解脲支原体中tetM基因的检测及临床应用评价
作者：朱慧兰 徐广坤 赖维 陆春 陈荣章0
单位：510063 广州，中山医科大学第三附属医院皮肤科[朱慧兰(现在广州市皮肤性病防治所) 徐广坤 赖维 陆春 陈荣章]
关键词：
中国皮肤科杂志980325 近年来对解脲支原体(Uu)的耐药性研究表明，tetM基因是介导Uu对四环素耐药的唯一基因[1]。能否用检测tetM基因来反映Uu对四环素或四环素类其它抗生素的耐药性尚不清楚。本研究应用聚合酶链反应(PCR)方法检测tetM基因，并将其结果与微量肉汤稀释法检测药物敏感性及临床疗效进行综合分析，以图明确tetM基因在Uu耐药性中的作用。
一、材料与方法
(一)材料：
, http://www.100md.com 1.实验菌株：2株Uu标准菌株(血清型8TcS和血清型9TcR，由加拿大Albata大学Robertso n教授赠送)，1株金黄色葡萄球菌标准菌株(由中山医科大学微生物教研室提供)，54株Uu是 从我科STD门诊非淋菌性尿道炎(NGU)患者的尿道或宫颈拭子分离的临床株[2 ，3]。
2.Uu选择性培养基：Uu液体培养基含1∶1牛心消化液、20%新鲜小牛血清、10%新鲜酵母浸液、0.1%尿素、0.002%酚红、2万U/ml青霉素，pH5.6～6.0。Uu固体培养基是在液体培养基基础上加1.2%琼脂。以上试剂均由中山医科大学免疫学教研室提供。
3.药物及主要试剂：标准品盐酸四环素(Tc)和强力霉素(Dx，Sigma公司)，美满霉素(Mc)(美国立达大药厂)。溶菌酶和蛋白酶K(Sigma公司)，Taq DNA聚合酶和限制性内切酶TaqⅠ(北京遗传所)。
, 百拇医药
4.引物：序列为5′-TTATCAACGGTTTATCAGG-3′和5′-CGTATATATGCAAGACG-3′ [4]，由中山医科大学遗传教研室负责合成。
5.临床资料：从上述54例NGU患者中，筛选单纯Uu感染引起的并首选四环素类抗生素(Dx或Mc )治疗的病例资料21份。治疗方案：Dx或Mc 0.1每日2次，7～14天，停药一周后随访。疗效判断标准：①有效：症状、体征消失，Uu检查阴性，尿道或宫颈拭子涂片在1000倍显微镜下多形核白细胞≤4个；②无效：病情好转或无变化，但Uu检查仍阳性。
(二)实验方法：
1.微量肉汤稀释法检测药物MIC[3]：Tc、Dx及Mc标准品40mg制 备成原浓度为4096μg/ml的药液，取96孔酶标板，每孔反应体积为200μl，每孔由25μl含不同浓度的药物(浓度梯度为0.25～512μg/ml)和25μl菌液(103ccu/ml)。每次试验时使用标准菌株和设置对照孔。混匀后置于烛缸，37℃，孵育48小时观察结果。
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2.结果判定：按照NCCLS标准，Tc、Dx和Mc的敏感、中敏、耐药标准分别为MIC≤4μg/ml、M IC＝8μg/ml、MIC≥16μg/ml[4]。
3.DNA的抽提：采用酚-氯仿抽提法。
4.PCR扩增及酶切：反应总体积50μl，扩增条件为94℃ 25秒，50℃ 60秒，72℃ 60秒，共4 0个循环(PE-480型扩增仪)。取产物10μl用2%琼脂糖凝胶进行电泳，另取产物20μl用Taq Ⅰ酶消化，然后进行电泳分析。
二、结果
(一)PCR检测tetM基因的特异性、敏感性及重复性：用上述引物对TcRUu和TcSUu及金黄色葡萄球菌标准菌株的DNA进行扩增，结果TcRUu标准菌株出现阳性扩增带，而TcSU u及金黄色葡萄球菌标准菌株没有扩增带(见图1)。扩增产物用TaqⅠ酶切后可产生三个特异性片段，其大小分别为190bp、130bp、77bp(见图2)。以10倍连续稀释的TcRUu标准菌株D NA(10ng～1fg)为模板，进行扩增，结果在10ng～102pg处可见阳性扩增带，而在102p g以下未见阳性扩增带，说明本方法敏感性为102pg，约相当于1.2×102个Uu。分别以TcRUu和TcSUu标准菌株的DNA为模板重复进行扩增，结果如前
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MpGEM-7zf/HaeⅢ
1：TcSUu，2 ：TcRUu，3： 金黄色葡萄球菌
图1 PCR引物的特异性
Mp GEM-7zf/HaeⅢ
1：酶切结果，2 ：扩增产物，3：阴性对照
图2 PCR产物的特异性
述。
(二)PCR检测tetM基因和微量肉汤稀释法检测MIC比较：54株临床Uu菌株的MICs范 围为≤0.25～256μg/ml，其中7株为Tc耐药、11株为Tc中敏、36株为Tc敏感。PCR检测结果 9株tetM基因阳性，45株tetM基因阴性。对上述两种检测方法的结果比较发现，7株微量肉汤 稀释法鉴定为Tc耐药，其PCR结果均阳性；而36株微量肉汤稀释法鉴定为Tc敏感，PCR结果均阴性；另外，微量肉汤稀释法鉴定为Tc中敏的11株Uu中，2株tetM阳性，9株tetM阴性。
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同时用微量肉汤稀释法检测9株tetM阳性和7株tetM阴性Uu对Dx和Mc的敏感性，结果发现在Te tM阳性的9株Uu中7株对Dx、Mc耐药(MICs≥16μg/ml)，2株对Dx、Mc中敏(MIC=8μg/ml)。7株tetM阴性的Uu对Dx和Mc均敏感。
(三)PCR检测tetM基因结果与临床疗效的比较：从54例NGU患者中筛选出21例单纯Uu感染者，并对用四环素类抗生素治疗的临床资料进行分析，其中tetM阳性4例，阴性17例。在阳性的4例患者(其中包括1株Tc、Dx和Mc中敏)中，2例用Dx治疗，1例用Mc治疗，另1例用Dx合并Mc治疗，临床随访发现均无效。在17例阴性患者中，8例用Dx治疗，5例用Mc治疗，另4例用Dx合 并Mc治疗，结果均有效。
三、讨论
目前常用微量肉汤稀释法筛选Uu耐药菌株，但存在一些不足，如结果判断有一定主观性、检测时间长等[3]，限制了其对临床的指导意义。我们应用PCR检 测tetM基因，结果TcRUu标准菌株均出现阳性扩增带，而TcSUu及金黄色葡萄球菌标 准菌株均为阴性；扩增产物酶切后可出现三个特异性片段，与文献报道一致；说明本文检测 tetM基因的方法是准确、可靠的。
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比较PCR法与微量肉汤稀释法检测临床Uu菌株发现两者有很高的符合率，微量肉汤稀释法鉴 定为Tc敏感的Uu，tetM基因均阴性，而微量肉汤稀释法鉴定为Tc耐药的Uu，tetM基因均阳性 。因此，PCR检测tetM基因不仅能准确反映Uu对四环素的耐药，而且克服了微量肉汤稀释法的缺点。Kenny等[5]报道tetM基因阳性的TcRUu同时对Dx和 Mc耐药，认为tetM基因诱导Dx和Mc的耐药。我们的研究证实了上述观点，tetM基因阳性的Tc RUu菌株对Dx和Mc耐药，tetM基因阴性的TcSUu对Dx和Mc敏感。本研究同时将PCR检 测结果和临床疗效进行了追踪观察，表明tetM基因和临床疗效有关。但本研究的病例有限， 对于是否能用PCR检测tetM基因来指导NGU的临床用药尚有待进一步研究。
参考文献
1 Robertson JA, Taylor DE. Characterization of tetracyclin -resistant strains of Ureaplasma urealyticum. J Antimicrob Chem other, 1988,21∶319-332.
, 百拇医药
2 吴移谋, 余敏军, 刘腾飞, 等. 六种抗菌药物体外对解脲支原体与人型支原体 的抗菌作用. 中华皮肤科杂志, 1994,27∶134-135.
3 Waites KB, Duffy LB, Simeka JW, et al. Comparison of agar versus broth dilution techniques for determining antibiotic susceptibilities of Ureaplasma ur ealyticum. Diagn Microbiol Infect Dis, 1991,14∶265-272.
4 Blanchard A,Crabb DM, Dybvig K, et al. Rapid detection of tet(M) in [ WTBX Myc oplasma hominis and Ureaplasma urealyticum by PCR: tet(M ) confers resistance to tetracycline but not necessarily to doxycycline. FEMS Mi crobiol Lett, 1992,95∶277-282.
5 Kenny GE, Cartwright FD. Susceptibilities of Mycoplasma hominis , Mycopl asme pneumonice,and Ureaplasma urealyticum to new glycyl cyclines in comparison with those to older tetracyclines. Antimicrob Agents Chem other, 1994,38∶2628-2632., http://www.100md.com
单位：510063 广州，中山医科大学第三附属医院皮肤科[朱慧兰(现在广州市皮肤性病防治所) 徐广坤 赖维 陆春 陈荣章]
关键词：
中国皮肤科杂志980325 近年来对解脲支原体(Uu)的耐药性研究表明，tetM基因是介导Uu对四环素耐药的唯一基因[1]。能否用检测tetM基因来反映Uu对四环素或四环素类其它抗生素的耐药性尚不清楚。本研究应用聚合酶链反应(PCR)方法检测tetM基因，并将其结果与微量肉汤稀释法检测药物敏感性及临床疗效进行综合分析，以图明确tetM基因在Uu耐药性中的作用。
一、材料与方法
(一)材料：
, http://www.100md.com 1.实验菌株：2株Uu标准菌株(血清型8TcS和血清型9TcR，由加拿大Albata大学Robertso n教授赠送)，1株金黄色葡萄球菌标准菌株(由中山医科大学微生物教研室提供)，54株Uu是 从我科STD门诊非淋菌性尿道炎(NGU)患者的尿道或宫颈拭子分离的临床株[2 ，3]。
2.Uu选择性培养基：Uu液体培养基含1∶1牛心消化液、20%新鲜小牛血清、10%新鲜酵母浸液、0.1%尿素、0.002%酚红、2万U/ml青霉素，pH5.6～6.0。Uu固体培养基是在液体培养基基础上加1.2%琼脂。以上试剂均由中山医科大学免疫学教研室提供。
3.药物及主要试剂：标准品盐酸四环素(Tc)和强力霉素(Dx，Sigma公司)，美满霉素(Mc)(美国立达大药厂)。溶菌酶和蛋白酶K(Sigma公司)，Taq DNA聚合酶和限制性内切酶TaqⅠ(北京遗传所)。
, 百拇医药
4.引物：序列为5′-TTATCAACGGTTTATCAGG-3′和5′-CGTATATATGCAAGACG-3′ [4]，由中山医科大学遗传教研室负责合成。
5.临床资料：从上述54例NGU患者中，筛选单纯Uu感染引起的并首选四环素类抗生素(Dx或Mc )治疗的病例资料21份。治疗方案：Dx或Mc 0.1每日2次，7～14天，停药一周后随访。疗效判断标准：①有效：症状、体征消失，Uu检查阴性，尿道或宫颈拭子涂片在1000倍显微镜下多形核白细胞≤4个；②无效：病情好转或无变化，但Uu检查仍阳性。
(二)实验方法：
1.微量肉汤稀释法检测药物MIC[3]：Tc、Dx及Mc标准品40mg制 备成原浓度为4096μg/ml的药液，取96孔酶标板，每孔反应体积为200μl，每孔由25μl含不同浓度的药物(浓度梯度为0.25～512μg/ml)和25μl菌液(103ccu/ml)。每次试验时使用标准菌株和设置对照孔。混匀后置于烛缸，37℃，孵育48小时观察结果。
, http://www.100md.com
2.结果判定：按照NCCLS标准，Tc、Dx和Mc的敏感、中敏、耐药标准分别为MIC≤4μg/ml、M IC＝8μg/ml、MIC≥16μg/ml[4]。
3.DNA的抽提：采用酚-氯仿抽提法。
4.PCR扩增及酶切：反应总体积50μl，扩增条件为94℃ 25秒，50℃ 60秒，72℃ 60秒，共4 0个循环(PE-480型扩增仪)。取产物10μl用2%琼脂糖凝胶进行电泳，另取产物20μl用Taq Ⅰ酶消化，然后进行电泳分析。
二、结果
(一)PCR检测tetM基因的特异性、敏感性及重复性：用上述引物对TcRUu和TcSUu及金黄色葡萄球菌标准菌株的DNA进行扩增，结果TcRUu标准菌株出现阳性扩增带，而TcSU u及金黄色葡萄球菌标准菌株没有扩增带(见图1)。扩增产物用TaqⅠ酶切后可产生三个特异性片段，其大小分别为190bp、130bp、77bp(见图2)。以10倍连续稀释的TcRUu标准菌株D NA(10ng～1fg)为模板，进行扩增，结果在10ng～102pg处可见阳性扩增带，而在102p g以下未见阳性扩增带，说明本方法敏感性为102pg，约相当于1.2×102个Uu。分别以TcRUu和TcSUu标准菌株的DNA为模板重复进行扩增，结果如前
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MpGEM-7zf/HaeⅢ
1：TcSUu，2 ：TcRUu，3： 金黄色葡萄球菌
图1 PCR引物的特异性
Mp GEM-7zf/HaeⅢ
1：酶切结果，2 ：扩增产物，3：阴性对照
图2 PCR产物的特异性
述。
(二)PCR检测tetM基因和微量肉汤稀释法检测MIC比较：54株临床Uu菌株的MICs范 围为≤0.25～256μg/ml，其中7株为Tc耐药、11株为Tc中敏、36株为Tc敏感。PCR检测结果 9株tetM基因阳性，45株tetM基因阴性。对上述两种检测方法的结果比较发现，7株微量肉汤 稀释法鉴定为Tc耐药，其PCR结果均阳性；而36株微量肉汤稀释法鉴定为Tc敏感，PCR结果均阴性；另外，微量肉汤稀释法鉴定为Tc中敏的11株Uu中，2株tetM阳性，9株tetM阴性。
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同时用微量肉汤稀释法检测9株tetM阳性和7株tetM阴性Uu对Dx和Mc的敏感性，结果发现在Te tM阳性的9株Uu中7株对Dx、Mc耐药(MICs≥16μg/ml)，2株对Dx、Mc中敏(MIC=8μg/ml)。7株tetM阴性的Uu对Dx和Mc均敏感。
(三)PCR检测tetM基因结果与临床疗效的比较：从54例NGU患者中筛选出21例单纯Uu感染者，并对用四环素类抗生素治疗的临床资料进行分析，其中tetM阳性4例，阴性17例。在阳性的4例患者(其中包括1株Tc、Dx和Mc中敏)中，2例用Dx治疗，1例用Mc治疗，另1例用Dx合并Mc治疗，临床随访发现均无效。在17例阴性患者中，8例用Dx治疗，5例用Mc治疗，另4例用Dx合 并Mc治疗，结果均有效。
三、讨论
目前常用微量肉汤稀释法筛选Uu耐药菌株，但存在一些不足，如结果判断有一定主观性、检测时间长等[3]，限制了其对临床的指导意义。我们应用PCR检 测tetM基因，结果TcRUu标准菌株均出现阳性扩增带，而TcSUu及金黄色葡萄球菌标 准菌株均为阴性；扩增产物酶切后可出现三个特异性片段，与文献报道一致；说明本文检测 tetM基因的方法是准确、可靠的。
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比较PCR法与微量肉汤稀释法检测临床Uu菌株发现两者有很高的符合率，微量肉汤稀释法鉴 定为Tc敏感的Uu，tetM基因均阴性，而微量肉汤稀释法鉴定为Tc耐药的Uu，tetM基因均阳性 。因此，PCR检测tetM基因不仅能准确反映Uu对四环素的耐药，而且克服了微量肉汤稀释法的缺点。Kenny等[5]报道tetM基因阳性的TcRUu同时对Dx和 Mc耐药，认为tetM基因诱导Dx和Mc的耐药。我们的研究证实了上述观点，tetM基因阳性的Tc RUu菌株对Dx和Mc耐药，tetM基因阴性的TcSUu对Dx和Mc敏感。本研究同时将PCR检 测结果和临床疗效进行了追踪观察，表明tetM基因和临床疗效有关。但本研究的病例有限， 对于是否能用PCR检测tetM基因来指导NGU的临床用药尚有待进一步研究。
参考文献
1 Robertson JA, Taylor DE. Characterization of tetracyclin -resistant strains of Ureaplasma urealyticum. J Antimicrob Chem other, 1988,21∶319-332.
, 百拇医药
2 吴移谋, 余敏军, 刘腾飞, 等. 六种抗菌药物体外对解脲支原体与人型支原体 的抗菌作用. 中华皮肤科杂志, 1994,27∶134-135.
3 Waites KB, Duffy LB, Simeka JW, et al. Comparison of agar versus broth dilution techniques for determining antibiotic susceptibilities of Ureaplasma ur ealyticum. Diagn Microbiol Infect Dis, 1991,14∶265-272.
4 Blanchard A,Crabb DM, Dybvig K, et al. Rapid detection of tet(M) in [ WTBX Myc oplasma hominis and Ureaplasma urealyticum by PCR: tet(M ) confers resistance to tetracycline but not necessarily to doxycycline. FEMS Mi crobiol Lett, 1992,95∶277-282.
5 Kenny GE, Cartwright FD. Susceptibilities of Mycoplasma hominis , Mycopl asme pneumonice,and Ureaplasma urealyticum to new glycyl cyclines in comparison with those to older tetracyclines. Antimicrob Agents Chem other, 1994,38∶2628-2632., http://www.100md.com