银屑病患者角质形成细胞凋亡以及维A酸与榄香烯的影响
作者：刘振祥 李世荫
单位：100083 北京医科大学第三医院皮肤科
关键词：银屑病；细胞死亡；维甲酸；榄香烯
中华皮肤科杂志990211 【摘 要】 目的 探讨银屑病患者角质形成细胞凋亡以及维A酸与榄香烯对体外培养的角质形成细胞凋亡的影响。方法 用TUNEL法测定28例银屑病患者角质形成细胞凋亡；流式细胞仪和DNA片段化观察维A酸与榄香烯对体外培养的角质形成细胞凋亡的影响。结果 28例银屑病患者中19例有大量凋亡细胞分布于表皮各层，另9例较少，分布于棘细胞层和颗粒层。浓度为1、5、10、20μg/mL的维A酸和浓度为20、40、60、80μg/mL的榄香烯可促进人角质形成细胞株Colo-16细胞凋亡。结论 银屑病患者角质形成细胞凋亡异常增多，一定浓度的维A酸与榄香烯可在实验室内促进人角质形成细胞株Colo-16细胞凋亡。
, 百拇医药 Apoptosis of Psoriatic Keratinocytes and the Effects of Retinoic
Acid and Elemene on Apoptosis of Cultured Keratinocytes
LIU Zhenxiang, LI Shiyin.
Department of Dermatology, Third Hospital of Beijing Medical University, Beijing 100083
【Abstract】 Objective To investigate apoptosis of psoriatic keratinocytes and the effects of retinoic acid and elemene on apoptosis of cultured keratinocytes. Methods Apoptosis of psoriatic keratinocytes and the effects of retinoic acid and elemene on apoptosis of cultured keratinocytes were studied with TUNEL method, flow cytometry and DNA fragmentation extraction.Results It was found that there were a large number of apoptotic cells throughout all layers of psoriatic epidermis in 19 of 28 patients and relatively small amount in upper epidermal layers in 9 of 28 patients. Retinoic acid at concentrations of 1,5,10,20μg/mL and elemene at 20,40,60,80μg/mL could induce apoptosis of cultured Colo-16 keratinocytes in vitro. Conclusion These results indicate that the number of apoptotic cells increased abnormally in psoriasis. Retinoic acid and elemene at certain concentrations could induce apoptosis of cultured Colo-16 keratinocytes in vitro.
, 百拇医药
【Key words】 Psoriasis Apoptosis Tretinoin Elemene
近年来人们认识到细胞凋亡不仅在皮肤发育、更新、平衡稳定中起作用，在某些增殖性皮肤病如银屑病中也表现异常。许多细胞的增殖都需要双重信号，第一信号有引起细胞增殖或凋亡两种可能性，第二信号决定细胞进入增殖状态，若没有第二信号的作用，细胞进入凋亡状态[1]。因此，细胞增殖与凋亡密切相关。我们从细胞凋亡的角度探讨银屑病患者角质形成细胞增殖过度的机理，采用TUNEL法观察银屑病患者角质形成细胞凋亡的变化，同时应用流式细胞仪和DNA片段化分析观察不同浓度的维A酸和榄香烯体外诱导Colo-16细胞凋亡。现将研究报道如下。
材料和方法
皮肤标本：28份银屑病皮损石蜡标本均选自北京医科大学第三医院皮肤科门诊及住院确诊的寻常型银屑病患者(皆属静止期)，28例中，男18例，女10例，年龄18～42岁，平均24岁。4份对照标本取自成型科手术的正常皮肤(4例皆为男性，平均年龄21岁)，所取皮肤标本均获患者的同意。
, 百拇医药
人表皮角质形成细胞株Colo-16：日本北里大学医学部皮肤科Hikaru博士惠赠。全反式维A酸：上海药物研究所产品。榄香烯乳：大连药物研究所产品(5mg/mL)。
TUNEL法：切片常规脱蜡至水；0.2N HCl 10min；蛋白酶K(100μg/mL)10min；末端标记反应：2mmol/L dNTP(Dig-dUTP)、5×TdT缓冲液、TdT酶、无菌水37℃ 2h；洗片；5%马血清封闭；加抗Dig-ap复合物抗体(1∶500)37℃、30min；BCIP/NBT避光显色。阳性细胞为胞核染色质呈紫蓝色，阴性对照不加TdT酶，其余步骤同前。每例切片计数10～20个400倍视野，以平均每100个细胞中含凋亡细胞个数作为凋亡指数(AI)。
角质形成细胞培养：人角质形成细胞株Colo-16细胞培养于50cm2培养瓶，达到90%左右的融合单层时更换成无血清的RPMI-1640培养液，分别加入维A酸和榄香烯，使维A酸的终浓度为1、5、10、20μg/mL，榄香烯的终浓度为20、40、60、80μg/mL(参考文献[4]所述剂量，略加调整)，培养24h。
, http://www.100md.com
流式细胞仪分析：将上述培养的人角质形成细胞制成1×106/mL单细胞悬液，离心弃上清液，加入1mL的PI(磷脂酰肌醇)染液，用FACS仪检测亚二倍体峰所占的百分率，每样本重复2次。 DNA片段的提取：将上述培养的人角质形成细胞收集起来，常规提取DNA(加0.5μg/L溴化乙锭)，电泳，紫外灯下观察结果。
结 果
1.4例正常表皮仅在颗粒层能见到少量凋亡细胞。28例银屑病患者中19例表皮可见大量凋亡细胞分布于表皮各层，9例表皮凋亡细胞较少，分布在棘细胞层和颗粒层。
2.流式细胞仪分析：从表1可见，维A酸和榄香烯皆可诱导人角质形成细胞株Colo-16的凋亡，在一定范围内，浓度愈高，其AP峰愈大。
表1 不同浓度维A酸及揽香烯诱导角质形成细胞凋亡(
±s) 组 别
, 百拇医药
亚二倍体细胞的百分含量(%)
t值*
对照组
16.87±0.88
-
维A酸
1μg/mL
21.96±0.42
7.38
5μg/mL
24.68±0.90
8.78
, 百拇医药
10μg/mL
37.18±0.31
30.79
20μg/mL
45.75±0.56
39.16
揽香烯
20μg/mL
19.78±0.13
4.63
40μg/mL
27.33±1.25
, 百拇医药
9.60
60μg/mL
40.66±1.32
21.21
80μg/mL
48.23±0.76
38.14
*与对照组比较t值
3.DNA片段化分析：从图1、2中可见，不同浓度维A酸和榄香烯皆可诱导体外培养的人角质形成细胞株Colo-16的凋亡，其浓度愈高，作用愈明显。
, 百拇医药
图1 不同浓度维A酸诱导体外培养的角质形成细胞凋亡，由DNA梯度图可见维A酸浓度为5μg/mL时Colo-16细胞凋亡显著
图2 不同浓度榄香烯诱导体外培养的角质形成细胞凋亡，由DNA梯度图可见榄香烯浓度为40μg/mL时，Colo-16细胞凋亡显著
讨 论
我们用TUNEL法检测银屑病患者表皮的凋亡细胞，发现凋亡细胞明显多于正常表皮，这提示银屑病患者表皮不仅增生过度，而且细胞凋亡也异常增多，这可能也是机体自身调节，拮抗表皮的过度增生，使银屑病损害处自身保持病理性的动态平衡，临床上表现为增殖性红斑和脱屑。
我们应用流式细胞仪分析和DNA片段的提取及琼脂糖电泳，观察不同浓度的维A酸和榄香烯对人角质形成细胞株Colo-16细胞凋亡的影响，发现4种不同浓度的维A酸和榄香烯具有诱导细胞凋亡的作用，在实验浓度范围内，随着浓度的增高，凋亡细胞也增多。维A酸在胚胎发育、细胞分化和成熟中起着重要的作用[2]，在表皮中既影响角质形成细胞增殖与分化，又影响表皮细胞凋亡[3]。榄香烯是从中药莪术中提取的抗癌有效成分，是以β-榄香烯为主要成分的榄香烯类化合物，实验药理学和临床试验都发现，榄香烯对肿瘤有确切疗效[4，5]。临床上应用榄香烯治疗银屑病亦见报道[6]。榄香烯与维A酸都具有抑制角质形成细胞增殖和诱导角质形成细胞凋亡的双重作用，它们可能在较低浓度范围内主要诱导细胞凋亡，而在较高浓度范围内则主要抑制或杀伤细胞。细胞凋亡对机体维持平衡有很重要的功能，凋亡过程受细胞内外环境因素的影响，通过诱导角质形成细胞凋亡进行免疫调节，使机体处于稳定状态。
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国家教委博士点基金资助
参考文献
1 李君庆， 张均田. 细胞程序性死亡与疾病. 中国药学杂志, 1996,31:198-200.
2 Gudas LJ. Retinoids, retinoid-responsive genes, cell differentiation and cancer. Cell Growth Differ, 1992,3:655-662.
3 Haake AR, Polakowska RR. Cell death by apoptosis in epidermal biology. J Invest Dermatol, 1993,101:107-112.
4 傅乃武，金兰萍，郭水泗，等.β-榄香烯的抗肿瘤作用和药理学研究.中药通报, 1984,9:35.
5 时继慧，李成章，刘德兰，等. 温莪术挥发油的实验药理研究：β-榄香烯的抗肿瘤作用的研究. 中药通报, 1981,6:36.
6 谷玉琴，李秀君，陈玉仁，等.0.5%β榄香烯治疗银屑病53例.中华皮肤科杂志, 1994,27:154.
(收稿：1998-01-05 修回：1998-08-24), http://www.100md.com
单位：100083 北京医科大学第三医院皮肤科
关键词：银屑病；细胞死亡；维甲酸；榄香烯
中华皮肤科杂志990211 【摘 要】 目的 探讨银屑病患者角质形成细胞凋亡以及维A酸与榄香烯对体外培养的角质形成细胞凋亡的影响。方法 用TUNEL法测定28例银屑病患者角质形成细胞凋亡；流式细胞仪和DNA片段化观察维A酸与榄香烯对体外培养的角质形成细胞凋亡的影响。结果 28例银屑病患者中19例有大量凋亡细胞分布于表皮各层，另9例较少，分布于棘细胞层和颗粒层。浓度为1、5、10、20μg/mL的维A酸和浓度为20、40、60、80μg/mL的榄香烯可促进人角质形成细胞株Colo-16细胞凋亡。结论 银屑病患者角质形成细胞凋亡异常增多，一定浓度的维A酸与榄香烯可在实验室内促进人角质形成细胞株Colo-16细胞凋亡。
, 百拇医药 Apoptosis of Psoriatic Keratinocytes and the Effects of Retinoic
Acid and Elemene on Apoptosis of Cultured Keratinocytes
LIU Zhenxiang, LI Shiyin.
Department of Dermatology, Third Hospital of Beijing Medical University, Beijing 100083
【Abstract】 Objective To investigate apoptosis of psoriatic keratinocytes and the effects of retinoic acid and elemene on apoptosis of cultured keratinocytes. Methods Apoptosis of psoriatic keratinocytes and the effects of retinoic acid and elemene on apoptosis of cultured keratinocytes were studied with TUNEL method, flow cytometry and DNA fragmentation extraction.Results It was found that there were a large number of apoptotic cells throughout all layers of psoriatic epidermis in 19 of 28 patients and relatively small amount in upper epidermal layers in 9 of 28 patients. Retinoic acid at concentrations of 1,5,10,20μg/mL and elemene at 20,40,60,80μg/mL could induce apoptosis of cultured Colo-16 keratinocytes in vitro. Conclusion These results indicate that the number of apoptotic cells increased abnormally in psoriasis. Retinoic acid and elemene at certain concentrations could induce apoptosis of cultured Colo-16 keratinocytes in vitro.
, 百拇医药
【Key words】 Psoriasis Apoptosis Tretinoin Elemene
近年来人们认识到细胞凋亡不仅在皮肤发育、更新、平衡稳定中起作用，在某些增殖性皮肤病如银屑病中也表现异常。许多细胞的增殖都需要双重信号，第一信号有引起细胞增殖或凋亡两种可能性，第二信号决定细胞进入增殖状态，若没有第二信号的作用，细胞进入凋亡状态[1]。因此，细胞增殖与凋亡密切相关。我们从细胞凋亡的角度探讨银屑病患者角质形成细胞增殖过度的机理，采用TUNEL法观察银屑病患者角质形成细胞凋亡的变化，同时应用流式细胞仪和DNA片段化分析观察不同浓度的维A酸和榄香烯体外诱导Colo-16细胞凋亡。现将研究报道如下。
材料和方法
皮肤标本：28份银屑病皮损石蜡标本均选自北京医科大学第三医院皮肤科门诊及住院确诊的寻常型银屑病患者(皆属静止期)，28例中，男18例，女10例，年龄18～42岁，平均24岁。4份对照标本取自成型科手术的正常皮肤(4例皆为男性，平均年龄21岁)，所取皮肤标本均获患者的同意。
, 百拇医药
人表皮角质形成细胞株Colo-16：日本北里大学医学部皮肤科Hikaru博士惠赠。全反式维A酸：上海药物研究所产品。榄香烯乳：大连药物研究所产品(5mg/mL)。
TUNEL法：切片常规脱蜡至水；0.2N HCl 10min；蛋白酶K(100μg/mL)10min；末端标记反应：2mmol/L dNTP(Dig-dUTP)、5×TdT缓冲液、TdT酶、无菌水37℃ 2h；洗片；5%马血清封闭；加抗Dig-ap复合物抗体(1∶500)37℃、30min；BCIP/NBT避光显色。阳性细胞为胞核染色质呈紫蓝色，阴性对照不加TdT酶，其余步骤同前。每例切片计数10～20个400倍视野，以平均每100个细胞中含凋亡细胞个数作为凋亡指数(AI)。
角质形成细胞培养：人角质形成细胞株Colo-16细胞培养于50cm2培养瓶，达到90%左右的融合单层时更换成无血清的RPMI-1640培养液，分别加入维A酸和榄香烯，使维A酸的终浓度为1、5、10、20μg/mL，榄香烯的终浓度为20、40、60、80μg/mL(参考文献[4]所述剂量，略加调整)，培养24h。
, http://www.100md.com
流式细胞仪分析：将上述培养的人角质形成细胞制成1×106/mL单细胞悬液，离心弃上清液，加入1mL的PI(磷脂酰肌醇)染液，用FACS仪检测亚二倍体峰所占的百分率，每样本重复2次。 DNA片段的提取：将上述培养的人角质形成细胞收集起来，常规提取DNA(加0.5μg/L溴化乙锭)，电泳，紫外灯下观察结果。
结 果
1.4例正常表皮仅在颗粒层能见到少量凋亡细胞。28例银屑病患者中19例表皮可见大量凋亡细胞分布于表皮各层，9例表皮凋亡细胞较少，分布在棘细胞层和颗粒层。
2.流式细胞仪分析：从表1可见，维A酸和榄香烯皆可诱导人角质形成细胞株Colo-16的凋亡，在一定范围内，浓度愈高，其AP峰愈大。
表1 不同浓度维A酸及揽香烯诱导角质形成细胞凋亡(
±s) 组 别, 百拇医药
亚二倍体细胞的百分含量(%)
t值*
对照组
16.87±0.88
-
维A酸
1μg/mL
21.96±0.42
7.38
5μg/mL
24.68±0.90
8.78
, 百拇医药
10μg/mL
37.18±0.31
30.79
20μg/mL
45.75±0.56
39.16
揽香烯
20μg/mL
19.78±0.13
4.63
40μg/mL
27.33±1.25
, 百拇医药
9.60
60μg/mL
40.66±1.32
21.21
80μg/mL
48.23±0.76
38.14
*与对照组比较t值
3.DNA片段化分析：从图1、2中可见，不同浓度维A酸和榄香烯皆可诱导体外培养的人角质形成细胞株Colo-16的凋亡，其浓度愈高，作用愈明显。
, 百拇医药
图1 不同浓度维A酸诱导体外培养的角质形成细胞凋亡，由DNA梯度图可见维A酸浓度为5μg/mL时Colo-16细胞凋亡显著
图2 不同浓度榄香烯诱导体外培养的角质形成细胞凋亡，由DNA梯度图可见榄香烯浓度为40μg/mL时，Colo-16细胞凋亡显著
讨 论
我们用TUNEL法检测银屑病患者表皮的凋亡细胞，发现凋亡细胞明显多于正常表皮，这提示银屑病患者表皮不仅增生过度，而且细胞凋亡也异常增多，这可能也是机体自身调节，拮抗表皮的过度增生，使银屑病损害处自身保持病理性的动态平衡，临床上表现为增殖性红斑和脱屑。
我们应用流式细胞仪分析和DNA片段的提取及琼脂糖电泳，观察不同浓度的维A酸和榄香烯对人角质形成细胞株Colo-16细胞凋亡的影响，发现4种不同浓度的维A酸和榄香烯具有诱导细胞凋亡的作用，在实验浓度范围内，随着浓度的增高，凋亡细胞也增多。维A酸在胚胎发育、细胞分化和成熟中起着重要的作用[2]，在表皮中既影响角质形成细胞增殖与分化，又影响表皮细胞凋亡[3]。榄香烯是从中药莪术中提取的抗癌有效成分，是以β-榄香烯为主要成分的榄香烯类化合物，实验药理学和临床试验都发现，榄香烯对肿瘤有确切疗效[4，5]。临床上应用榄香烯治疗银屑病亦见报道[6]。榄香烯与维A酸都具有抑制角质形成细胞增殖和诱导角质形成细胞凋亡的双重作用，它们可能在较低浓度范围内主要诱导细胞凋亡，而在较高浓度范围内则主要抑制或杀伤细胞。细胞凋亡对机体维持平衡有很重要的功能，凋亡过程受细胞内外环境因素的影响，通过诱导角质形成细胞凋亡进行免疫调节，使机体处于稳定状态。
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国家教委博士点基金资助
参考文献
1 李君庆， 张均田. 细胞程序性死亡与疾病. 中国药学杂志, 1996,31:198-200.
2 Gudas LJ. Retinoids, retinoid-responsive genes, cell differentiation and cancer. Cell Growth Differ, 1992,3:655-662.
3 Haake AR, Polakowska RR. Cell death by apoptosis in epidermal biology. J Invest Dermatol, 1993,101:107-112.
4 傅乃武，金兰萍，郭水泗，等.β-榄香烯的抗肿瘤作用和药理学研究.中药通报, 1984,9:35.
5 时继慧，李成章，刘德兰，等. 温莪术挥发油的实验药理研究：β-榄香烯的抗肿瘤作用的研究. 中药通报, 1981,6:36.
6 谷玉琴，李秀君，陈玉仁，等.0.5%β榄香烯治疗银屑病53例.中华皮肤科杂志, 1994,27:154.
(收稿：1998-01-05 修回：1998-08-24), http://www.100md.com