银屑病患者血清抗重组85复合抗原体的检测及其意义
作者：尹跃平 吴勤学 李和莲 侯 伟 沈丹蓓
单位：210042 南京，中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所
关键词：
中华皮肤科杂志990222 有关银屑病与致病性抗酸分支杆菌的相关性国外有所报道，但未见有关深入的实验研究报道。我们已经发现在银屑病患者血清中存在着抗致病抗酸分支杆菌整菌抗体[1]，这提示致病性抗酸分支杆菌可能与银屑病存在相关性。85复合抗原是普遍存在于抗酸分支杆菌中的一种分泌蛋白， 相对分子质量约为31 000， 编码此蛋白的基因DNA全长约为900个碱基对[2]，具有多种生物学活性，现已证实此组抗原至少有85A、85B和85C 3种蛋白，在抗酸分支杆菌致病及发病机理中起重要的作用。为了进一步探讨抗酸分支杆菌与银屑病的相关性，我们测定了银屑病患者血清中抗85复合抗原A(85A)和85复合抗原B(85B)抗体的水平，其结果报告如下。
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一、材料和方法
1. 待检血清：取自本所门诊和住院的63例银屑病患者。其中寻常型银屑病51例，脓疱型银屑病5例，红皮病型银屑病7例。正常人对照组血清31份，取自体检合格的献血员，X线胸片均显示正常，由甘肃省地方病研究所提供。
2. 85复合抗原：本实验所用85A和85B均为通过基因工程技术制备纯化的麻风杆菌重组融合蛋白，其制备方法参考文献[3]。主要程序为：1诱导与表达： 将含有插入85复合抗原DNA片段的质粒转化大肠杆菌后，接种在LB培养基中，37℃培养至A600值为0.5左右，加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，继续培养4h；2菌蛋白提取：将培养液离心集菌后，用冻融及超声(Biorutor UCD-200T:日本东湘电气公司)的方法破菌壁，释放蛋白；3重组蛋白的纯化：将粗提的菌蛋白溶液装入亲和层析柱，用洗脱液(10mmol/L麦芽糖的磷酸缓冲液)收集重组融合蛋白，测定其纯度和浓度后，置-20℃备用。
, 百拇医药
3. 主要试剂和仪器：酶结合物HRP-IgA、 HRP-IgG 和HRP-IgM购自美国Dako公司；邻苯二胺(OPD)购自美国Sigma公司；DG-3022型酶联免疫检测仪购自南京华东电子管厂。
4. 抗体检测方法：采用酶联免疫吸附试验(ELISA)，方法参考文献[4]，其主要程序为：1抗原包被：选用上海塑料三厂生产的40孔聚苯乙烯酶标板，将重组85A或85B蛋白按5μg/mL浓度包被，50μL/孔，37℃至干(约18h)备用；2封闭非特异性抗原：封闭液为脱脂奶粉(5% )，0.2mL/孔，37℃反应1h；3血清反应：待检血清(1: 200稀释)0.1mL/孔，37℃反应1h；42抗反应：HRP-IgA, HRP-IgG 和HRP-IgM (1: 1000稀释)0.1mL/孔，37℃反应1h；5显色反应：以邻苯二胺(0.04%)做显色剂和1%H2O2做底物，0.1mL/孔，37℃反应30 min后用H2SO4(2.5N) 中止反应。
5. 统计学分析：在波长为490nm处测A值，每份标本做2孔，取其平均A值做为终结果。实验结果以 ±s表示，组间A值均数的比较采用t检验。
, 百拇医药
二、结果
1. 各型银屑病患者血清抗85复合抗原抗体水平(见表1)：各型银屑病患者血清抗85复合抗原抗体水平均高于正常人对照组，其P/N除脓疱型近似2.0外，总体和分型者均≥2.1，经统计学检验亦均有非常显著性差异。各型银屑病患者组之间统计学比较表明红皮病型银屑病患者血清抗85复合体A水平明显高于寻常型(t=2.24,P< 0.05)和脓疱型(t=2.34,P< 0.05)患者，而脓疱型与寻常型比较，t=0.85,P >0.05,无显著性差异，其抗体水平依次为红皮病型 >寻常型 >脓疱型。85复合体B水平在各型之间比较均无显著性差异。且在各型银屑病患者血清中抗85B抗体水平均高于抗85A抗体水平。
表1 银屑病患者及正常人对照组血清抗85复合抗原抗体水平(A值) 组 别
例 数
85A
, 百拇医药
85B
±s
t值*
P值±s
t值*
P值
正常人对照组
31
0.06±0.03
-
-
, 百拇医药
0.08±0.05
-
-
银屑病患者组
63
0.13±0.06
6.12
<0.01
0.17±0.11
4.33
<0.01
寻常组
51
, 百拇医药
0.13±0.06
6.04
<0.01
0.17±0.11
4.29
<0.01
红皮病型
7
0.19±0.08
7.01
<0.01
0.25±0.12
, http://www.100md.com 5.88
<0.01
脓胞型
5
0.11±0.04
3.75
<0.01
0.15±0.05
3.35
<0.01
注：*分别与正常人对照组比较
2. 银屑病患者血清3种抗85复合抗原的抗体水平(见表2)：在各型银屑病患者血清中抗85复合体抗原抗体水平均为IgG >IgM >IgA，其中IgG与IgM统计学上无显著性差异，而IgA与IgG及IgM相比均有非常显著性差异。在85B，IgM类抗体离散度较小，IgG类抗体离散度较高；在85A，IgM 类抗体和IgG类抗体的离散度均较小。提示有进一步扩大样本研究的必要。
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表2 12例银屑病患者血清3种抗85复合抗原的抗体水平 抗原
抗体类别
IgA
IgM
IgG
85A
0.01±0.01
0.12±0.05
0.15±0.07
85B
0.04±0.03
0.17±0.05
, 百拇医药
0.22±0.19
t值
3.29
2.47
1.20
P值
<0.01
<0.05
>0.05
三、讨论
此实验中所用85复合抗原为本组研究人员用基因工程方法从麻风杆菌(ML)基因库中克隆出的编码全长85复合抗原的基因片段，经DNA序列分析证明与其它抗酸分支杆菌85复合体DNA序列比较有75%左右的同序性[3]，所以从大肠杆菌中表达出来的重组ML85复合抗原蛋白，可以用于有关与抗酸分支杆菌相关抗原的研究。本次实验的结果表明在银屑病患者血清中存在抗85复合抗原的抗体，其意义在于：1支持在银屑病患者血清中存在抗酸分支杆菌抗体的事实；285复合抗原在银屑病发病中可能有作用。总之，85复合抗原因其较高的体液、细胞免疫性，在抗酸分支杆菌感染疾病的发病机理及疾病的诊断和预防中都有很重要的意义。我们的实验结果提示抗酸分支杆菌及其85复合抗原与银屑病可能存在相关性。但本次研究中检测的银屑病患者虽无临床结核体征，但无X线胸片资料，所以进一步扩大样本研究时我们将对待检患者进行X线胸透检查，以证实有无结核。同时检测其它有关疾病患者的血清，从而对银屑病患者血清中存在抗85复合抗原抗体的意义进行评价和探讨。
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参考文献
1 吴勤学，尹跃平， 李和莲，等. 银屑病患者血清抗致病分支杆菌抗体的检测. 中华皮肤科杂志，1999，32:119.
2 Abou-Zeid C, Ratliff TL, Wiker HG, et al. Characterization of fibronectin-binding antigens released by Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis BCG. Infect Immun, 1988,56:3046-3051.
3 尹跃平， 牧野正直，吴勤学，等. 麻风杆菌α- 抗原C基因的克隆及表达.中华皮肤科杂志，1996，29:343-345.
4 尹跃平， 铃木正彦， 牧野正直，等. 麻风杆菌重组融合蛋白α- 抗原的血清学活性.中国麻风杂志，1997，13:68-70.
(收稿：1998-03-26 修回：1998-10-05), 百拇医药
单位：210042 南京，中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所
关键词：
中华皮肤科杂志990222 有关银屑病与致病性抗酸分支杆菌的相关性国外有所报道，但未见有关深入的实验研究报道。我们已经发现在银屑病患者血清中存在着抗致病抗酸分支杆菌整菌抗体[1]，这提示致病性抗酸分支杆菌可能与银屑病存在相关性。85复合抗原是普遍存在于抗酸分支杆菌中的一种分泌蛋白， 相对分子质量约为31 000， 编码此蛋白的基因DNA全长约为900个碱基对[2]，具有多种生物学活性，现已证实此组抗原至少有85A、85B和85C 3种蛋白，在抗酸分支杆菌致病及发病机理中起重要的作用。为了进一步探讨抗酸分支杆菌与银屑病的相关性，我们测定了银屑病患者血清中抗85复合抗原A(85A)和85复合抗原B(85B)抗体的水平，其结果报告如下。
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一、材料和方法
1. 待检血清：取自本所门诊和住院的63例银屑病患者。其中寻常型银屑病51例，脓疱型银屑病5例，红皮病型银屑病7例。正常人对照组血清31份，取自体检合格的献血员，X线胸片均显示正常，由甘肃省地方病研究所提供。
2. 85复合抗原：本实验所用85A和85B均为通过基因工程技术制备纯化的麻风杆菌重组融合蛋白，其制备方法参考文献[3]。主要程序为：1诱导与表达： 将含有插入85复合抗原DNA片段的质粒转化大肠杆菌后，接种在LB培养基中，37℃培养至A600值为0.5左右，加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，继续培养4h；2菌蛋白提取：将培养液离心集菌后，用冻融及超声(Biorutor UCD-200T:日本东湘电气公司)的方法破菌壁，释放蛋白；3重组蛋白的纯化：将粗提的菌蛋白溶液装入亲和层析柱，用洗脱液(10mmol/L麦芽糖的磷酸缓冲液)收集重组融合蛋白，测定其纯度和浓度后，置-20℃备用。
, 百拇医药
3. 主要试剂和仪器：酶结合物HRP-IgA、 HRP-IgG 和HRP-IgM购自美国Dako公司；邻苯二胺(OPD)购自美国Sigma公司；DG-3022型酶联免疫检测仪购自南京华东电子管厂。
4. 抗体检测方法：采用酶联免疫吸附试验(ELISA)，方法参考文献[4]，其主要程序为：1抗原包被：选用上海塑料三厂生产的40孔聚苯乙烯酶标板，将重组85A或85B蛋白按5μg/mL浓度包被，50μL/孔，37℃至干(约18h)备用；2封闭非特异性抗原：封闭液为脱脂奶粉(5% )，0.2mL/孔，37℃反应1h；3血清反应：待检血清(1: 200稀释)0.1mL/孔，37℃反应1h；42抗反应：HRP-IgA, HRP-IgG 和HRP-IgM (1: 1000稀释)0.1mL/孔，37℃反应1h；5显色反应：以邻苯二胺(0.04%)做显色剂和1%H2O2做底物，0.1mL/孔，37℃反应30 min后用H2SO4(2.5N) 中止反应。
5. 统计学分析：在波长为490nm处测A值，每份标本做2孔，取其平均A值做为终结果。实验结果以 ±s表示，组间A值均数的比较采用t检验。
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二、结果
1. 各型银屑病患者血清抗85复合抗原抗体水平(见表1)：各型银屑病患者血清抗85复合抗原抗体水平均高于正常人对照组，其P/N除脓疱型近似2.0外，总体和分型者均≥2.1，经统计学检验亦均有非常显著性差异。各型银屑病患者组之间统计学比较表明红皮病型银屑病患者血清抗85复合体A水平明显高于寻常型(t=2.24,P< 0.05)和脓疱型(t=2.34,P< 0.05)患者，而脓疱型与寻常型比较，t=0.85,P >0.05,无显著性差异，其抗体水平依次为红皮病型 >寻常型 >脓疱型。85复合体B水平在各型之间比较均无显著性差异。且在各型银屑病患者血清中抗85B抗体水平均高于抗85A抗体水平。
表1 银屑病患者及正常人对照组血清抗85复合抗原抗体水平(A值) 组 别
例 数
85A
, 百拇医药
85B
±st值*
P值
±st值*
P值
正常人对照组
31
0.06±0.03
-
-
, 百拇医药
0.08±0.05
-
-
银屑病患者组
63
0.13±0.06
6.12
<0.01
0.17±0.11
4.33
<0.01
寻常组
51
, 百拇医药
0.13±0.06
6.04
<0.01
0.17±0.11
4.29
<0.01
红皮病型
7
0.19±0.08
7.01
<0.01
0.25±0.12
, http://www.100md.com 5.88
<0.01
脓胞型
5
0.11±0.04
3.75
<0.01
0.15±0.05
3.35
<0.01
注：*分别与正常人对照组比较
2. 银屑病患者血清3种抗85复合抗原的抗体水平(见表2)：在各型银屑病患者血清中抗85复合体抗原抗体水平均为IgG >IgM >IgA，其中IgG与IgM统计学上无显著性差异，而IgA与IgG及IgM相比均有非常显著性差异。在85B，IgM类抗体离散度较小，IgG类抗体离散度较高；在85A，IgM 类抗体和IgG类抗体的离散度均较小。提示有进一步扩大样本研究的必要。
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表2 12例银屑病患者血清3种抗85复合抗原的抗体水平 抗原
抗体类别
IgA
IgM
IgG
85A
0.01±0.01
0.12±0.05
0.15±0.07
85B
0.04±0.03
0.17±0.05
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0.22±0.19
t值
3.29
2.47
1.20
P值
<0.01
<0.05
>0.05
三、讨论
此实验中所用85复合抗原为本组研究人员用基因工程方法从麻风杆菌(ML)基因库中克隆出的编码全长85复合抗原的基因片段，经DNA序列分析证明与其它抗酸分支杆菌85复合体DNA序列比较有75%左右的同序性[3]，所以从大肠杆菌中表达出来的重组ML85复合抗原蛋白，可以用于有关与抗酸分支杆菌相关抗原的研究。本次实验的结果表明在银屑病患者血清中存在抗85复合抗原的抗体，其意义在于：1支持在银屑病患者血清中存在抗酸分支杆菌抗体的事实；285复合抗原在银屑病发病中可能有作用。总之，85复合抗原因其较高的体液、细胞免疫性，在抗酸分支杆菌感染疾病的发病机理及疾病的诊断和预防中都有很重要的意义。我们的实验结果提示抗酸分支杆菌及其85复合抗原与银屑病可能存在相关性。但本次研究中检测的银屑病患者虽无临床结核体征，但无X线胸片资料，所以进一步扩大样本研究时我们将对待检患者进行X线胸透检查，以证实有无结核。同时检测其它有关疾病患者的血清，从而对银屑病患者血清中存在抗85复合抗原抗体的意义进行评价和探讨。
, http://www.100md.com
参考文献
1 吴勤学，尹跃平， 李和莲，等. 银屑病患者血清抗致病分支杆菌抗体的检测. 中华皮肤科杂志，1999，32:119.
2 Abou-Zeid C, Ratliff TL, Wiker HG, et al. Characterization of fibronectin-binding antigens released by Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis BCG. Infect Immun, 1988,56:3046-3051.
3 尹跃平， 牧野正直，吴勤学，等. 麻风杆菌α- 抗原C基因的克隆及表达.中华皮肤科杂志，1996，29:343-345.
4 尹跃平， 铃木正彦， 牧野正直，等. 麻风杆菌重组融合蛋白α- 抗原的血清学活性.中国麻风杂志，1997，13:68-70.
(收稿：1998-03-26 修回：1998-10-05), 百拇医药