非淋菌性尿道炎的生殖支原体检测
作者：王荷英 施美琴 叶顺章 张树文 王红春
单位：210042 中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所
关键词：生殖支原体；非淋菌性尿道炎
中国皮肤科杂志980306 【摘要】目的 为了探讨生殖支原体(Myc oplasma genitalium, Mg)感染与非淋菌性尿道炎(NGU)的关系。方法 对64例采自STD门诊的NGU患者尿道(宫颈)分 泌物标本作了Mg检测。采用改良SP-4培养基作分离培养。 结果与结论 实验结果表明，9例阳性，占检测总数14.1%。 其中男6例，女3例。2例合并解脲支原体感染，另1例伴有沙眼衣原体感染。9例阳性培 养物经菌落形态观察、传代试验、生化反应、电镜观察及聚合酶链反应等鉴定试验证明，临床分离培养阳性株同Mg标准株(G-37)的实验结果完全一致。对Mg与NGU关系作了初步分析。
, http://www.100md.com Detection of Mycoplasma Genitalium in Nongonococcal Uret hritis Wang H eying, Shi Meiqin, Ye Shungzhang, et al. Institute of Dermatology,Chinese Academ y of Medica l Sciences, Peking Union Medical College, National Center for STD and Leprosy Co ntrol. Nanjing, 210042
【Abstract】 Objective To explore the relationship between Mycoplas ma genitalium(Mg) infection and non-gonococcal urethritis(NGU). Methods The di scharge from urethra or cervical canal was tested in 64 patients with NGU at our STD clinic. Mycoplasma genitalium was isolated using SP-4 modi fied medium. Results and Conclusion The results indicated that Mg was found in 9 of 64 cases( 14.1%) (6 men and 3 women). Two cases were coinfected with Ureaplasma u realyticum, and one with C. trachomatis. The Mg isolates were confirmed by colony morpholo gy, s ubcuture test,biochemical reactions,electronmicroscopic observation and polymera se chain reaction. The isolates were consistent with Mg reference strain,G-37. The correlation between Mg and NGU were preliminarily discussed.
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【Key words】 Mycoplasma genitalium Nongonoccocal urethritis
迄今国内对生殖支原体(Mg)感染所致泌尿生殖系统疾患的研究开展尚少。由于Mg的分离培养所需营养要求高、培养时间较长，而血清学诊断又因其与肺炎支原体有广泛的交叉反应而受到限制。鉴于上述原因，在一定程度上影响了Mg的临床和基础研究的发展。我们对64例非淋菌性尿道炎(NGU)患者的尿道(宫颈)分泌物作了Mg的分离培养和鉴定，现将结果报道如 下。
资料和方法
一、研究对象
标本采自我所STD门诊的64例NGU患者。其中男49例，女15例。年龄20～54岁，平均年龄32岁。临床诊断根据病史、症状、体征和实验室检查结果，符合NGU[1]。病期数天至3年不等。
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二、标本采集及Mg分离培养方法
取尿道(宫颈)分泌物标本洗于Mg液体培养基试管中。置37℃温箱培养，每日观察液体培养基颜色有无改变。若培养基(含酚红指示剂)颜色由红变 为黄色，透明无沉淀，表明可能为Mg阳性。然后将经0.45μm微孔滤膜过滤后的培养物，以 1∶10比例转种到新的Mg培养液中作传代观察。与此同时，取上述适量培养物接种于Mg固体 培养基上，放烛缸中37℃孵育，以观察是否有煎蛋状菌落。
三、生殖支原体标准菌株(G-37)来源及培养基制备
Mg标准菌株由南京铁道医学院赵季文教授惠赠。Mg培养基参照SP-4培养基配方作改良后制成。pH为7.6～7.8。Mg液体培养基以2.5ml分装于每支螺旋盖试管中，置4℃冰箱中备用。Mg固体培养基中含1%琼脂。
四、Mg鉴定试验
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(一)观察菌落形态：将待鉴定的Mg液体培养物移种到Mg固体培养基上，置37℃烛缸培 养，待培养基出现由红变黄的颜色反应，表明已有支原体生长。取出固体培养基后，用Dien es法染色，在低倍显微镜下检查是否有呈蓝色的煎蛋状菌落。
(二)传代试验：经滤器过滤后的液体培养物作反复传代，观察是否能传代，并观察Mg生 长特点。
(三)生化反应：
1.发酵葡萄糖试验：将培养物接种于含0.5%葡萄糖培养基(含酚红指示剂)中，观察pH 变化。Mg能分解葡萄糖，使培养基pH下降，培养基颜色由红变为黄色。解脲支原体(Uu)及人 型支原体无此特性。
2.水解精氨酸及尿素试验：培养基中不加葡萄糖，分别加入0.15%精氨酸及0.15%尿 素，观察pH变化情况。Mg不能水解精氨酸及尿素，因此不发生pH变化。
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(四)电镜观察：取液体培养物，经超速离心后制成超薄涂片，作负染色，镜检。观察电镜下形态并照相。
(五)聚合酶链反应(PCR)试验：采用套式PCR方法检测Mg16Sr RNA基因(引物由无锡市克 隆遗传技术研究所提供)，终产物为535bp DNA扩增片段。操作顺序如下：将标本振荡后洗涤 于1ml生理盐水中，再取洗涤液200μl 15 000r/min，离心5分钟，弃上清液。加裂解液混匀后 ，55℃孵育1小时。经高温灭活后再次离心，取上清液作为首次扩增模板。循环条件为93℃ 预变性2分钟、93℃30秒、55℃30秒、72℃60秒共35个循环。首次扩增产物经蒸馏水稀释后作为第2次扩增模板，循环条件如前，终产物有535bp的DNA条带为阳性。每次检测均设置阴性、阳性对照。
中国医学科学院、中国协和医科大学科研基金资助课题
结 果
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(一)64例患者分泌物作Mg检测，结果表明，9例阳性(占检测总数14.1%) 。阳性培养物(或标本)作PCR试验也证明均为Mg阳性，与标准Mg(G-37)完全一致。在9例Mg 阳性病例中，有2例合并Uu感染，1例合并沙眼衣原体(CT)感染。由此可见，在泌尿生殖道有Mg感染的NGU，同样可合并其他病原体感染。在9例Mg阳性病例中，男6例，女3例。
(二)Mg株的鉴定试验结果：
1.菌落形态观察：Mg菌落在固体培养基上呈煎蛋状(见图1)。经Dienes染色后呈蓝色，直径大小为16～200μm。
2.传代试验：经0.45μm滤膜过滤后的培养物能传代。培养基发生颜色变化即由红色变 为黄色的时间为6～46天。初代生长的时间比较长，每代平均生长时间为2周左右。
3.生化反应：Mg菌株能发酵葡萄糖，使含葡萄糖培养基pH下降，由红色变为黄色；但不 能利用精氨酸及尿素，在含有精氨酸及尿素的培养基中接种Mg后，37℃培养1周，未见培养基发生颜色变化。
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4.电镜观察：在电镜下，经6万倍放大，可见到单个Mg形态似“南 瓜”状，顶部似有特殊的结构，有明显颈部，底部宽。见图2。此外，也有呈球形Mg。
5.聚合酶链反应结果：用套式PCR法检测Mg-16Sr DNA基因，其阳性菌株终产物为535bpDNA 扩增片段。见图3。
在鉴定试验中，临床株与Mg标准株的实验结果
图1 Mg菌落呈蓝色煎蛋状
图2 Mg电镜下负染形态(×60 000)
, 百拇医药
1～4：临 床标本Mg株，5：Mg标准株(G-37)，6：阴性对照，M：PCR Marker
图3 PCR试验检测结果
图4 Mg似南瓜状(转拍自Tay lor-Robinson D.
Genitourin Med,1995,7∶1-8)
完全一致。
讨 论
生殖支原体系1981年Tully等[2]首先从2例NGU患者尿道标本中分离出来并命名。近年来，国外对Mg已进行了一些研究，临床和动物试验证明，Mg可引起急性和慢性NGU，尤其是非衣原体性NGU。Mg可能和妇女上生殖道疾病相关。有人认为，泌尿生殖道可能是Mg感染和 寄居的主要部位。本研究从64例NGU患者的尿道(宫颈)分泌物中分离培养出9株Mg(14.1%)，其阳性培养物经菌落形态观察、传代试验、生化反应、电镜观察和PCR试验结果表明，培养 分离出的临床Mg株的生物学特征与Mg标准株(G-37)的鉴定试验结果一致，由此可见，经培养分离出的9株支原体可确认是Mg。Mg生长缓慢，甚至可超过2～3个月。生长所需要的营养成分复杂，本研究使用我所研制 的改良SP-4培养基，Mg出现明显生长的时间为6～46天。此结果表明，经改良的SP-4培养基对Mg的分离培养是可取的。Taylot-Robinson[3]报告，单个Mg具有“南瓜” 状形态(见图4)，本研究所观察到的电镜下形态与其接近，顶部有特殊结构，似吸盘状。
, 百拇医药
资料表明，Mg可引起急、慢性NGU及妇女生殖道炎症。Horner报告[ 5]，取急性NGU男性患者109例尿道标本及55例无NGU男性标本作Mg检测，结果表明，前者阳性率为23%(24/ 103)，后者仅3例阳性(6%)。Jensen等[4～6]也相继报告了Mg与NGU 的发生密切相关，他们用DNA探针和PCR方法检测Mg，得到了证明。而且在无衣原体性NGU患者中，Mg阳性率更常见。本研究结果也表明，Mg阳性病例也主要发生在非衣原体性NGU患者标本中。据报告，应用PCR技术检测结果表明，STD门诊中约20%的妇女在下生殖道部位查到Mg，提示Mg具有性传播性。Moller等[7]在166例盆腔炎患者中 ，用代谢抑制试验检出31例患者有抗Mg抗体，40%急性输卵管炎患者的血清抗体出现有意义增高。给母猴输卵管接种Mg，2周后出现炎症，上皮及肌粘膜层间出现炎性细胞，可能与该支原体的粘附性与特殊结构有关 。
本研究结果表明，Mg感染可合并其他病原体。在9例Mg阳性病例中，有3例标本分别检出Uu及CT，这与Taylor-Robinson等报告[8]的淋菌性尿道炎可合并Mg感染类似。因此，Mg合并其他病原体感染的问题，应引起重视。
, 百拇医药
参考文献
1 中华人民共和国卫生部卫生防疫司.性病防治手册.第2版.南京：江苏科学技术出版社, 1994.48-54.
2 Tully JG, Taylor-Robinson D, Cole RM, et al. A newly discovered mycop lasma in the human urogenital tract. Lancet, 1981.1288-1291.
3 Taylor-Robinson D. The history and role of Mycoplasma genitali u m in sexually transmitted disease. Genitourin Med, 1995,71∶1-8.
4 Jensen JS, Qrsum R, Dohn B. Mycoplasma genitalium∶ a c ause of male urethritis? Genitourin Med, 1993,69∶265-269.
, http://www.100md.com
5 Horner PJ, Gillroy CB. Thomas B J et al. Association of Mycopl asma genitalium with acute nongonococal urethritis. Lancet , 1993,342∶5 82-585.
6 Jensen JS, Hansen HT,Lind K. Isolation of Mycoplasma genitaliu m strains from the male urethra. J Clin Microbiol. 1996,3∶286-291.
7 Moller BR, Robinson D A, Furr PM, et al. Serological evidence implicat ing Mycoplasma genitalium in pelvic inflammatory disease. Lan cet, 1984,1∶1102-1103.
8 Taylor-Robinson D, Furr PM, Hanna N F. Microbiological and serological study of non-gonococcal urethritis with special reference to Mycoplasm a genitalium. Genitourin Med, 1985,61∶319-324., http://www.100md.com
单位：210042 中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所
关键词：生殖支原体；非淋菌性尿道炎
中国皮肤科杂志980306 【摘要】目的 为了探讨生殖支原体(Myc oplasma genitalium, Mg)感染与非淋菌性尿道炎(NGU)的关系。方法 对64例采自STD门诊的NGU患者尿道(宫颈)分 泌物标本作了Mg检测。采用改良SP-4培养基作分离培养。 结果与结论 实验结果表明，9例阳性，占检测总数14.1%。 其中男6例，女3例。2例合并解脲支原体感染，另1例伴有沙眼衣原体感染。9例阳性培 养物经菌落形态观察、传代试验、生化反应、电镜观察及聚合酶链反应等鉴定试验证明，临床分离培养阳性株同Mg标准株(G-37)的实验结果完全一致。对Mg与NGU关系作了初步分析。
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【Abstract】 Objective To explore the relationship between Mycoplas ma genitalium(Mg) infection and non-gonococcal urethritis(NGU). Methods The di scharge from urethra or cervical canal was tested in 64 patients with NGU at our STD clinic. Mycoplasma genitalium was isolated using SP-4 modi fied medium. Results and Conclusion The results indicated that Mg was found in 9 of 64 cases( 14.1%) (6 men and 3 women). Two cases were coinfected with Ureaplasma u realyticum, and one with C. trachomatis. The Mg isolates were confirmed by colony morpholo gy, s ubcuture test,biochemical reactions,electronmicroscopic observation and polymera se chain reaction. The isolates were consistent with Mg reference strain,G-37. The correlation between Mg and NGU were preliminarily discussed.
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【Key words】 Mycoplasma genitalium Nongonoccocal urethritis
迄今国内对生殖支原体(Mg)感染所致泌尿生殖系统疾患的研究开展尚少。由于Mg的分离培养所需营养要求高、培养时间较长，而血清学诊断又因其与肺炎支原体有广泛的交叉反应而受到限制。鉴于上述原因，在一定程度上影响了Mg的临床和基础研究的发展。我们对64例非淋菌性尿道炎(NGU)患者的尿道(宫颈)分泌物作了Mg的分离培养和鉴定，现将结果报道如 下。
资料和方法
一、研究对象
标本采自我所STD门诊的64例NGU患者。其中男49例，女15例。年龄20～54岁，平均年龄32岁。临床诊断根据病史、症状、体征和实验室检查结果，符合NGU[1]。病期数天至3年不等。
, http://www.100md.com
二、标本采集及Mg分离培养方法
取尿道(宫颈)分泌物标本洗于Mg液体培养基试管中。置37℃温箱培养，每日观察液体培养基颜色有无改变。若培养基(含酚红指示剂)颜色由红变 为黄色，透明无沉淀，表明可能为Mg阳性。然后将经0.45μm微孔滤膜过滤后的培养物，以 1∶10比例转种到新的Mg培养液中作传代观察。与此同时，取上述适量培养物接种于Mg固体 培养基上，放烛缸中37℃孵育，以观察是否有煎蛋状菌落。
三、生殖支原体标准菌株(G-37)来源及培养基制备
Mg标准菌株由南京铁道医学院赵季文教授惠赠。Mg培养基参照SP-4培养基配方作改良后制成。pH为7.6～7.8。Mg液体培养基以2.5ml分装于每支螺旋盖试管中，置4℃冰箱中备用。Mg固体培养基中含1%琼脂。
四、Mg鉴定试验
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(一)观察菌落形态：将待鉴定的Mg液体培养物移种到Mg固体培养基上，置37℃烛缸培 养，待培养基出现由红变黄的颜色反应，表明已有支原体生长。取出固体培养基后，用Dien es法染色，在低倍显微镜下检查是否有呈蓝色的煎蛋状菌落。
(二)传代试验：经滤器过滤后的液体培养物作反复传代，观察是否能传代，并观察Mg生 长特点。
(三)生化反应：
1.发酵葡萄糖试验：将培养物接种于含0.5%葡萄糖培养基(含酚红指示剂)中，观察pH 变化。Mg能分解葡萄糖，使培养基pH下降，培养基颜色由红变为黄色。解脲支原体(Uu)及人 型支原体无此特性。
2.水解精氨酸及尿素试验：培养基中不加葡萄糖，分别加入0.15%精氨酸及0.15%尿 素，观察pH变化情况。Mg不能水解精氨酸及尿素，因此不发生pH变化。
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(四)电镜观察：取液体培养物，经超速离心后制成超薄涂片，作负染色，镜检。观察电镜下形态并照相。
(五)聚合酶链反应(PCR)试验：采用套式PCR方法检测Mg16Sr RNA基因(引物由无锡市克 隆遗传技术研究所提供)，终产物为535bp DNA扩增片段。操作顺序如下：将标本振荡后洗涤 于1ml生理盐水中，再取洗涤液200μl 15 000r/min，离心5分钟，弃上清液。加裂解液混匀后 ，55℃孵育1小时。经高温灭活后再次离心，取上清液作为首次扩增模板。循环条件为93℃ 预变性2分钟、93℃30秒、55℃30秒、72℃60秒共35个循环。首次扩增产物经蒸馏水稀释后作为第2次扩增模板，循环条件如前，终产物有535bp的DNA条带为阳性。每次检测均设置阴性、阳性对照。
中国医学科学院、中国协和医科大学科研基金资助课题
结 果
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(一)64例患者分泌物作Mg检测，结果表明，9例阳性(占检测总数14.1%) 。阳性培养物(或标本)作PCR试验也证明均为Mg阳性，与标准Mg(G-37)完全一致。在9例Mg 阳性病例中，有2例合并Uu感染，1例合并沙眼衣原体(CT)感染。由此可见，在泌尿生殖道有Mg感染的NGU，同样可合并其他病原体感染。在9例Mg阳性病例中，男6例，女3例。
(二)Mg株的鉴定试验结果：
1.菌落形态观察：Mg菌落在固体培养基上呈煎蛋状(见图1)。经Dienes染色后呈蓝色，直径大小为16～200μm。
2.传代试验：经0.45μm滤膜过滤后的培养物能传代。培养基发生颜色变化即由红色变 为黄色的时间为6～46天。初代生长的时间比较长，每代平均生长时间为2周左右。
3.生化反应：Mg菌株能发酵葡萄糖，使含葡萄糖培养基pH下降，由红色变为黄色；但不 能利用精氨酸及尿素，在含有精氨酸及尿素的培养基中接种Mg后，37℃培养1周，未见培养基发生颜色变化。
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4.电镜观察：在电镜下，经6万倍放大，可见到单个Mg形态似“南 瓜”状，顶部似有特殊的结构，有明显颈部，底部宽。见图2。此外，也有呈球形Mg。
5.聚合酶链反应结果：用套式PCR法检测Mg-16Sr DNA基因，其阳性菌株终产物为535bpDNA 扩增片段。见图3。
在鉴定试验中，临床株与Mg标准株的实验结果
图1 Mg菌落呈蓝色煎蛋状
图2 Mg电镜下负染形态(×60 000)
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1～4：临 床标本Mg株，5：Mg标准株(G-37)，6：阴性对照，M：PCR Marker
图3 PCR试验检测结果
图4 Mg似南瓜状(转拍自Tay lor-Robinson D.
Genitourin Med,1995,7∶1-8)
完全一致。
讨 论
生殖支原体系1981年Tully等[2]首先从2例NGU患者尿道标本中分离出来并命名。近年来，国外对Mg已进行了一些研究，临床和动物试验证明，Mg可引起急性和慢性NGU，尤其是非衣原体性NGU。Mg可能和妇女上生殖道疾病相关。有人认为，泌尿生殖道可能是Mg感染和 寄居的主要部位。本研究从64例NGU患者的尿道(宫颈)分泌物中分离培养出9株Mg(14.1%)，其阳性培养物经菌落形态观察、传代试验、生化反应、电镜观察和PCR试验结果表明，培养 分离出的临床Mg株的生物学特征与Mg标准株(G-37)的鉴定试验结果一致，由此可见，经培养分离出的9株支原体可确认是Mg。Mg生长缓慢，甚至可超过2～3个月。生长所需要的营养成分复杂，本研究使用我所研制 的改良SP-4培养基，Mg出现明显生长的时间为6～46天。此结果表明，经改良的SP-4培养基对Mg的分离培养是可取的。Taylot-Robinson[3]报告，单个Mg具有“南瓜” 状形态(见图4)，本研究所观察到的电镜下形态与其接近，顶部有特殊结构，似吸盘状。
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资料表明，Mg可引起急、慢性NGU及妇女生殖道炎症。Horner报告[ 5]，取急性NGU男性患者109例尿道标本及55例无NGU男性标本作Mg检测，结果表明，前者阳性率为23%(24/ 103)，后者仅3例阳性(6%)。Jensen等[4～6]也相继报告了Mg与NGU 的发生密切相关，他们用DNA探针和PCR方法检测Mg，得到了证明。而且在无衣原体性NGU患者中，Mg阳性率更常见。本研究结果也表明，Mg阳性病例也主要发生在非衣原体性NGU患者标本中。据报告，应用PCR技术检测结果表明，STD门诊中约20%的妇女在下生殖道部位查到Mg，提示Mg具有性传播性。Moller等[7]在166例盆腔炎患者中 ，用代谢抑制试验检出31例患者有抗Mg抗体，40%急性输卵管炎患者的血清抗体出现有意义增高。给母猴输卵管接种Mg，2周后出现炎症，上皮及肌粘膜层间出现炎性细胞，可能与该支原体的粘附性与特殊结构有关 。
本研究结果表明，Mg感染可合并其他病原体。在9例Mg阳性病例中，有3例标本分别检出Uu及CT，这与Taylor-Robinson等报告[8]的淋菌性尿道炎可合并Mg感染类似。因此，Mg合并其他病原体感染的问题，应引起重视。
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参考文献
1 中华人民共和国卫生部卫生防疫司.性病防治手册.第2版.南京：江苏科学技术出版社, 1994.48-54.
2 Tully JG, Taylor-Robinson D, Cole RM, et al. A newly discovered mycop lasma in the human urogenital tract. Lancet, 1981.1288-1291.
3 Taylor-Robinson D. The history and role of Mycoplasma genitali u m in sexually transmitted disease. Genitourin Med, 1995,71∶1-8.
4 Jensen JS, Qrsum R, Dohn B. Mycoplasma genitalium∶ a c ause of male urethritis? Genitourin Med, 1993,69∶265-269.
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5 Horner PJ, Gillroy CB. Thomas B J et al. Association of Mycopl asma genitalium with acute nongonococal urethritis. Lancet , 1993,342∶5 82-585.
6 Jensen JS, Hansen HT,Lind K. Isolation of Mycoplasma genitaliu m strains from the male urethra. J Clin Microbiol. 1996,3∶286-291.
7 Moller BR, Robinson D A, Furr PM, et al. Serological evidence implicat ing Mycoplasma genitalium in pelvic inflammatory disease. Lan cet, 1984,1∶1102-1103.
8 Taylor-Robinson D, Furr PM, Hanna N F. Microbiological and serological study of non-gonococcal urethritis with special reference to Mycoplasm a genitalium. Genitourin Med, 1985,61∶319-324., http://www.100md.com