, et al. Telomerase activity in normal human epithelial cells. Oncogene, 1996,13∶433-437.
4 Taylor RS, Ramirez RD, Ogoshi M, et al. Detection of telomerase activity in malignant and nonmalignant skin conditions. J Invest Dermatol, 1996,106∶759-765.
5 Cruz PD Jr. Ultraviolet B(UVB)-induced immunosuppression: biologic, cellular and molecular effects. Adv Dermatol, 1994,9∶79-95.
6 Ueda M, Ouhtit A, Bito T, et al. Evidence for UV-associated activation of telomerase in human skin. Cancer Res, 1997,57∶370-374.
(收稿：1997-08-19 修回：1997-11-03), 百拇医药