反义蛋白激酶Cζ对角质形成细胞增殖的影响
作者：张晓艳 马圣清 柳惠图
单位：北京医科大学第一医院皮肤科；张晓艳 现在北京中日友好医院西医皮肤科 100029；马圣清 北京师范大学生物系(柳惠图)
关键词：蛋白激酶C；角蛋白细胞
中华皮肤科杂志990203 【摘要】 目的 研究蛋白激酶C(PKC)ζ亚类在角质形成细胞增殖中的作用。方法 采用基因转染的方法将PKCζ基因导入角质形成细胞株Colo16中，初步研究了表达反义PKCζ对Colo16角质形成细胞增殖的影响。 结果 表达反义PKCζ的角质形成细胞形态发生改变，生长速率明显减慢，被阻抑在G1期。结论 反义PKCζ抑制Colo16角质形成细胞的增殖。
Influence of Expression of Antisense Protein Kinase Cζ
, 百拇医药
on the Proliferation of Keratinocytic Cell Line-Colo16
ZHANG Xiaoyan,MA Shengqing,LIU Huitu.
Department of Dermatology, China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029
【Abstract】 Objective To investigate the role of protein kinase Cζ (PKCζ)in the proliferation of keratinocytes. Methods By gene transfection, the influence of the expression of antisense PKCζ on the proliferation of keratinocytic cell line-Colo16 was studied. Results The morphology of the keratinocytes expressing antisense PKCζ was changed, the growth rate of the keratinocytes reduced significantly, and they were inhibited in G1 phase. Conclusion The expression of antisense PKCζ inhibits the proliferation of Colo16 keratinocytes.
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【Key words】 Protein kinase C Keratinocytes
蛋白激酶C(PKC)是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，其功能是将细胞外信号传递至细胞核内，通过激活转录因子导致细胞分裂增殖或者是分化、或凋亡、或进入静止状态[1]。大量研究表明，过表达PKC某些亚类可引起细胞的生长失调[2]，许多肿瘤细胞中PKC亚类过表达，PKC抑制剂已用于恶性肿瘤的一期临床中[3]。近年的研究表明PKCζ可促进多种细胞的增殖[4，5]，但其在表皮细胞增殖中的作用目前尚未见报道。我们已通过原位杂交和免疫组化的方法证明，PKCζ在银屑病皮损中高表达，初步表明，PKCζ可能参与银屑病角质形成细胞增殖的调节，本文通过基因转染的方法将反义PKCζ的真核表达质粒导入人角质形成细胞株Colo16中，研究选择性地封闭或抑制PKCζ亚类是否可以阻抑Colo16角质形成细胞的增殖，为深入研究PKCζ在角质形成细胞增殖调控中的作用以及为PKC信号传导疗法治疗表皮增殖性疾患提供实验依据。
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材料和方法
一、实验材料
Colo16人角质形成细胞株由日本北里大学Hikaru博士惠赠。正常人表皮取自北京医科大学第一医院烧伤科患者的正常皮肤。PTB654-PKCζ由日本神户大学Ono 教授惠赠，质粒PcDNA3由北京医科大学生化系侯维敏教授惠赠。DMEM、Lipofectin购自美国Gibco公司，内切酶等购自美国Promega公司，DEPC等生化试剂购自美国Sigma公司。
二、实验方法
质粒的重组构建和点杂交均按《分子克隆》的方法进行。基因转染按脂质体转染试剂盒说明进行，转染反义PKCζ的细胞称之为AB，转染空载体的细胞称之为CD，未经转染的细胞称之为Colo。分别观察同样条件下AB、CD、Colo细胞的形态变化，Giemsa染色。取对数生长期细胞，常规培养1周，绘制生长曲线。收集对数生长期细胞，70%冷乙醇固定后，RNase消化，PI染色0.5h，上机测定细胞周期时相。
, 百拇医药
结 果
一、反义PKCζ重组质粒的鉴定 PKCζ全长2.661kb, PcDNA3全长5.4kb, 二者重组后全长8.06kb；PKC ζ和PcDNA3(多克隆位点除外)序列中均无KpnI和XholI位点，所以用他们消化重组子均产生8.06kb的片段。PKCζ和 PcDNA3均有一个BamHI位点，可用其鉴定PKCζ插入的方向。
BamHI消化重组子产生1.03kb和7.03kb二条带(图1)，证明 PKCζ已反向插入PcDNA3中。
图1 PcDNA3-蛋白激酶C(PKC)ζ重组质粒的酶切电泳鉴定：1.PKCζ的全长cDNA，2.PcDNA3/EcoRⅠ，3.PcDNA3-PKCζ/XholⅠ,4.pcDNA3-PKCζ/EcoRⅠ,5.PcDNA3-PKCζ/KpnⅠ,6.PcDNA3-PKCζ/BamHⅠ,7.λDNA3/HindⅢ
, 百拇医药
二、PKCζ在正常人和Colo16角质形成细胞中的表达
点杂交表明，Colo16角质形成细胞中PKCζ基因的表达较正常人角质形成细胞明显增强，见图2。
图2 点杂交分析示细胞中蛋白激酶Cζ的mRNA水平：A.正常人角质形成细胞，B.Colo16角质形成细胞
三、表达反义PKCζ对角质形成细胞株Colo16增殖的影响
1.细胞形态：分别观察了表达反义PKCζ的角质形成细胞 AB(图3)，转染空载体的细胞CD(图4)及未经转染的角质形成细胞Colo(图5)在含10%血清的DMEM中的形态特征。发现：AB的形态较规则、胞浆较丰富、折光性较差、细胞轮廓较模糊、伸展性较好，而对照细胞CD及Colo的形态不规则、胞浆较少、折光性强、细胞轮廓清晰可辨、伸展性较差。
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图3 转染反义蛋白激酶Cζ的角质形成细胞形态 图4 转染空载体的角质形成细胞 图5 未经过转染的细胞
2.生长曲线：分别观察了AB、CD及Colo在含10%血清的DMEM中的生长特性。三种细胞的生长曲线表明，表达反义PKCζ的角质形成细胞的生长速率较表达空载体和未经任何处理的角质形成细胞明显减慢，见图6。
图6 三种细胞的生长曲线
3.细胞周期分析：应用流式细胞术分析了AB、CD和Colo的细胞周期时相，结果，表达反义PKCζ的AB细胞与对照组相比，G1期细胞百分率明显提高，由26%上升为69%，而S期细胞百分率明显下降，由67%降至21%。
, 百拇医药
讨 论
基因转染是近年来兴起的一种先进的分子生物学实验技术，许多癌基因功能的发现正是通过这一方法来实现的。我们首先通过点杂交发现Colo16细胞中PKCζ基因的表达明显高于正常人角质形成细胞，Colo16是一种表皮鳞状细胞癌细胞株；我们在以往的研究中通过原位杂交和免疫组化的方法发现银屑病表皮中PKCζ基因的表达较正常表皮显著增强，这些均表明PKCζ可能参与了角质形成细胞过度增殖的调节。为此我们进行了如下研究，构建了表达反义PKCζ的真核表达质粒，并通过基因转染的方法将反义PKCζ导入Colo16角质形成细胞中，建立了稳定表达反义PKCζ的角质形成细胞模型。通过生长曲线测定发现，转染反义PKCζ的角质形成细胞生长速率较转染空载体和未经转染的角质形成细胞明显减慢。流式细胞分析发现，与对照细胞CD和Colo相比，转染反义PKCζ的细胞S期细胞百分率显著下降而G1期细胞百分率明显提高，表明表达反义PKCζ在PKCζ低水平情况下使角质形成细胞Colo16生长减慢，这可能与细胞被阻抑在G1期有关。生长曲线与流式细胞分析表明反义PKCζ之导入抑制了角质形成细胞Colo16的增殖。
, 百拇医药
虽然PKCζ在角质形成细胞增殖中的作用目前尚不清楚，但PKCζ在其他种类细胞增殖中的作用已有文献报道。通过假底物肽抑制PKCζ，导致蟾蜍卵巢细胞成熟通路的封闭[4]；PKCζ反义RNA或反义寡核酸可抑制成纤维细胞的生长[5]；在鲨鱼分裂的肠腺细胞中，PKCζ与纺垂体相连，表明PKCζ在真核有丝分裂信号传导中发挥作用[6]；TPA处理培养的黑素细胞引起几乎所有PKC亚类下调，但PKCζ亚类的活性却升高，并与黑素细胞的生长相平行[7]，表明TPA引起的黑素细胞生长的加速由PKCζ来介导，这些研究均表明PKCζ促进多种细胞的增殖。本文的研究证明反义PKCζ抑制角质形成细胞的过度增殖，间接表明PKCζ可促进角质形成细胞的增殖，同时表明PKCζ亚类可能参与了银屑病角质形成细胞过度增殖的调节，应用反义PKCζ转染银屑病角质形成细胞将会更直接地说明这一问题，有待于今后进一步的研究。
参考文献
1 Dekker LV, Parker PJ. Protein kinase C- a question of specificity. TIBS, 1994, 19: 73-74.
, 百拇医药
2 Nishizuka Y. The molecular heterogeneity of protein kinase C and its implications for cellular regulation. Nature, 1988, 334:661-665.
3 Lord JM, Pongracz J. Protein kinase C : a family of isoenzymes with distinct roles in pathogenesis. J Clin Pathol: Mol Pathol, 1995, 48: M57-M64.
4 Dominguez I, Diaz-Meco MT, Municio MM, et al. Evidence for a role of protein kinase Cζ subspecies in maturation of Xenopus laevis oocytes. Mol Cell Biol , 1992, 12:3776-3783.
, 百拇医药
5 Berra E, Diaz-Meco MT, Dominguez I, et al. Protein kinase Cζ isoform is critical for mitogenic signal transduction. Cell , 1993,74:555-563.
6 Lehrich RW, Forrest JN. Protein kinase Cζ is associated with the mitotic apparatus in primary cell cultures of the shark rectal gland. J Biol Chem, 1994, 269:32446-32450.
7 Oka M,Ogita K,Ando H,et al.Differential down-regulation of protein kinase C subspecies in normal human melanocytes:possible involvement of the ζ subspecies in growth regulation. J Invest Dermatol, 1995, 105:567-571.
(收稿：1998-03-17 修回：1998-09-09), 百拇医药
单位：北京医科大学第一医院皮肤科；张晓艳 现在北京中日友好医院西医皮肤科 100029；马圣清 北京师范大学生物系(柳惠图)
关键词：蛋白激酶C；角蛋白细胞
中华皮肤科杂志990203 【摘要】 目的 研究蛋白激酶C(PKC)ζ亚类在角质形成细胞增殖中的作用。方法 采用基因转染的方法将PKCζ基因导入角质形成细胞株Colo16中，初步研究了表达反义PKCζ对Colo16角质形成细胞增殖的影响。 结果 表达反义PKCζ的角质形成细胞形态发生改变，生长速率明显减慢，被阻抑在G1期。结论 反义PKCζ抑制Colo16角质形成细胞的增殖。
Influence of Expression of Antisense Protein Kinase Cζ
, 百拇医药
on the Proliferation of Keratinocytic Cell Line-Colo16
ZHANG Xiaoyan,MA Shengqing,LIU Huitu.
Department of Dermatology, China-Japan Friendship Hospital, Beijing 100029
【Abstract】 Objective To investigate the role of protein kinase Cζ (PKCζ)in the proliferation of keratinocytes. Methods By gene transfection, the influence of the expression of antisense PKCζ on the proliferation of keratinocytic cell line-Colo16 was studied. Results The morphology of the keratinocytes expressing antisense PKCζ was changed, the growth rate of the keratinocytes reduced significantly, and they were inhibited in G1 phase. Conclusion The expression of antisense PKCζ inhibits the proliferation of Colo16 keratinocytes.
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【Key words】 Protein kinase C Keratinocytes
蛋白激酶C(PKC)是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，其功能是将细胞外信号传递至细胞核内，通过激活转录因子导致细胞分裂增殖或者是分化、或凋亡、或进入静止状态[1]。大量研究表明，过表达PKC某些亚类可引起细胞的生长失调[2]，许多肿瘤细胞中PKC亚类过表达，PKC抑制剂已用于恶性肿瘤的一期临床中[3]。近年的研究表明PKCζ可促进多种细胞的增殖[4，5]，但其在表皮细胞增殖中的作用目前尚未见报道。我们已通过原位杂交和免疫组化的方法证明，PKCζ在银屑病皮损中高表达，初步表明，PKCζ可能参与银屑病角质形成细胞增殖的调节，本文通过基因转染的方法将反义PKCζ的真核表达质粒导入人角质形成细胞株Colo16中，研究选择性地封闭或抑制PKCζ亚类是否可以阻抑Colo16角质形成细胞的增殖，为深入研究PKCζ在角质形成细胞增殖调控中的作用以及为PKC信号传导疗法治疗表皮增殖性疾患提供实验依据。
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材料和方法
一、实验材料
Colo16人角质形成细胞株由日本北里大学Hikaru博士惠赠。正常人表皮取自北京医科大学第一医院烧伤科患者的正常皮肤。PTB654-PKCζ由日本神户大学Ono 教授惠赠，质粒PcDNA3由北京医科大学生化系侯维敏教授惠赠。DMEM、Lipofectin购自美国Gibco公司，内切酶等购自美国Promega公司，DEPC等生化试剂购自美国Sigma公司。
二、实验方法
质粒的重组构建和点杂交均按《分子克隆》的方法进行。基因转染按脂质体转染试剂盒说明进行，转染反义PKCζ的细胞称之为AB，转染空载体的细胞称之为CD，未经转染的细胞称之为Colo。分别观察同样条件下AB、CD、Colo细胞的形态变化，Giemsa染色。取对数生长期细胞，常规培养1周，绘制生长曲线。收集对数生长期细胞，70%冷乙醇固定后，RNase消化，PI染色0.5h，上机测定细胞周期时相。
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结 果
一、反义PKCζ重组质粒的鉴定 PKCζ全长2.661kb, PcDNA3全长5.4kb, 二者重组后全长8.06kb；PKC ζ和PcDNA3(多克隆位点除外)序列中均无KpnI和XholI位点，所以用他们消化重组子均产生8.06kb的片段。PKCζ和 PcDNA3均有一个BamHI位点，可用其鉴定PKCζ插入的方向。
BamHI消化重组子产生1.03kb和7.03kb二条带(图1)，证明 PKCζ已反向插入PcDNA3中。
图1 PcDNA3-蛋白激酶C(PKC)ζ重组质粒的酶切电泳鉴定：1.PKCζ的全长cDNA，2.PcDNA3/EcoRⅠ，3.PcDNA3-PKCζ/XholⅠ,4.pcDNA3-PKCζ/EcoRⅠ,5.PcDNA3-PKCζ/KpnⅠ,6.PcDNA3-PKCζ/BamHⅠ,7.λDNA3/HindⅢ
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二、PKCζ在正常人和Colo16角质形成细胞中的表达
点杂交表明，Colo16角质形成细胞中PKCζ基因的表达较正常人角质形成细胞明显增强，见图2。
图2 点杂交分析示细胞中蛋白激酶Cζ的mRNA水平：A.正常人角质形成细胞，B.Colo16角质形成细胞
三、表达反义PKCζ对角质形成细胞株Colo16增殖的影响
1.细胞形态：分别观察了表达反义PKCζ的角质形成细胞 AB(图3)，转染空载体的细胞CD(图4)及未经转染的角质形成细胞Colo(图5)在含10%血清的DMEM中的形态特征。发现：AB的形态较规则、胞浆较丰富、折光性较差、细胞轮廓较模糊、伸展性较好，而对照细胞CD及Colo的形态不规则、胞浆较少、折光性强、细胞轮廓清晰可辨、伸展性较差。
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图3 转染反义蛋白激酶Cζ的角质形成细胞形态 图4 转染空载体的角质形成细胞 图5 未经过转染的细胞
2.生长曲线：分别观察了AB、CD及Colo在含10%血清的DMEM中的生长特性。三种细胞的生长曲线表明，表达反义PKCζ的角质形成细胞的生长速率较表达空载体和未经任何处理的角质形成细胞明显减慢，见图6。
图6 三种细胞的生长曲线
3.细胞周期分析：应用流式细胞术分析了AB、CD和Colo的细胞周期时相，结果，表达反义PKCζ的AB细胞与对照组相比，G1期细胞百分率明显提高，由26%上升为69%，而S期细胞百分率明显下降，由67%降至21%。
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讨 论
基因转染是近年来兴起的一种先进的分子生物学实验技术，许多癌基因功能的发现正是通过这一方法来实现的。我们首先通过点杂交发现Colo16细胞中PKCζ基因的表达明显高于正常人角质形成细胞，Colo16是一种表皮鳞状细胞癌细胞株；我们在以往的研究中通过原位杂交和免疫组化的方法发现银屑病表皮中PKCζ基因的表达较正常表皮显著增强，这些均表明PKCζ可能参与了角质形成细胞过度增殖的调节。为此我们进行了如下研究，构建了表达反义PKCζ的真核表达质粒，并通过基因转染的方法将反义PKCζ导入Colo16角质形成细胞中，建立了稳定表达反义PKCζ的角质形成细胞模型。通过生长曲线测定发现，转染反义PKCζ的角质形成细胞生长速率较转染空载体和未经转染的角质形成细胞明显减慢。流式细胞分析发现，与对照细胞CD和Colo相比，转染反义PKCζ的细胞S期细胞百分率显著下降而G1期细胞百分率明显提高，表明表达反义PKCζ在PKCζ低水平情况下使角质形成细胞Colo16生长减慢，这可能与细胞被阻抑在G1期有关。生长曲线与流式细胞分析表明反义PKCζ之导入抑制了角质形成细胞Colo16的增殖。
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虽然PKCζ在角质形成细胞增殖中的作用目前尚不清楚，但PKCζ在其他种类细胞增殖中的作用已有文献报道。通过假底物肽抑制PKCζ，导致蟾蜍卵巢细胞成熟通路的封闭[4]；PKCζ反义RNA或反义寡核酸可抑制成纤维细胞的生长[5]；在鲨鱼分裂的肠腺细胞中，PKCζ与纺垂体相连，表明PKCζ在真核有丝分裂信号传导中发挥作用[6]；TPA处理培养的黑素细胞引起几乎所有PKC亚类下调，但PKCζ亚类的活性却升高，并与黑素细胞的生长相平行[7]，表明TPA引起的黑素细胞生长的加速由PKCζ来介导，这些研究均表明PKCζ促进多种细胞的增殖。本文的研究证明反义PKCζ抑制角质形成细胞的过度增殖，间接表明PKCζ可促进角质形成细胞的增殖，同时表明PKCζ亚类可能参与了银屑病角质形成细胞过度增殖的调节，应用反义PKCζ转染银屑病角质形成细胞将会更直接地说明这一问题，有待于今后进一步的研究。
参考文献
1 Dekker LV, Parker PJ. Protein kinase C- a question of specificity. TIBS, 1994, 19: 73-74.
, 百拇医药
2 Nishizuka Y. The molecular heterogeneity of protein kinase C and its implications for cellular regulation. Nature, 1988, 334:661-665.
3 Lord JM, Pongracz J. Protein kinase C : a family of isoenzymes with distinct roles in pathogenesis. J Clin Pathol: Mol Pathol, 1995, 48: M57-M64.
4 Dominguez I, Diaz-Meco MT, Municio MM, et al. Evidence for a role of protein kinase Cζ subspecies in maturation of Xenopus laevis oocytes. Mol Cell Biol , 1992, 12:3776-3783.
, 百拇医药
5 Berra E, Diaz-Meco MT, Dominguez I, et al. Protein kinase Cζ isoform is critical for mitogenic signal transduction. Cell , 1993,74:555-563.
6 Lehrich RW, Forrest JN. Protein kinase Cζ is associated with the mitotic apparatus in primary cell cultures of the shark rectal gland. J Biol Chem, 1994, 269:32446-32450.
7 Oka M,Ogita K,Ando H,et al.Differential down-regulation of protein kinase C subspecies in normal human melanocytes:possible involvement of the ζ subspecies in growth regulation. J Invest Dermatol, 1995, 105:567-571.
(收稿：1998-03-17 修回：1998-09-09), 百拇医药