淋球菌营养型与耐药性及质粒的关系
作者：吴红 朱道银
单位：400016 重庆医科大学微生物学教研室
关键词：淋病奈瑟菌；营养型；微生物敏感性试验；质粒
中国皮肤科杂志980310 【摘要】目的 为了解淋球菌的营养型、耐药性及质粒之间的关系。方法 对重庆市收集的83株淋球菌进行营养型 、抗生素敏感性和质粒检测。结果 83株菌共分为8个营养型，以 Pro-型(51.8%)和Proto型(18.1%)为主。利用琼脂稀释法检测菌株对青霉素、四环素和 壮观霉素的敏感性。青霉素耐药株占15.6%，四环素耐药株占70%，壮观霉素耐药株占1.2% 。通过快速碱裂解法对其中的44株菌进行质粒检测，70%菌株含24.5Md质粒，80%含2.6Md 质粒，66%同时含24.5Md和2.6Md质粒，16%未查到质粒。并发现Pro-型菌株中青霉素耐药株高于其它营养型(P<0.05)，且含24.5Md质粒菌也显著高于其它营养 型(P<0.05)。含24.5Md+2.6Md质粒菌株中四环素耐药株更常见(P<0.05)。检测到1株产青霉素酶淋球菌(PPNG)，经质粒消除试验证实其耐药性 由4.4Md质粒介导。结论 本研究不仅表明了重庆地区淋球菌营养型、耐药性及质粒的分布状况，而且揭示了它们之间存在一定关系。这将对该地区淋球菌的流行病学调查和淋病防治提供帮助。
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Relationship Between Auxotypes,Antibiotic Susceptibilities and P lasmid of Neisseria Gonorrhoeae Wu Hong, Zhu Daoyin. Departmen t of Microbiology,Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400016
【Abstrant】 Objective To investigate the relationship between auxotypes,antib iotic resistance and plasmid of Neisseria gonorrhoeae. M ethods 83 isolates of Neisseria gon orrhoeae from Chongqing during the period from January 1994 to November 1995 were examined.Results Eight auxotypes were detected in 8 3 strains. The prevalent auxo types were proline-requiring strains (51.8%) and nonrequiring (18.1%). The agar dilution method was performed to detect the susceptibility of 83 isolates to pe ncillin,tetracycline and spectinomycin, the res ults indi cated that 15.6% of strains was penicillin resistant,70% was tetracycline resist ant, 1.2% was spectinomycin resistant. Plasmid profile of 44 isolates,which was t ested by rapid alkaline extraction method, showed that 70% of the strains car rie d 24.5 Md conjugative plasmid, 80% carried 2.6Md cryptic plasmid, 66% carried bo th 24 .5Md and 2.6Md plasmids, and no plasmid was found in 16% of the strains. In Pro- strains both pen icillin resistant strains and 24.5Md plasmid carrying strains were more common t han other auxotypes (P<0.05). Tetracycline resistant strains wer e more common in than other strains ( P<0.05) in strains containing 24.5Md and 2.6Md plasmids. One (P PNG) strain was d etected and its 4.4Md plasmid encoding β-lactamase was determined by plasmid e li mination test. Conclusion This study shows not only the distri bution of auxoty pes,antibiotic resistance and plasmid profile, but also suggests certain relati onship between them. It may be helpful in the epidemiological sur vey as well as control of gonorrhea in that area.
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【Key words】 Neisseria genorrhoeae Auxotype Microbial se nsitivity tests Plasmid
淋球菌营养分型是根据菌株生长对氨基酸、碱基等营养物质的需求不同而进行分型的一种方法，广泛用于淋球菌流行病学调查。我们对重庆地区淋球菌作了这方面调查 ，以作淋病防治的重要参考。
材料和方法
(一)菌株来源：于1994年1月至1995年11月从本校第一附属医院门诊病例中分离。83株菌中来自男性63株，女性20株。常规分离培养及鉴定，置甘油胰酶大豆肉汤中-70℃保存。
(二)营养分型：方法详见文献[1]，即分别制备完全的NEDA(Neisseria-defined agar) 和不完全NEDA培养基。6种不完全NEDA分别从完全NEDA中抽去以下成分：精氨酸(Arg)、脯氨 酸(Pro)、甲硫氨酸(Met)、半胱氨酸和胱氨酸(Cys)、尿嘧啶(Ura)、次黄嘌呤(Hyx)。接种 约103～104cfu的细菌于各不完全及完全NEDA和淋球菌分离培养基(对照)，37℃烛 缸培养48小时观察结果。在完全培养基上生长，而在缺乏某一成分的培养基上不生长为某一 营养缺陷型，分别记为Arg-、Pro-、Met-、Cys-、Ura-、Hyx-型。在所有营养 分型培养基上均生长者为原养型即Proto(non-requiring)。
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(三)抗生素敏感性检测：采用琼脂倍比稀释法测定药物的最低抑菌浓度(MIC)。测定的药物 浓度为青霉素4～0.015mg/L，四环素为16～0.125mg/L，壮观霉素为128～2mg/L。将青霉 素MIC≥1mg/L、四环素MIC≥2mg/L、壮观霉素MIC≥64mg/L定为耐药。采用WHO标准菌株A、B 、C、D、E作为质控菌株。
(四)青霉素酶的测定：采用纸片酸度定量法测定。用产酶金黄色葡萄球菌作阳性对照。
(五)质粒检测：采用快速碱裂解法提取质粒[2]。
(六)质粒消除试验[3]：在含次MIC氟哌酸的肉汤管中加入细菌10 3～102cfu/ml，培养24小时后，影印培养在含4mg/L青霉素培养基不生长、在不含药培养基上生长的菌落为失去耐药质粒的菌落。并测其β-内酰胺酶和提取质粒以观察质粒带变化。
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结 果
(一)营养分型：83株淋球菌共分8个营养型，其中Pro-型43株(51.8%)，P roto型15株(18.1%)，Arg-型7株(8.5%)，Pro-Hyx-型6株(7.2%)，Pro-Arg -型6株(6%)、Pro-Arg-Hyx-型3株(3.6%)，Hyx-2株(2.4%)，Arg-Hyx-2株( 2.4%)。所有菌株生长均需Cys。营养型分布无患者性别差异。
(二)药物的敏感性测定结果：83株淋球菌中，青霉素耐药株占15.6%，四环素耐药株为70% ，壮观霉素耐药株为1.2%。所有菌株的MIC分布见附表。检测到一株PPNG，其青霉素MIC≥8 mg/L。
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附表 83株淋球菌对抗生素的MIC 抗生素
抗生素浓度(mg/L)
0.03
0.06
0.125
0.25
0 .5
1
2
4
8
16
32
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64
128
青霉素
6
4
18
25
17
4
4
2
3
0
0
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0
0
四环素
0
0
6
1
4
14
8
19
21
10
0
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0
0
壮观霉素
0
0
0
0
0
0
4
18
30
28
2
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0
1
(三)质粒分布概况：对83株淋球菌中的44株进行质粒检测，共分6种质 粒类型，即24.5+2.6Md(Megadalton)；24.5Md；2.6Md；25.2+2.6Md；24.5+4.4Md 和不含质粒菌株。含24.5Md菌株占70%，含2.6Md菌株为80%，无质粒菌为16%，同时含24. 5+2.6Md菌株占66%，含25.2+2.6Md和24.5+4.4Md菌各一株。含24.5+4.4Md菌为PPNG 。 (四)营养型与耐药性的关系：83株淋球菌中，Pro-型43株，其它营养型40株，其中青霉素 耐药菌分别为10株和3株，说明青霉素耐药株主要分布在Pro-型中，经χ2检验有显著性差异(χ2=3.894，P<0.05)。四环素耐药株广泛 分布于各营养型中，无明显型别差异。耐壮观霉素和PPNG各一株均为Pro-型。
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(五)营养型与质粒的关系：经质粒检测的44株菌中，Pro-型19株，其中含24.5Md质粒17 株，其它营养型的菌株共25株含24.5Md质粒14株，经χ2检验显示Pro -型菌株含24.5Md质粒显著高于其它型别(χ2=5.8109，P<0.05) 。
(六)质粒与耐药性关系：经质粒检测的44株菌中，含24.5+2.6Md质粒菌29株，其它质粒类 型菌株为15株，它们中四环素耐药株分别为18株和4株，经χ2检验显 示含24.5+2.6Md质粒菌中四环素耐药性增加(χ2=4.956，P<0.05) 。
1株PPNG经质粒消除后，β-内酰胺酶试验转阴、青霉素MIC<0.5mg/L，质粒分析该菌仅含2 4.5Md质粒带，4.4Md带消失。
讨 论
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Catlin于1973年首先建立起较完整的营养分型方法，该方法稳定、重复性好 ，已广泛用于淋球菌的分类。如同时进行耐药性和质粒检测，则更能精确反映菌株的流行病学特征，并对淋病的监测、治疗和评估疗效提供可靠依据。本文营养分型以Pro-型和Proto型为主，分布类似东南亚地区。而在欧美则以AHU-(Arg-Hyx-Ura-)为主，近年日本AHU菌株有上升趋势[4]。我们未检测到AHU-菌株，与叶顺章 等[5]发现一致。
1992年本室报道了重庆地区营养型中Pro-、Proto型分别为25%、12.5%[6 ]；1995年即本次试验检出它们各增至51.8%、18.1%，特别是Pro-型增长最 多，经较长时间的观察，推测Pro-型为本地区持续存在菌株，可在本地区广泛传播。
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本地区淋球菌四环素耐药株多达70%。这可能与临床上用四环素治疗淋病和沙眼衣原体感染 有关。青霉素耐药株1990年为21.1%，本次检测为15.6%。青霉素耐药性无明显增加趋势，可能与近年少用青霉素治疗淋病有关。PPNG从1990年的7.1%降至现在的1.2%。日本近年也报道PPNG下降，认为可能与广泛使用喹诺酮类抗菌药有关。壮观霉素耐药菌少见，提示临床上仍可首选壮观霉素治疗淋病。
我们仅发现1株PPNG，经质粒消除后，β-内酰胺酶转阴，青霉素MIC<0.5mg/L，4.4Md质 粒带消失，说明4.4Md质粒为青霉素耐药质粒属亚洲型质粒。消除质粒后变为青霉素敏感株 ，揭示该菌株耐药仅由质粒介导，与染色体突变无关。
多数研究认为AHU-菌株大多对青霉素和四环素高度敏感，PCU-(Pro-Cit-Ura-；C it瓜氨酸)菌株对青霉素中度敏感，其它型别的抗生素敏感性依各地区而异[7 ]。本文结果显示Pro-菌株青霉素耐药性显著高于其他型别，这可能与本地区P ro-型菌株广泛流行有一定关系。
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据报道PPNG多属Pro-型和Proto型，含3.2Md质凿PPNG常为Proto型；含4.4Md质粒PPNG常 为Pro-型[8]。本试验发现1株PPNG，含4.4Md质粒属Pro-型 。本试验还发现Pro-菌株含 24.5Md质粒的比例显著高于其它型别，这使得重庆优势菌Pr o-型菌株中青霉素耐药质粒更易在细菌间传播。
参考文献
1 Catlin BW. Nutritional profiles of Neisseria gon orrhoeae, Neisseria meningitidis and Neisseria lactamica in chemically d efined media and the use of growth requirements for gonococcal typing. J Infect Dis, 1973,128∶178-194.
, 百拇医药
2 J.萨姆布鲁克. 分子克隆实验指南. 北京: 科学出版社, 1992.19.
3 李立津, 王哲, 胡文芝. 氟哌酸和黄连素对志贺氏菌耐药质粒消除研究. 中华传 染病杂志, 1994,12∶4-7.
4 Nishimura M, Kumamoto Y, Hirose T, et al. Bacteriologic studies on Neis seria gonorrhoeae isolated in Sapporo, Japan: Investigation of β-lacta mase production and auxotypes. Sex Transm Dis, 1991,18∶80-83.
5 叶顺章, 王千秋, 张传福, 等. 淋球菌营养分型方法的建立和72株淋球菌的分型 结果. 中华皮肤科杂志, 1993,26∶139-141.
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6 朱道银, 王毅, 李伟, 等. 重庆市淋球菌营养型分布与变化. 中华微生物学和免 疫学杂志, 1993,13∶25-26.
7 Agarwal SK, Deb M, Prakash K, et al. Auxotyping of Neisseria go norrhoea e as an additional epidemiological marker. Indian J Med Res, 1992,95∶22 7-229.
8 Lind I, Arborio M, Bentzon MW, et al. The epidemiology of Neiss eria gon orrhoeae isolates in Dakar, Senegal 1982-1986: antimicrobial resistance , auxotypes and plasmid profiles. Genitourn Med, 1991,67∶107-113., http://www.100md.com
单位：400016 重庆医科大学微生物学教研室
关键词：淋病奈瑟菌；营养型；微生物敏感性试验；质粒
中国皮肤科杂志980310 【摘要】目的 为了解淋球菌的营养型、耐药性及质粒之间的关系。方法 对重庆市收集的83株淋球菌进行营养型 、抗生素敏感性和质粒检测。结果 83株菌共分为8个营养型，以 Pro-型(51.8%)和Proto型(18.1%)为主。利用琼脂稀释法检测菌株对青霉素、四环素和 壮观霉素的敏感性。青霉素耐药株占15.6%，四环素耐药株占70%，壮观霉素耐药株占1.2% 。通过快速碱裂解法对其中的44株菌进行质粒检测，70%菌株含24.5Md质粒，80%含2.6Md 质粒，66%同时含24.5Md和2.6Md质粒，16%未查到质粒。并发现Pro-型菌株中青霉素耐药株高于其它营养型(P<0.05)，且含24.5Md质粒菌也显著高于其它营养 型(P<0.05)。含24.5Md+2.6Md质粒菌株中四环素耐药株更常见(P<0.05)。检测到1株产青霉素酶淋球菌(PPNG)，经质粒消除试验证实其耐药性 由4.4Md质粒介导。结论 本研究不仅表明了重庆地区淋球菌营养型、耐药性及质粒的分布状况，而且揭示了它们之间存在一定关系。这将对该地区淋球菌的流行病学调查和淋病防治提供帮助。
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Relationship Between Auxotypes,Antibiotic Susceptibilities and P lasmid of Neisseria Gonorrhoeae Wu Hong, Zhu Daoyin. Departmen t of Microbiology,Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400016
【Abstrant】 Objective To investigate the relationship between auxotypes,antib iotic resistance and plasmid of Neisseria gonorrhoeae. M ethods 83 isolates of Neisseria gon orrhoeae from Chongqing during the period from January 1994 to November 1995 were examined.Results Eight auxotypes were detected in 8 3 strains. The prevalent auxo types were proline-requiring strains (51.8%) and nonrequiring (18.1%). The agar dilution method was performed to detect the susceptibility of 83 isolates to pe ncillin,tetracycline and spectinomycin, the res ults indi cated that 15.6% of strains was penicillin resistant,70% was tetracycline resist ant, 1.2% was spectinomycin resistant. Plasmid profile of 44 isolates,which was t ested by rapid alkaline extraction method, showed that 70% of the strains car rie d 24.5 Md conjugative plasmid, 80% carried 2.6Md cryptic plasmid, 66% carried bo th 24 .5Md and 2.6Md plasmids, and no plasmid was found in 16% of the strains. In Pro- strains both pen icillin resistant strains and 24.5Md plasmid carrying strains were more common t han other auxotypes (P<0.05). Tetracycline resistant strains wer e more common in than other strains ( P<0.05) in strains containing 24.5Md and 2.6Md plasmids. One (P PNG) strain was d etected and its 4.4Md plasmid encoding β-lactamase was determined by plasmid e li mination test. Conclusion This study shows not only the distri bution of auxoty pes,antibiotic resistance and plasmid profile, but also suggests certain relati onship between them. It may be helpful in the epidemiological sur vey as well as control of gonorrhea in that area.
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【Key words】 Neisseria genorrhoeae Auxotype Microbial se nsitivity tests Plasmid
淋球菌营养分型是根据菌株生长对氨基酸、碱基等营养物质的需求不同而进行分型的一种方法，广泛用于淋球菌流行病学调查。我们对重庆地区淋球菌作了这方面调查 ，以作淋病防治的重要参考。
材料和方法
(一)菌株来源：于1994年1月至1995年11月从本校第一附属医院门诊病例中分离。83株菌中来自男性63株，女性20株。常规分离培养及鉴定，置甘油胰酶大豆肉汤中-70℃保存。
(二)营养分型：方法详见文献[1]，即分别制备完全的NEDA(Neisseria-defined agar) 和不完全NEDA培养基。6种不完全NEDA分别从完全NEDA中抽去以下成分：精氨酸(Arg)、脯氨 酸(Pro)、甲硫氨酸(Met)、半胱氨酸和胱氨酸(Cys)、尿嘧啶(Ura)、次黄嘌呤(Hyx)。接种 约103～104cfu的细菌于各不完全及完全NEDA和淋球菌分离培养基(对照)，37℃烛 缸培养48小时观察结果。在完全培养基上生长，而在缺乏某一成分的培养基上不生长为某一 营养缺陷型，分别记为Arg-、Pro-、Met-、Cys-、Ura-、Hyx-型。在所有营养 分型培养基上均生长者为原养型即Proto(non-requiring)。
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(三)抗生素敏感性检测：采用琼脂倍比稀释法测定药物的最低抑菌浓度(MIC)。测定的药物 浓度为青霉素4～0.015mg/L，四环素为16～0.125mg/L，壮观霉素为128～2mg/L。将青霉 素MIC≥1mg/L、四环素MIC≥2mg/L、壮观霉素MIC≥64mg/L定为耐药。采用WHO标准菌株A、B 、C、D、E作为质控菌株。
(四)青霉素酶的测定：采用纸片酸度定量法测定。用产酶金黄色葡萄球菌作阳性对照。
(五)质粒检测：采用快速碱裂解法提取质粒[2]。
(六)质粒消除试验[3]：在含次MIC氟哌酸的肉汤管中加入细菌10 3～102cfu/ml，培养24小时后，影印培养在含4mg/L青霉素培养基不生长、在不含药培养基上生长的菌落为失去耐药质粒的菌落。并测其β-内酰胺酶和提取质粒以观察质粒带变化。
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结 果
(一)营养分型：83株淋球菌共分8个营养型，其中Pro-型43株(51.8%)，P roto型15株(18.1%)，Arg-型7株(8.5%)，Pro-Hyx-型6株(7.2%)，Pro-Arg -型6株(6%)、Pro-Arg-Hyx-型3株(3.6%)，Hyx-2株(2.4%)，Arg-Hyx-2株( 2.4%)。所有菌株生长均需Cys。营养型分布无患者性别差异。
(二)药物的敏感性测定结果：83株淋球菌中，青霉素耐药株占15.6%，四环素耐药株为70% ，壮观霉素耐药株为1.2%。所有菌株的MIC分布见附表。检测到一株PPNG，其青霉素MIC≥8 mg/L。
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附表 83株淋球菌对抗生素的MIC 抗生素
抗生素浓度(mg/L)
0.03
0.06
0.125
0.25
0 .5
1
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青霉素
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(三)质粒分布概况：对83株淋球菌中的44株进行质粒检测，共分6种质 粒类型，即24.5+2.6Md(Megadalton)；24.5Md；2.6Md；25.2+2.6Md；24.5+4.4Md 和不含质粒菌株。含24.5Md菌株占70%，含2.6Md菌株为80%，无质粒菌为16%，同时含24. 5+2.6Md菌株占66%，含25.2+2.6Md和24.5+4.4Md菌各一株。含24.5+4.4Md菌为PPNG 。 (四)营养型与耐药性的关系：83株淋球菌中，Pro-型43株，其它营养型40株，其中青霉素 耐药菌分别为10株和3株，说明青霉素耐药株主要分布在Pro-型中，经χ2检验有显著性差异(χ2=3.894，P<0.05)。四环素耐药株广泛 分布于各营养型中，无明显型别差异。耐壮观霉素和PPNG各一株均为Pro-型。
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(五)营养型与质粒的关系：经质粒检测的44株菌中，Pro-型19株，其中含24.5Md质粒17 株，其它营养型的菌株共25株含24.5Md质粒14株，经χ2检验显示Pro -型菌株含24.5Md质粒显著高于其它型别(χ2=5.8109，P<0.05) 。
(六)质粒与耐药性关系：经质粒检测的44株菌中，含24.5+2.6Md质粒菌29株，其它质粒类 型菌株为15株，它们中四环素耐药株分别为18株和4株，经χ2检验显 示含24.5+2.6Md质粒菌中四环素耐药性增加(χ2=4.956，P<0.05) 。
1株PPNG经质粒消除后，β-内酰胺酶试验转阴、青霉素MIC<0.5mg/L，质粒分析该菌仅含2 4.5Md质粒带，4.4Md带消失。
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Catlin于1973年首先建立起较完整的营养分型方法，该方法稳定、重复性好 ，已广泛用于淋球菌的分类。如同时进行耐药性和质粒检测，则更能精确反映菌株的流行病学特征，并对淋病的监测、治疗和评估疗效提供可靠依据。本文营养分型以Pro-型和Proto型为主，分布类似东南亚地区。而在欧美则以AHU-(Arg-Hyx-Ura-)为主，近年日本AHU菌株有上升趋势[4]。我们未检测到AHU-菌株，与叶顺章 等[5]发现一致。
1992年本室报道了重庆地区营养型中Pro-、Proto型分别为25%、12.5%[6 ]；1995年即本次试验检出它们各增至51.8%、18.1%，特别是Pro-型增长最 多，经较长时间的观察，推测Pro-型为本地区持续存在菌株，可在本地区广泛传播。
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本地区淋球菌四环素耐药株多达70%。这可能与临床上用四环素治疗淋病和沙眼衣原体感染 有关。青霉素耐药株1990年为21.1%，本次检测为15.6%。青霉素耐药性无明显增加趋势，可能与近年少用青霉素治疗淋病有关。PPNG从1990年的7.1%降至现在的1.2%。日本近年也报道PPNG下降，认为可能与广泛使用喹诺酮类抗菌药有关。壮观霉素耐药菌少见，提示临床上仍可首选壮观霉素治疗淋病。
我们仅发现1株PPNG，经质粒消除后，β-内酰胺酶转阴，青霉素MIC<0.5mg/L，4.4Md质 粒带消失，说明4.4Md质粒为青霉素耐药质粒属亚洲型质粒。消除质粒后变为青霉素敏感株 ，揭示该菌株耐药仅由质粒介导，与染色体突变无关。
多数研究认为AHU-菌株大多对青霉素和四环素高度敏感，PCU-(Pro-Cit-Ura-；C it瓜氨酸)菌株对青霉素中度敏感，其它型别的抗生素敏感性依各地区而异[7 ]。本文结果显示Pro-菌株青霉素耐药性显著高于其他型别，这可能与本地区P ro-型菌株广泛流行有一定关系。
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据报道PPNG多属Pro-型和Proto型，含3.2Md质凿PPNG常为Proto型；含4.4Md质粒PPNG常 为Pro-型[8]。本试验发现1株PPNG，含4.4Md质粒属Pro-型 。本试验还发现Pro-菌株含 24.5Md质粒的比例显著高于其它型别，这使得重庆优势菌Pr o-型菌株中青霉素耐药质粒更易在细菌间传播。
参考文献
1 Catlin BW. Nutritional profiles of Neisseria gon orrhoeae, Neisseria meningitidis and Neisseria lactamica in chemically d efined media and the use of growth requirements for gonococcal typing. J Infect Dis, 1973,128∶178-194.
, 百拇医药
2 J.萨姆布鲁克. 分子克隆实验指南. 北京: 科学出版社, 1992.19.
3 李立津, 王哲, 胡文芝. 氟哌酸和黄连素对志贺氏菌耐药质粒消除研究. 中华传 染病杂志, 1994,12∶4-7.
4 Nishimura M, Kumamoto Y, Hirose T, et al. Bacteriologic studies on Neis seria gonorrhoeae isolated in Sapporo, Japan: Investigation of β-lacta mase production and auxotypes. Sex Transm Dis, 1991,18∶80-83.
5 叶顺章, 王千秋, 张传福, 等. 淋球菌营养分型方法的建立和72株淋球菌的分型 结果. 中华皮肤科杂志, 1993,26∶139-141.
, http://www.100md.com
6 朱道银, 王毅, 李伟, 等. 重庆市淋球菌营养型分布与变化. 中华微生物学和免 疫学杂志, 1993,13∶25-26.
7 Agarwal SK, Deb M, Prakash K, et al. Auxotyping of Neisseria go norrhoea e as an additional epidemiological marker. Indian J Med Res, 1992,95∶22 7-229.
8 Lind I, Arborio M, Bentzon MW, et al. The epidemiology of Neiss eria gon orrhoeae isolates in Dakar, Senegal 1982-1986: antimicrobial resistance , auxotypes and plasmid profiles. Genitourn Med, 1991,67∶107-113., http://www.100md.com