电镜及原子力显微镜观察生殖支原体形态学的初步探讨
作者：骆丹 顾宁 梁国钧 徐文严 朱文元
单位：210029 南京医科大学第一附属医院皮肤科(骆丹 朱文元)；东南大学国家教委重点分子电子学实验室(顾宁)；中国医学科学院皮肤病研究所
关键词：支原体属；显微镜检查；电子；显微镜检查；原子力
中华皮肤科杂志/980405 【摘要】 目的 为了对初步分离成功的生殖支原体进行进一步鉴定。方法 用电子显微镜及原子力显微镜对生殖支原体标准株及分离株进行形态学的初步观察。将标本固定于云母上，在接触及轻敲模式下扫描成像，操作在常温常压下进行。结果和结论 电镜下生殖支原体多呈烧瓶状或鸭梨形，有突出的颈部及膨大的头端。原子力显微镜观察结果与之类似，典型者多呈烧瓶状或鸭梨形，颈体部多有明显缩窄环或切痕，其生殖支原体大小亦与电镜测量结果类似。
Preliminary Observation of Mycoplasma Genitaliumunder Electron Microscopy and Atomic Force Microscopy Luo Dan, Gu Ning, Liang Guojun, et al. Department of Dermatology, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To further identify the isolated Mycoplasma genitalium (Mg) from the high risk population of STD in China. Mothods The morphology of Mg standard strains and clinicalisolates were observed under electron microscopy (EM) and atomic force microscopy (AFM). Mg sample preparation for AFM was fixed on mica and AFM images of scanning observation were captured by contacting and tapping modes and operated undernormal atmospheric pressure and temperature. Results and Conclusion Mg had a diversity of shapes, including flask, pear, spindle or round shape with projecting neck portion and slightly broadened terminal structure under EM. The morphologic features under AFM were similar to those observed by EM. Thetypical Mg showed shapes of flask and pear with noticeable narrow ring or mark in the neck portion. The size of Mg measured under EM and AFM was similar as well.
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【Key Words】 Mycoplasma Microscopy, atomic force Microscopy, electron
生殖支原体(Mycoplasma genitalium, Mg)是由Tully[1]在1981年首次从两例男性急性非淋菌性尿道炎患者泌尿生殖道分泌物中分离出的一种新支原体，一般培养期为1～3个月，因此甚少见报道。近年来我们采用SP-4生殖支原体培养基对国内性病高危人群227份标本进行分离培养取得初步成功[2]。由于生殖支原体体积小，故在光镜下难以识别，我们采用电子显微镜进行形态学观察鉴定，并首次应用原子力显微镜进一步对电镜观察结果予以鉴定，现将初步结果报道如下。
材料和方法
1.生殖支原体样本：取自男性尿道及女性宫颈口的分泌物拭子标本，立即接种于5ml生殖支原体SP-4特制培养基试管中，置37℃温箱培养，当培养液颜色
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由红变黄且清澈透明时，用孔径0.45μm滤膜过滤，滤液按1∶10转种到新培养液中继续37℃培养，当培基颜色再次由红转黄色变化时则认为初代分离培养阳性。预行超微结构观察继续培养5天后取200μl培养物进行电子显微镜及原子力显微镜的样本制作。阳性对照株为G-37，由丹麦引进。以2ml SP-4培养基复苏Mg-37冻干菌种，待菌种生长至对数生长期，取100μl进行超微结构观察的样本制作。
2.电子显微镜制样[3]：采用负染制片技术。阳性培养物200μl，离心12 000r/min 10分钟，吸去上清培养液，用PBS缓冲液(pH7.4)50μl重悬沉淀，取混悬液一滴滴在蜡板上，将200目有膜的铜网翻扣插入悬液中，静置20分钟，用滤纸吸干滤网周围水分，用2%磷钨酸(pH7.0)固定2～5分钟，将载样铜网进行电子显微镜观察(日立H600型电镜)。
3.原子力显微镜的制样及扫描观测[4]：取阳性培养物200μl，离心14 000r/min 15分钟，吸去上清液用500μl生理盐水漂洗2次，每次12 000r/min 5分钟和生理盐水50μl重悬沉淀。单层分离载样云母，置于光滑载玻片上，用微量移液管加样2～4μl于云母上，按2∶1比例滴加3%戊二醛液(pH7.4，4℃保存)进行固定，自然风干1～1.5小时后进行扫描观测。所选用的原子力显微镜(AFM)为NanoscopeⅢa型扫描探针显微镜(SPM)，(美国Digital instruments Co产品)。采样用三角微悬臂为225μm长(其弹性常数为1-2N/m)，其上具有四面立锥Si3N4针尖。图象均在接触及轻敲模式下获得。扫描头为E型及A型，侧向/纵向范围为14.7μm/μm；A型侧向/纵向范围为0.97/0.5μm，除非特别指明，横向扫描频率为2-6Hz。接触作用力控制在10nN量级以下。所有实验均在常温(24℃左右)下完成。
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结 果
生殖支原体的电镜形态：图1显示标准株G-37传代培养后的群体形态，可见生殖支原体外观呈多形性，但以鸭梨形、烧瓶形、纺锤形或球形为多见，尤以烧瓶及鸭梨形为主。菌体的三维尺度为长约0.7～1.0μm，最宽处约0.3～0.45μm，顶部宽0.07～0.09μm。菌体有突出的颈部，末端略膨大或钝圆呈小帽状。另一明显特征为可见从膨大头端向下延续占其全长约40%～60%的膜外披样结构。在负染制片上表现为密度较一致的染色带。多数支原体帽处或颈部有一电子密度较深部位。支原体胞浆淡染，其核内结构清晰可见。
图1 生殖支原体G-37标准株的群体形态(15×103)
图2 生殖支原体临床分离株的电镜负染形态(4×104)
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图3 生殖支原体的原子力显微镜观察图(标准株)
图4 生殖支原体的原子力显微镜观测(临床分离株)
图5 生殖支原体的原子力显微镜观测
图2示临床分离株的大小及结构与G-37株相似，但镜下显示整个支原体较僵硬，弹性感略差。
生殖支原体的原子力显微镜形态：与电镜结果类似，大多数生殖支原体仍以鸭梨形或烧瓶形为主，图3、图4分别显示标准株与临床分离株的形态，图5可见支原体细长的颈部或头端相互粘附。在放大后的单一生殖支原体来看，其形态特征具与之类似的特征：即典型的烧瓶状或鸭梨状，在头颈与菌体之间多有一明显切迹或狭窄的收缩环，菌体大小的三维尺度为：长约0.9～1.2μm，最宽处为0.4～0.8μm，顶部宽约0.1～0.3μm，颈体交界处尺度变化较大，约0.08～0.4μm。
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讨 论
原子力扫描显微镜是80年代末期才用于生物标本的，由于其可在大气、常温下对样本进行纳米尺度的观察，并可对生物材料超微结构及形貌进行专项研究及显示，故具有极大的应用潜力[5，6]。但由于人们对生物微观领域的认识有限，故目前原子力显微镜对生物样品的观测多集中在比较单纯的体系中，例如对核酸大分子、DNA分子结构、脂质体等的研究。我们凭籍已有的知识对生殖支原体标准株及临床分离株进行了EM和(或)AFM结构的初步观察，有以下体会：①固定标本时间不宜过长，从我们进行的几组实验中看出，标本固定时间以1.5～2小时为宜，过长者易出现样品皱缩变形，易受作用力影响出现划痕破裂。②样品浓度不宜过高，否则易出现支原体堆积而难以观察，本实验中曾见有多个支原体聚集成群现象。以上观察说明两点，一是样品浓度偏大，二是可能与该支原体粘附蛋白的特性有关，因图中多个支原体相接处均为头颈部，此多为粘附蛋白所在部位[7]。③应尽量纯化样品，或对样品所处微环境进行对照采样观测，以排除微环境中其他生物体系的影响，如对生殖支原体培养液亦需同时进行采样观测。在本研究中，我们对生殖支原体的电子显微镜及原子力显微镜下的超微结构进行了初步观察，其电镜结果与国外报道基本符合，原子力显微镜的观测结果也进一步证实了电镜的观察结果，但仍有许多问题需进一步研究。
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参 考 文 献
1 Tully TG, Taylor-Robinson D, Cole RM, et al. A newly discovered Mycoplasma in the human urogenital tract. Lancet, 1981,1∶1288-1291.
2 赵季文, 骆丹, 王婉云, 等. 高危人群生殖支原体分离培养的初步报告.中华皮肤科杂志, 1998,31∶147-148.
3 Tully JG, Taylor-Robinson D, Rose DL, et al. Mycoplasma genitalium, a new species from human urogenital tract. Int J Syst Bact, 1983,33∶387-396.
4 Baselt DR, Rerel JP, Baldeschwieler D, et al. Subfibrillar structure oftype Ⅰcollagen observed by atomic force microscopy. Biophysical J, 1993,65∶2644.
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5 顾宁, 韦珏. 生命科学研究中的扫描力显微术. 浙江大学学报, 1995,11月增刊∶174-178.
6 Gu N, Wei QH, Pan W, et al. AFM observation of subfibrillar and fragmental structure of collagen from human lumbar intervertebral disc. Prog Nat Sci, 1997,7∶323-328.
7 Taylor-Robinson D. The history and role of Mycoplasma genitalium in sexually transmitted diseases. Genitourin Med, 1995,71∶1-8.
(梁国钧、徐文严)
(收稿：1997-10-05 修回：1998-03-04), http://www.100md.com
单位：210029 南京医科大学第一附属医院皮肤科(骆丹 朱文元)；东南大学国家教委重点分子电子学实验室(顾宁)；中国医学科学院皮肤病研究所
关键词：支原体属；显微镜检查；电子；显微镜检查；原子力
中华皮肤科杂志/980405 【摘要】 目的 为了对初步分离成功的生殖支原体进行进一步鉴定。方法 用电子显微镜及原子力显微镜对生殖支原体标准株及分离株进行形态学的初步观察。将标本固定于云母上，在接触及轻敲模式下扫描成像，操作在常温常压下进行。结果和结论 电镜下生殖支原体多呈烧瓶状或鸭梨形，有突出的颈部及膨大的头端。原子力显微镜观察结果与之类似，典型者多呈烧瓶状或鸭梨形，颈体部多有明显缩窄环或切痕，其生殖支原体大小亦与电镜测量结果类似。
Preliminary Observation of Mycoplasma Genitaliumunder Electron Microscopy and Atomic Force Microscopy Luo Dan, Gu Ning, Liang Guojun, et al. Department of Dermatology, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029
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【Abstract】 Objective To further identify the isolated Mycoplasma genitalium (Mg) from the high risk population of STD in China. Mothods The morphology of Mg standard strains and clinicalisolates were observed under electron microscopy (EM) and atomic force microscopy (AFM). Mg sample preparation for AFM was fixed on mica and AFM images of scanning observation were captured by contacting and tapping modes and operated undernormal atmospheric pressure and temperature. Results and Conclusion Mg had a diversity of shapes, including flask, pear, spindle or round shape with projecting neck portion and slightly broadened terminal structure under EM. The morphologic features under AFM were similar to those observed by EM. Thetypical Mg showed shapes of flask and pear with noticeable narrow ring or mark in the neck portion. The size of Mg measured under EM and AFM was similar as well.
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【Key Words】 Mycoplasma Microscopy, atomic force Microscopy, electron
生殖支原体(Mycoplasma genitalium, Mg)是由Tully[1]在1981年首次从两例男性急性非淋菌性尿道炎患者泌尿生殖道分泌物中分离出的一种新支原体，一般培养期为1～3个月，因此甚少见报道。近年来我们采用SP-4生殖支原体培养基对国内性病高危人群227份标本进行分离培养取得初步成功[2]。由于生殖支原体体积小，故在光镜下难以识别，我们采用电子显微镜进行形态学观察鉴定，并首次应用原子力显微镜进一步对电镜观察结果予以鉴定，现将初步结果报道如下。
材料和方法
1.生殖支原体样本：取自男性尿道及女性宫颈口的分泌物拭子标本，立即接种于5ml生殖支原体SP-4特制培养基试管中，置37℃温箱培养，当培养液颜色
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由红变黄且清澈透明时，用孔径0.45μm滤膜过滤，滤液按1∶10转种到新培养液中继续37℃培养，当培基颜色再次由红转黄色变化时则认为初代分离培养阳性。预行超微结构观察继续培养5天后取200μl培养物进行电子显微镜及原子力显微镜的样本制作。阳性对照株为G-37，由丹麦引进。以2ml SP-4培养基复苏Mg-37冻干菌种，待菌种生长至对数生长期，取100μl进行超微结构观察的样本制作。
2.电子显微镜制样[3]：采用负染制片技术。阳性培养物200μl，离心12 000r/min 10分钟，吸去上清培养液，用PBS缓冲液(pH7.4)50μl重悬沉淀，取混悬液一滴滴在蜡板上，将200目有膜的铜网翻扣插入悬液中，静置20分钟，用滤纸吸干滤网周围水分，用2%磷钨酸(pH7.0)固定2～5分钟，将载样铜网进行电子显微镜观察(日立H600型电镜)。
3.原子力显微镜的制样及扫描观测[4]：取阳性培养物200μl，离心14 000r/min 15分钟，吸去上清液用500μl生理盐水漂洗2次，每次12 000r/min 5分钟和生理盐水50μl重悬沉淀。单层分离载样云母，置于光滑载玻片上，用微量移液管加样2～4μl于云母上，按2∶1比例滴加3%戊二醛液(pH7.4，4℃保存)进行固定，自然风干1～1.5小时后进行扫描观测。所选用的原子力显微镜(AFM)为NanoscopeⅢa型扫描探针显微镜(SPM)，(美国Digital instruments Co产品)。采样用三角微悬臂为225μm长(其弹性常数为1-2N/m)，其上具有四面立锥Si3N4针尖。图象均在接触及轻敲模式下获得。扫描头为E型及A型，侧向/纵向范围为14.7μm/μm；A型侧向/纵向范围为0.97/0.5μm，除非特别指明，横向扫描频率为2-6Hz。接触作用力控制在10nN量级以下。所有实验均在常温(24℃左右)下完成。
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结 果
生殖支原体的电镜形态：图1显示标准株G-37传代培养后的群体形态，可见生殖支原体外观呈多形性，但以鸭梨形、烧瓶形、纺锤形或球形为多见，尤以烧瓶及鸭梨形为主。菌体的三维尺度为长约0.7～1.0μm，最宽处约0.3～0.45μm，顶部宽0.07～0.09μm。菌体有突出的颈部，末端略膨大或钝圆呈小帽状。另一明显特征为可见从膨大头端向下延续占其全长约40%～60%的膜外披样结构。在负染制片上表现为密度较一致的染色带。多数支原体帽处或颈部有一电子密度较深部位。支原体胞浆淡染，其核内结构清晰可见。
图1 生殖支原体G-37标准株的群体形态(15×103)
图2 生殖支原体临床分离株的电镜负染形态(4×104)
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图3 生殖支原体的原子力显微镜观察图(标准株)
图4 生殖支原体的原子力显微镜观测(临床分离株)
图5 生殖支原体的原子力显微镜观测
图2示临床分离株的大小及结构与G-37株相似，但镜下显示整个支原体较僵硬，弹性感略差。
生殖支原体的原子力显微镜形态：与电镜结果类似，大多数生殖支原体仍以鸭梨形或烧瓶形为主，图3、图4分别显示标准株与临床分离株的形态，图5可见支原体细长的颈部或头端相互粘附。在放大后的单一生殖支原体来看，其形态特征具与之类似的特征：即典型的烧瓶状或鸭梨状，在头颈与菌体之间多有一明显切迹或狭窄的收缩环，菌体大小的三维尺度为：长约0.9～1.2μm，最宽处为0.4～0.8μm，顶部宽约0.1～0.3μm，颈体交界处尺度变化较大，约0.08～0.4μm。
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原子力扫描显微镜是80年代末期才用于生物标本的，由于其可在大气、常温下对样本进行纳米尺度的观察，并可对生物材料超微结构及形貌进行专项研究及显示，故具有极大的应用潜力[5，6]。但由于人们对生物微观领域的认识有限，故目前原子力显微镜对生物样品的观测多集中在比较单纯的体系中，例如对核酸大分子、DNA分子结构、脂质体等的研究。我们凭籍已有的知识对生殖支原体标准株及临床分离株进行了EM和(或)AFM结构的初步观察，有以下体会：①固定标本时间不宜过长，从我们进行的几组实验中看出，标本固定时间以1.5～2小时为宜，过长者易出现样品皱缩变形，易受作用力影响出现划痕破裂。②样品浓度不宜过高，否则易出现支原体堆积而难以观察，本实验中曾见有多个支原体聚集成群现象。以上观察说明两点，一是样品浓度偏大，二是可能与该支原体粘附蛋白的特性有关，因图中多个支原体相接处均为头颈部，此多为粘附蛋白所在部位[7]。③应尽量纯化样品，或对样品所处微环境进行对照采样观测，以排除微环境中其他生物体系的影响，如对生殖支原体培养液亦需同时进行采样观测。在本研究中，我们对生殖支原体的电子显微镜及原子力显微镜下的超微结构进行了初步观察，其电镜结果与国外报道基本符合，原子力显微镜的观测结果也进一步证实了电镜的观察结果，但仍有许多问题需进一步研究。
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参 考 文 献
1 Tully TG, Taylor-Robinson D, Cole RM, et al. A newly discovered Mycoplasma in the human urogenital tract. Lancet, 1981,1∶1288-1291.
2 赵季文, 骆丹, 王婉云, 等. 高危人群生殖支原体分离培养的初步报告.中华皮肤科杂志, 1998,31∶147-148.
3 Tully JG, Taylor-Robinson D, Rose DL, et al. Mycoplasma genitalium, a new species from human urogenital tract. Int J Syst Bact, 1983,33∶387-396.
4 Baselt DR, Rerel JP, Baldeschwieler D, et al. Subfibrillar structure oftype Ⅰcollagen observed by atomic force microscopy. Biophysical J, 1993,65∶2644.
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5 顾宁, 韦珏. 生命科学研究中的扫描力显微术. 浙江大学学报, 1995,11月增刊∶174-178.
6 Gu N, Wei QH, Pan W, et al. AFM observation of subfibrillar and fragmental structure of collagen from human lumbar intervertebral disc. Prog Nat Sci, 1997,7∶323-328.
7 Taylor-Robinson D. The history and role of Mycoplasma genitalium in sexually transmitted diseases. Genitourin Med, 1995,71∶1-8.
(梁国钧、徐文严)
(收稿：1997-10-05 修回：1998-03-04), http://www.100md.com