解脲支原体对七种抗菌药物的敏感性测定及其与相关耐药基因检测的比较
作者：骆丹 黄澍杰 谢礼豪 汪宁 朱文元 徐文严
单位：
关键词：解脲支原体；微生物敏感性试验
中国皮肤科杂志980307 【摘要】目的 以肉汤稀释法对解脲支原体(Uu)进 行7种抗菌药物的敏感性测定，并与聚合酶链反应(PCR)方法检测四环素耐药决定子的结果进 行比较，探讨其临床及实验意义。方法 42个Uu分离株经三次传 代成纯培养物后接种于96孔板小孔中，药液倍比稀释成64μg/ml～0.06μg/ml，37℃培养 ，加药组以72小时后仍不出现培养基由黄→红色变化的最小药物浓度为该药的最小抑菌浓度 (MIC)。根据tetM基因序列设计引物，采用PCR方法进行扩增，并对PCR产物进行酶切消化反应。结果 四环素抗菌活性较差，MIC≥8μg/ml以上的中度敏感 有12株，且美满霉素、强力霉素的MIC也多达8μg/ml与4μg/ml。尚未发现对三类抗菌药同时耐药的Uu分离株。42个Uu株的tetM阳性检测率为71.4%，除1例外均出现预期酶解片段。 结论 ①Uu分离株对四环素族药敏性较差，临床上经四环素类反 复治疗难以阴转，并有症状的Uu感染病例可换用另外两类抗支原体药物；②载有tetM的Uu株 可能成为耐药株，应结合MIC进行监测及随访。
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Study on Susceptibility of Ureaplasm a Urealyticum to Antimicrobial Agents and tetM Gene Detection Luo Dan, Huang Shujie, Xie Lihao, et al. Department of Dermatology, The First Affiliated Hospital, Nanjing Medical University, Nanjing 210029
【Abstract】 Objective To determine the susceptibility of Ureaplasma urealyticum(Uu) to 7 kinds of antimicrobial agents, to compare the result with tetracycline resistant determ inant(tetM) detected by PCR technique.Methods Forty-two Uu isolates were subcultured for 3 generations and then cultured with drugs with a series of concentrations from 64μg/ml ～ 0.06 μg/ml. MIC was determined when the color of culture medium did not change f rom yellow to red in 72h culture. The tetM determinant in the isolates was detected by PCR wit h specific primers, and PCR products were digest ed by Taq-1 restrictive endonuclease. Res ul ts The antimicrobial activity of tetracyclines to Uu was low. No Uu str ains resistant simultaneously to 3 groups of antibiotics were found in the stud y . Detection rate of tetM was 71.4% with correspondent digested fragments. Conclusion The susceptibility of Uu isolates to tetracycline group wa s low, but higher to macrolides and fluoroquinolones. Uu strains carrying t etM determinant might become drug resistant ones which should be monitored and followed up with MIC determination.
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【Key words】 Ureaplasma urealyticum Microbial sensitivity t ests
解脲支原体(Uu)主要寄居于人泌尿生殖道。Uu在非淋菌性尿道炎等疾病中可 能具有一定致病作用。由于解脲支原体缺乏细胞壁，故β-酰胺类抗生素对其无效。由于滥用广谱抗生素，反复感染等因素，Uu对四环素类药物治疗发生抵抗的耐药株不断增加[1～3]。在人型支原体及解脲支原体中，仅有的四环素抗性决定子为t etM，即两种支原体对四环素的耐药可能是因获得tetM耐药决定子后所致[4]。用聚合酶链反应(PCR)技术可快速、灵敏检测耐药基因，这对筛查性病人群中由 Uu、人型支原体(Mh)及生殖支原体(Mg)引起的耐药频率具有实用意义[5]。我们采用MIC及PCR 相结合的实验方法，对Uu进行耐药情况的分析，耐药基因的检测及其产物的酶切分析，现报 道如下。
作者单位：210009 南京医科大学第一附属医院皮肤科(骆丹、 朱文元)；广东省江门市皮肤病防治所(黄澍杰、谢礼豪)；南京铁道医学院流行病教研室(汪 宁)；中国医学科学院、中国协和医科大学皮肤病研究所(徐文严)
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材料和方法
(一)抗菌药物：四环素、红霉素、氧氟沙星由中国生物制品检定所提供；强力霉素、美满霉素、阿奇霉素由美国辉瑞公司提供；环丙沙星由中国药科大学药物研究所提供。药液配制：先根据药物溶解特性溶解原药，再用蒸馏水稀释至2560μg/ml；环丙沙星、氧氟沙星先用1ml氢氧化钠溶解，再用无菌蒸馏水配成2560μg/ml浓度。-20℃保存备用。
(二)Taq DNA聚合酶、dNTPs、PCR标记物及Taq-1限制性内切酶(RE)均购自华美及复华生物 工程公司。
(三)解脲支原体标准株由南京铁道医学院流行病学教研室提供；载有tetM决定子的TRNG标准 株由中国医学科学院皮肤病研究所提供。
(四)标本来源：取泌尿生殖道拭子标本。经临床及检验证实的42例非淋菌性尿道炎(宫颈炎)、前列腺炎的临床Uu分离株，经菌落形态、底物分解、pH值、生长速度初步鉴定，液体传代3次后-20℃短期保存备用。如是直接检测tetM基因的分泌物标本则置于含1ml生理盐水的Eppendorf管中-20℃冻存。
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(五)实验方法：
1.液体培养基稀释法测定MIC：在96孔聚乙烯板上将药液倍比稀释至64～0.06μg/ml，设不 加药物孔为对照。每孔接种103CCU/0.1ml支原体培养物0.1ml，加盖密封，每孔总容积 0.2ml。于24、48、72及96小时观察结果，加药组以72小时仍不出现黄转红颜色变化的最小 药物浓度为最小抑制Uu生长的药物浓度(MIC)。重复实验3次，以3次结果平均数为依据计算M IC范围以及MIC90与MIC50。
2.PCR方法检测tetM决定子：采用裂解液(1% NP-40，1%吐温20，1.5mmol/LMgCl2 ，50mmol/L KCl，50mmol/L Tirs)15分钟煮沸法制备模板DNA。在25μl反应体系中依次加入10×PCR buffer、2mmol/L dNTPs、40μmol/L上下游引物一对、1UTaq-DNA聚合酶、模板 DNA及双蒸水，经94℃ 3分钟预变性后进入PCR循环：94℃ 40秒、50℃ 1分钟、72℃ 1分钟 ，共进行40个循环反应。取8μl PCR产物于2μl上样缓冲液混合上样，在含溴化乙锭的2%琼 脂糖凝胶中电泳30分钟，在紫外灯下观察并摄像。
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3.PCR产物的酶切消化反应：在无菌的微量离心管中依次加入无菌双蒸水，10×RE缓冲液、T aq-1RE(4U/管)、PCR产物10μl(约1μg)，共计25μl，65℃保温消化12小时后，取反应混 合物按前述条件电泳2～3小时后，观察酶切效果。
(六)统计学分析：
抗菌药物的MIC分析采用百分位数法：MIC分布比较采用Ridit分析；四 环 素MIC中度敏感以上的Uu株对其它抗菌药的敏感性分析，计算几何均数G。
结 果
(一)7种抗菌药体外抗Uu标准株14型及分离株的敏感性测定：实验表明三类抗菌药物对Uu标准株14型具有良好抗菌作用，其中四环素类的MIC均为1μg/ml、喹诺酮类及大环内酯类的MIC分别为2μg/ml及1μg/ml，复孔间差异小，结果稳定，均匀一致。7种抗菌 药体外抗Uu分离株作用的敏感性测定表明，测试药物中以阿奇霉素对Uu作用最强，其次为红 霉素；喹诺酮类中以环丙沙星效果较好，抑菌范围为0.125～4μg/ml；四环素、美满霉 素、强力霉素对Uu的抗菌活性较差，其MIC90已分别达16μg/ml、4μg/ml及8μg/ml 。
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(二)临床Uu分离株中7种抗菌药MIC的相关分析：表1显示7种抗菌药物对42株Uu分离株MIC的分布情况。从表1中看出四环素MIC达8μg/ml以上有12株，强力霉素MIC达4μg/ml以上有10株，美满霉素MIC达4μg/ml以上有7株；大环内酯类的抑菌效果最佳，其中红霉素作用中有1 5株、阿奇霉素作用中有12株的MIC仅为0.06μg/ml，经多组Ridit分析表明，红霉素、阿奇 霉素与四环素的R值比较差异有显著性(P<0.05)，但与其它抗菌药的R值 比较差异无显著性(P0.05)。结果提示大环内酯类对Uu的抑菌效果较好 ，四环素较差，余属一般，其抑菌效力依次为美满霉素、环丙沙星、氧氟沙星及强力霉素。
(三)四环素中度敏感以上Uu株对其它抗菌药的MIC分布：表2列举出12株四环素MIC≥8μg/ml的Uu对其他6种药物的MIC分布情况。可以看出四环素MIC 值较高者，强力霉素及美满霉素的MIC值均也较高，但大环内酯及喹诺酮类的MIC值较低，说明这些Uu菌株对四环素类敏感性降低，而对后两类仍较敏感。几何均数表明此12例Uu分离株 对7种抗生素的敏感性依次为阿奇霉素、红霉素、氧氟沙星、环丙沙星、美满霉素、强力霉素和四环素。但对红霉素与阿奇霉素而言，个别菌株已达8μg/ml。
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(四)42株Uu分离株tetM基因的扩增：分离株DNA经PCR扩增以后，在琼脂糖凝胶电泳上于397b p
表1 7种抗菌药物对42株解脲支原体MIC分布比较 药 物
MIC(μg/ml)
0.06
0.12
0.25
0.5
1
2
4
8
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16
32
64
合 计
四 环 素
7
3
4
7
1
4
4
5
3
, 百拇医药
4
0
42(n1)
红 霉 素
15
7
6
3
4
3
1
2
1
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0
42(n2)
美满霉素
11
4
4
5
5
6
7
0
0
0
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0
42(n3)
强力霉素
9
2
7
5
3
6
5
5
0
0
0
, 百拇医药
42(n4)
阿奇霉素
12
5
7
8
6
0
2
2
0
0
0
42(n5)
, 百拇医药
环丙沙星
0
9
6
8
9
8
2
0
0
0
0
42(n6)
氧氟沙星
, 百拇医药
2
7
10
10
7
5
0
0
0
0
1
42(n7)
合计
, 百拇医药 56
37
44
46
35
32
21
14
4
4
1
294
表2 四环素中度敏感以上Uu株的其他抗菌药的MIC分布 编号
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MIC(μg/ml)
四环素
强力霉素
美满霉素
氧氟沙星
环丙沙星
红霉素
阿奇霉素
2
32
8
4
4
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1
4
0.5
5
8
4
4
1
0.5
1
0.5
6
32
8
, 百拇医药
4
2
2
2
0.5
7
16
8
4
2
2
2
1
9
, 百拇医药
16
8
4
2
2
1
0.5
15
8
2
2
1
4
0.12
, 百拇医药
0.12
17
32
4
1
2
2
1
1
21
32
4
4
0.5
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0.5
0.5
0.12
23
16
8
4
0.25
0.5
0.06
0.06
25
8
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2
0.5
4
0.06
0.06
26
8
4
2
0.25
0.5
0.06
0.06
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36
8
2
2
0.25
0.25
8
8
G
15.10
4.76
2.83
0.89
, http://www.100md.com 1.12
0.59
0.33
处可见一明显的条带(图1)，与PCR DNA标记所示分子量相似的阳性 带有30例，阳性检测率为71.4%。 (五)tetM PCR产物的酶切反应：42个Uu分离株中30株经PCR扩增出现单条397特异性扩增带，将扩增产物用Taq-1限制性内切酶保温过夜酶解后，在2%琼脂糖凝胶电泳上出现预期三条清晰酶切片段，1株未出现预期三条酶解带(图2)。
图1 Uu分离株tetM基因的PCR产物
Lane 1 PCR marker，Lane 2～Lane 16 酶切产物
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图 2 tetM PCR产物的酶解结果
(六)tetM基因检测与MIC的关系：表3示tetM检测结果与四环素族MIC浓 度的分布，四环素MIC为0.06μg/ml的也被检出tetM基因，如第19、30、38株等 ，第5株MIC=8μg/ml的模板DNA并未扩增出
表3 tetM基因检测 与四环素族MIC浓度的关系 编号
tetM
MIC(μg/ml)
四环素
美满霉素
强力霉素
1
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0.06
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1
1
tetM基因片段。讨 论
目前，持续性复发性非淋菌性尿道炎已成为日益常见和棘手的问题。虽然尚不清楚在急性NGU治疗后出现复发性持续性NGU的病例有多少，但大多数是在四环素类药物治疗症状减轻或渐消失后重新出现明显轻于急性期的有关症状。四环素类药为微生物蛋白合成抑制剂，测定Uu标准株对四环素类、喹诺酮类及大环内酯类亦均有较好而稳定的抑菌效果，而42个临床株对7种抗菌素的MIC分布差异较大。
从表1可看出，红霉素及阿奇霉素的MIC仅在0.06μg/ml就可分别抑制15株及12株的Uu分离 株生长，提示抑菌效率高。在四环素族中，四环素效果较差，只7株MIC=0.06μg/ml，并有4株MIC达32μg/ml。经Ridit分析表明，大环内酯类抗菌活性最强，四环素抗菌活性较差，美满霉素、环丙沙星、氧氟沙星及强力霉素抗菌活性介于上述药物之间，此亦与国内外临床及实验观察资料相吻合。这些均可能与性病患者反复求医，不规则使用大剂量四环素类药物有关，也可能与耐四环素的支原体株流行传播有关。
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对四环素MIC≥8μg/ml以上的其它6种抗菌药MIC分析看，对四环素族有较高耐药性者，对喹 诺酮类及大环内酯类药均呈较高敏感性，未发现对三类药物同时耐药的菌株(表2)，提示在临床上经四环素类反复治疗难以阴转并有临床不适的支原体感染病例，可采用其他种类抗支原体药物或联合应用两种或三种不同类抗支原体药物治疗。
采用PCR法对14个型别的Uu标准株均未扩增出tetM基因片段，说明Uu株天然未携带tetM耐药决定子，此与MIC的检测结果相吻合。42株已行MIC检测的培养物中，30株经PCR扩增出397bp 的特异性扩增带(图1)，tetM基因阳性检出率为71.4%。tetM基因检出率较高，说明携带tet M耐药决定子的Uu菌株有增多趋势。与Uu的MIC对比起来看(表3)，四环素MIC≥8μg/ml以上 的只有1例(5号)tetM检测阴性，其美满霉素及强力霉素的MIC均为4μg/ml；MIC为0.06μg/ m l的7份培养物中检出3份(19、30、38号)tetM决定子，这三份培养物美满霉素的MIC亦为0.0 6μg/ml，而强力霉素的MIC则分别为0.06、0.25及0.25μg/ml，说明PCR技术对检测tetM 基因有较好的敏感性及特异性，但也说明tetM基因阳性并非临床及MIC检测即可达耐药菌株 的诊断标准，应结合临床病史症状及MIC指标综合判断患者的耐药种类及耐药程度，以期更好地指导临床治疗[5～7]。
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对tetM PCR产物进行Taq-1限制性内切酶消化反应，除1例(23号)外均出现190、130及77bp 三个片段的酶切图谱带型(图2)，提示在不同Uu株的tetM序列内可能存在基因序列上的差异，即多态性。已有报告在淋球菌中检测出的tetM决定子经HpaⅡ内切酶消化后亦可产生不同的酶切图谱带型[8]。tetM决定子转移高水平的抵抗性，它通常位于联合转座子上，临床Uu分离株的tetM基因可能是通过转座子方式转化整合到支原体染色体 DNA上的，这种转化过程或临床的用药经历可能会伴随有Uu株tetM核苷酸序列的变化而导致 酶切产物多态性发生[8]。
参考文献
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2 Акуни КБ(蒋潼凤节译). 支原体病与人类生殖. 国外医学妇产科学分册, 1990,17∶278-279.
, http://www.100md.com
3 吴移谋, 余敏君, 刘腾飞, 等. 6种抗菌药物体外对解脲支原体与人型支原体的抗 菌作用. 中华皮肤科杂志, 1994,27∶134-135.
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5 Blanchard A, Crabb DM, Dybvig K, et al. Rapid detection of tetM in Myco plasma bominis and Ureaplasma urealyticum by PCR: tetM c onfers resistance to tetracycline but not necessarily to doxycycline. FEMS Micro biol Lett, 1992,15,74∶227-281.
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Study on Susceptibility of Ureaplasm a Urealyticum to Antimicrobial Agents and tetM Gene Detection Luo Dan, Huang Shujie, Xie Lihao, et al. Department of Dermatology, The First Affiliated Hospital, Nanjing Medical University, Nanjing 210029
【Abstract】 Objective To determine the susceptibility of Ureaplasma urealyticum(Uu) to 7 kinds of antimicrobial agents, to compare the result with tetracycline resistant determ inant(tetM) detected by PCR technique.Methods Forty-two Uu isolates were subcultured for 3 generations and then cultured with drugs with a series of concentrations from 64μg/ml ～ 0.06 μg/ml. MIC was determined when the color of culture medium did not change f rom yellow to red in 72h culture. The tetM determinant in the isolates was detected by PCR wit h specific primers, and PCR products were digest ed by Taq-1 restrictive endonuclease. Res ul ts The antimicrobial activity of tetracyclines to Uu was low. No Uu str ains resistant simultaneously to 3 groups of antibiotics were found in the stud y . Detection rate of tetM was 71.4% with correspondent digested fragments. Conclusion The susceptibility of Uu isolates to tetracycline group wa s low, but higher to macrolides and fluoroquinolones. Uu strains carrying t etM determinant might become drug resistant ones which should be monitored and followed up with MIC determination.
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解脲支原体(Uu)主要寄居于人泌尿生殖道。Uu在非淋菌性尿道炎等疾病中可 能具有一定致病作用。由于解脲支原体缺乏细胞壁，故β-酰胺类抗生素对其无效。由于滥用广谱抗生素，反复感染等因素，Uu对四环素类药物治疗发生抵抗的耐药株不断增加[1～3]。在人型支原体及解脲支原体中，仅有的四环素抗性决定子为t etM，即两种支原体对四环素的耐药可能是因获得tetM耐药决定子后所致[4]。用聚合酶链反应(PCR)技术可快速、灵敏检测耐药基因，这对筛查性病人群中由 Uu、人型支原体(Mh)及生殖支原体(Mg)引起的耐药频率具有实用意义[5]。我们采用MIC及PCR 相结合的实验方法，对Uu进行耐药情况的分析，耐药基因的检测及其产物的酶切分析，现报 道如下。
作者单位：210009 南京医科大学第一附属医院皮肤科(骆丹、 朱文元)；广东省江门市皮肤病防治所(黄澍杰、谢礼豪)；南京铁道医学院流行病教研室(汪 宁)；中国医学科学院、中国协和医科大学皮肤病研究所(徐文严)
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材料和方法
(一)抗菌药物：四环素、红霉素、氧氟沙星由中国生物制品检定所提供；强力霉素、美满霉素、阿奇霉素由美国辉瑞公司提供；环丙沙星由中国药科大学药物研究所提供。药液配制：先根据药物溶解特性溶解原药，再用蒸馏水稀释至2560μg/ml；环丙沙星、氧氟沙星先用1ml氢氧化钠溶解，再用无菌蒸馏水配成2560μg/ml浓度。-20℃保存备用。
(二)Taq DNA聚合酶、dNTPs、PCR标记物及Taq-1限制性内切酶(RE)均购自华美及复华生物 工程公司。
(三)解脲支原体标准株由南京铁道医学院流行病学教研室提供；载有tetM决定子的TRNG标准 株由中国医学科学院皮肤病研究所提供。
(四)标本来源：取泌尿生殖道拭子标本。经临床及检验证实的42例非淋菌性尿道炎(宫颈炎)、前列腺炎的临床Uu分离株，经菌落形态、底物分解、pH值、生长速度初步鉴定，液体传代3次后-20℃短期保存备用。如是直接检测tetM基因的分泌物标本则置于含1ml生理盐水的Eppendorf管中-20℃冻存。
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(五)实验方法：
1.液体培养基稀释法测定MIC：在96孔聚乙烯板上将药液倍比稀释至64～0.06μg/ml，设不 加药物孔为对照。每孔接种103CCU/0.1ml支原体培养物0.1ml，加盖密封，每孔总容积 0.2ml。于24、48、72及96小时观察结果，加药组以72小时仍不出现黄转红颜色变化的最小 药物浓度为最小抑制Uu生长的药物浓度(MIC)。重复实验3次，以3次结果平均数为依据计算M IC范围以及MIC90与MIC50。
2.PCR方法检测tetM决定子：采用裂解液(1% NP-40，1%吐温20，1.5mmol/LMgCl2 ，50mmol/L KCl，50mmol/L Tirs)15分钟煮沸法制备模板DNA。在25μl反应体系中依次加入10×PCR buffer、2mmol/L dNTPs、40μmol/L上下游引物一对、1UTaq-DNA聚合酶、模板 DNA及双蒸水，经94℃ 3分钟预变性后进入PCR循环：94℃ 40秒、50℃ 1分钟、72℃ 1分钟 ，共进行40个循环反应。取8μl PCR产物于2μl上样缓冲液混合上样，在含溴化乙锭的2%琼 脂糖凝胶中电泳30分钟，在紫外灯下观察并摄像。
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3.PCR产物的酶切消化反应：在无菌的微量离心管中依次加入无菌双蒸水，10×RE缓冲液、T aq-1RE(4U/管)、PCR产物10μl(约1μg)，共计25μl，65℃保温消化12小时后，取反应混 合物按前述条件电泳2～3小时后，观察酶切效果。
(六)统计学分析：
抗菌药物的MIC分析采用百分位数法：MIC分布比较采用Ridit分析；四 环 素MIC中度敏感以上的Uu株对其它抗菌药的敏感性分析，计算几何均数G。
结 果
(一)7种抗菌药体外抗Uu标准株14型及分离株的敏感性测定：实验表明三类抗菌药物对Uu标准株14型具有良好抗菌作用，其中四环素类的MIC均为1μg/ml、喹诺酮类及大环内酯类的MIC分别为2μg/ml及1μg/ml，复孔间差异小，结果稳定，均匀一致。7种抗菌 药体外抗Uu分离株作用的敏感性测定表明，测试药物中以阿奇霉素对Uu作用最强，其次为红 霉素；喹诺酮类中以环丙沙星效果较好，抑菌范围为0.125～4μg/ml；四环素、美满霉 素、强力霉素对Uu的抗菌活性较差，其MIC90已分别达16μg/ml、4μg/ml及8μg/ml 。
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(二)临床Uu分离株中7种抗菌药MIC的相关分析：表1显示7种抗菌药物对42株Uu分离株MIC的分布情况。从表1中看出四环素MIC达8μg/ml以上有12株，强力霉素MIC达4μg/ml以上有10株，美满霉素MIC达4μg/ml以上有7株；大环内酯类的抑菌效果最佳，其中红霉素作用中有1 5株、阿奇霉素作用中有12株的MIC仅为0.06μg/ml，经多组Ridit分析表明，红霉素、阿奇 霉素与四环素的R值比较差异有显著性(P<0.05)，但与其它抗菌药的R值 比较差异无显著性(P0.05)。结果提示大环内酯类对Uu的抑菌效果较好 ，四环素较差，余属一般，其抑菌效力依次为美满霉素、环丙沙星、氧氟沙星及强力霉素。
(三)四环素中度敏感以上Uu株对其它抗菌药的MIC分布：表2列举出12株四环素MIC≥8μg/ml的Uu对其他6种药物的MIC分布情况。可以看出四环素MIC 值较高者，强力霉素及美满霉素的MIC值均也较高，但大环内酯及喹诺酮类的MIC值较低，说明这些Uu菌株对四环素类敏感性降低，而对后两类仍较敏感。几何均数表明此12例Uu分离株 对7种抗生素的敏感性依次为阿奇霉素、红霉素、氧氟沙星、环丙沙星、美满霉素、强力霉素和四环素。但对红霉素与阿奇霉素而言，个别菌株已达8μg/ml。
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(四)42株Uu分离株tetM基因的扩增：分离株DNA经PCR扩增以后，在琼脂糖凝胶电泳上于397b p
表1 7种抗菌药物对42株解脲支原体MIC分布比较 药 物
MIC(μg/ml)
0.06
0.12
0.25
0.5
1
2
4
8
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16
32
64
合 计
四 环 素
7
3
4
7
1
4
4
5
3
, 百拇医药
4
0
42(n1)
红 霉 素
15
7
6
3
4
3
1
2
1
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0
42(n2)
美满霉素
11
4
4
5
5
6
7
0
0
0
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0
42(n3)
强力霉素
9
2
7
5
3
6
5
5
0
0
0
, 百拇医药
42(n4)
阿奇霉素
12
5
7
8
6
0
2
2
0
0
0
42(n5)
, 百拇医药
环丙沙星
0
9
6
8
9
8
2
0
0
0
0
42(n6)
氧氟沙星
, 百拇医药
2
7
10
10
7
5
0
0
0
0
1
42(n7)
合计
, 百拇医药 56
37
44
46
35
32
21
14
4
4
1
294
表2 四环素中度敏感以上Uu株的其他抗菌药的MIC分布 编号
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MIC(μg/ml)
四环素
强力霉素
美满霉素
氧氟沙星
环丙沙星
红霉素
阿奇霉素
2
32
8
4
4
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1
4
0.5
5
8
4
4
1
0.5
1
0.5
6
32
8
, 百拇医药
4
2
2
2
0.5
7
16
8
4
2
2
2
1
9
, 百拇医药
16
8
4
2
2
1
0.5
15
8
2
2
1
4
0.12
, 百拇医药
0.12
17
32
4
1
2
2
1
1
21
32
4
4
0.5
, http://www.100md.com
0.5
0.5
0.12
23
16
8
4
0.25
0.5
0.06
0.06
25
8
, http://www.100md.com 4
2
0.5
4
0.06
0.06
26
8
4
2
0.25
0.5
0.06
0.06
, http://www.100md.com
36
8
2
2
0.25
0.25
8
8
G
15.10
4.76
2.83
0.89
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0.59
0.33
处可见一明显的条带(图1)，与PCR DNA标记所示分子量相似的阳性 带有30例，阳性检测率为71.4%。 (五)tetM PCR产物的酶切反应：42个Uu分离株中30株经PCR扩增出现单条397特异性扩增带，将扩增产物用Taq-1限制性内切酶保温过夜酶解后，在2%琼脂糖凝胶电泳上出现预期三条清晰酶切片段，1株未出现预期三条酶解带(图2)。
图1 Uu分离株tetM基因的PCR产物
Lane 1 PCR marker，Lane 2～Lane 16 酶切产物
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图 2 tetM PCR产物的酶解结果
(六)tetM基因检测与MIC的关系：表3示tetM检测结果与四环素族MIC浓 度的分布，四环素MIC为0.06μg/ml的也被检出tetM基因，如第19、30、38株等 ，第5株MIC=8μg/ml的模板DNA并未扩增出
表3 tetM基因检测 与四环素族MIC浓度的关系 编号
tetM
MIC(μg/ml)
四环素
美满霉素
强力霉素
1
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+
0.5
0.12
0.25
2
+
32
4
8
3
-
0.5
0.12
0.12
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4
-
0.25
0.25
0.25
5
-
8
4
4
6
+
32
4
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8
7
+
16
4
8
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0.12
0.06
0.06
9
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4
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10
+
2
1
1
11
-
0.25
0.12
0.12
12
+
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0.12
0.06
0.06
13
+
0.5
0.5
0.25
14
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4
1
2
15
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0.5
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0.06
0.06
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31
+
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0.06
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0.06
32
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0.25
0.25
0.5
33
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0.06
0.06
34
-
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0.06
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36
+
8
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2
37
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0.12
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0.25
41
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42
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2
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1
1
tetM基因片段。讨 论
目前，持续性复发性非淋菌性尿道炎已成为日益常见和棘手的问题。虽然尚不清楚在急性NGU治疗后出现复发性持续性NGU的病例有多少，但大多数是在四环素类药物治疗症状减轻或渐消失后重新出现明显轻于急性期的有关症状。四环素类药为微生物蛋白合成抑制剂，测定Uu标准株对四环素类、喹诺酮类及大环内酯类亦均有较好而稳定的抑菌效果，而42个临床株对7种抗菌素的MIC分布差异较大。
从表1可看出，红霉素及阿奇霉素的MIC仅在0.06μg/ml就可分别抑制15株及12株的Uu分离 株生长，提示抑菌效率高。在四环素族中，四环素效果较差，只7株MIC=0.06μg/ml，并有4株MIC达32μg/ml。经Ridit分析表明，大环内酯类抗菌活性最强，四环素抗菌活性较差，美满霉素、环丙沙星、氧氟沙星及强力霉素抗菌活性介于上述药物之间，此亦与国内外临床及实验观察资料相吻合。这些均可能与性病患者反复求医，不规则使用大剂量四环素类药物有关，也可能与耐四环素的支原体株流行传播有关。
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对四环素MIC≥8μg/ml以上的其它6种抗菌药MIC分析看，对四环素族有较高耐药性者，对喹 诺酮类及大环内酯类药均呈较高敏感性，未发现对三类药物同时耐药的菌株(表2)，提示在临床上经四环素类反复治疗难以阴转并有临床不适的支原体感染病例，可采用其他种类抗支原体药物或联合应用两种或三种不同类抗支原体药物治疗。
采用PCR法对14个型别的Uu标准株均未扩增出tetM基因片段，说明Uu株天然未携带tetM耐药决定子，此与MIC的检测结果相吻合。42株已行MIC检测的培养物中，30株经PCR扩增出397bp 的特异性扩增带(图1)，tetM基因阳性检出率为71.4%。tetM基因检出率较高，说明携带tet M耐药决定子的Uu菌株有增多趋势。与Uu的MIC对比起来看(表3)，四环素MIC≥8μg/ml以上 的只有1例(5号)tetM检测阴性，其美满霉素及强力霉素的MIC均为4μg/ml；MIC为0.06μg/ m l的7份培养物中检出3份(19、30、38号)tetM决定子，这三份培养物美满霉素的MIC亦为0.0 6μg/ml，而强力霉素的MIC则分别为0.06、0.25及0.25μg/ml，说明PCR技术对检测tetM 基因有较好的敏感性及特异性，但也说明tetM基因阳性并非临床及MIC检测即可达耐药菌株 的诊断标准，应结合临床病史症状及MIC指标综合判断患者的耐药种类及耐药程度，以期更好地指导临床治疗[5～7]。
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对tetM PCR产物进行Taq-1限制性内切酶消化反应，除1例(23号)外均出现190、130及77bp 三个片段的酶切图谱带型(图2)，提示在不同Uu株的tetM序列内可能存在基因序列上的差异，即多态性。已有报告在淋球菌中检测出的tetM决定子经HpaⅡ内切酶消化后亦可产生不同的酶切图谱带型[8]。tetM决定子转移高水平的抵抗性，它通常位于联合转座子上，临床Uu分离株的tetM基因可能是通过转座子方式转化整合到支原体染色体 DNA上的，这种转化过程或临床的用药经历可能会伴随有Uu株tetM核苷酸序列的变化而导致 酶切产物多态性发生[8]。
参考文献
1 王荷英, 王千秋, 张树文, 等. 性传播疾病中的支原体感染. 临床皮肤科杂志, 1996,25∶6-8.
2 Акуни КБ(蒋潼凤节译). 支原体病与人类生殖. 国外医学妇产科学分册, 1990,17∶278-279.
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3 吴移谋, 余敏君, 刘腾飞, 等. 6种抗菌药物体外对解脲支原体与人型支原体的抗 菌作用. 中华皮肤科杂志, 1994,27∶134-135.
4 Roberts MC, Kenny GE. Dessemination of the tetM tetracycline resistance determi nant to Ureaplasma urealyticum. Antimicrob Agents Chemother, 198 6,29∶350-352.
5 Blanchard A, Crabb DM, Dybvig K, et al. Rapid detection of tetM in Myco plasma bominis and Ureaplasma urealyticum by PCR: tetM c onfers resistance to tetracycline but not necessarily to doxycycline. FEMS Micro biol Lett, 1992,15,74∶227-281.
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6 Stimson JB, Hale J, Bowie WR. Tetracycline resistant Ureaplasma urealyt icum: a cause of persistent NGU. Ann Intern Med, 1981,94∶-194.
7 McCormack WM. Susceptibility of mycoplasmas to antibiotic agents: clini cal implications. Clin Infect Dis, 1993,17(S1)∶200-202.
8 Sancher-Pescador R, Broun JT, Roberts M. The nucleotide sequence of th e tetrac ycline resistance determinant tetM from Ureaplasma urealyticum. Nucleic Acid Res, 1988,16∶1216-1217., 百拇医药