系统性红斑狼疮患者外周血单一核细胞CD40L表达增加及其临床意义
作者：邓安梅 仲人前 陈孙孝 施笑梅 孔宪涛
单位：200003上海第二军医大学附属长征医院全军临床免疫中心(邓安梅 仲人前 孔宪涛 施笑梅)，皮肤科(陈孙孝)
关键词：红斑狼疮；系统性CD40L
中华皮肤科杂志990404
【摘要】目的 了解CD40L在SLE患者自身抗体及免疫复合物形成中的作用。方法 采用流式细胞计数仪,对10例活动期SLE、10例缓解期SLE患者外周血单一核细胞CD40L的表达进行了研究。结果 活动期SLE组CD40L表达在抗CD3单抗刺激前后均显著高于正常对照组，而缓解期SLE组T细胞在抗CD3单抗刺激前的CD40L表达在正常范围内，在刺激后显著高于正常对照组。结论 SLE中CD40-CD40L途径存在缺陷，为进一步探讨SLE的发病机制提供了线索。
, 百拇医药
Increased Expression of CD40L on PBMC in Patients
with Systemic Lupus Erythematosus
DENG Anmei, ZHONG Renqian, CHEN Sunxiao, et al.
Clinical Immunology Center, Changzheng Hospital, Shanghai 200003
【Abstract】Objective To investigate the role of CD40L in the production of autoantibody and immune complex-mediated tissue damage. Methods The expression of CD40L on PBMC in patients with active or remission SLE was examined by flowcytometry. Results The CD40L expression in pateints with active SLE increased significantly before and after the stimulation of anti-CD3 mAb in comparison with normal controls. However, the CD40L expression in patients with remission SLE was normal before the stimulation and increased significantly after the stimulation of anti-CD3 mAb. Conclusion There is a defect of the CD40-CD40L pathway in SLE.
, 百拇医药
【Key words】Lupus erythematosus, systemic CD40L
系统性红斑狼疮(SLE)的主要病理改变是免疫复合物造成的器官和组织损伤。自身抗原特异性辅助性T细胞(Th)在病理性自身抗体的形成中起重要作用。而Th细胞通过CD40-CD40L连接作用于B细胞，从而诱导B细胞活化、增殖，产生从IgM到IgG的抗体[1]。为了研究CD40-CD40L途径在SLE中的作用，我们应用流式细胞计数仪，对10例活动期SLE、10例缓解期SLE患者及正常人外周血T细胞在抗CD3单抗刺激前后的CD40L表达进行了分析。
材料与方法
(一)患者:活动期SLE患者10例，平均年龄40岁，均为女性；缓解期SLE患者10例，平均年龄45岁，均为女性。所有患者均符合1982年美国风湿病学会制定的SLE分类标准[2]。正常对照组20例，取自献血者。
, 百拇医药
(二)主要试剂和仪器:FITC标记的抗CD40L、抗CD25抗体，TRITC标记的抗CD3单抗,正常小鼠IgG(Sigma公司)。细胞洗涤液为含2%灭活小牛血清和0.01%NaN3的PBS，0.15mol/LRBS溶解液，含0.8%戊二醛固定液的PBS。
稀释液：PEG6000 40.0g,NaF 10.0g,Na2HPO4·12H2O 101.5g,NaH2PO4·2H2O 10.0g,NaN31.0g,用蒸馏水溶解后加至1000mL,用G3玻璃滤器过滤，室温保存。
流式细胞计数仪为EPICS型(美国Coulter公司产品)。
(三)细胞培养:患者和正常人外周血单一核细胞(PBMC)经Ficoll-Hypaque液分离，在37℃，5%CO2中培养，培养基含RPMI1640，10%小牛血清，160U/mL青霉素和链霉素。1×106外周血单一核细胞(PBMC)在1mL培养基中单独或与抗CD3单抗共同孵育6h、24h、48h。
, http://www.100md.com
(四)流式细胞术分析:取50μL细胞悬液，分别加入FITC标记的抗CD40L、抗CD25单抗各20μL，在对照管中加入正常小鼠IgG 20μL,混匀后置4℃30min,用PBS洗3次，弃去上清液，加固定液0.5mL，尼龙网过滤后进行流式细胞计数分析。
(五)应用t检验进行统计学分析。
结果
1.在未经抗CD3单抗刺激时，活动期SLE患者PBMC中CD40L的表达比正常对照组显著增高(P<0.01),而缓解期SLE患者与正常对照组差异无显著性.在经搞CD3音搞刺激6h后,3组的CD40L表达均增加,而活动期和缓解期SLE患者均与正常对照组差别有显著性.见表1.
表1 SLE患者外周血单一核细胞CD40L在搞CD3单搞刺激前后的表达(%)
分组
, 百拇医药
例数
刺激前
刺激后
±st
t值*
P值±st
t值*
P值
正常对照组
20
0.89±
, 百拇医药
-
-
3.98±1.28
-
-
SLE患者
活动期
10
18.04±2.10
6.50
<0.01
25.24±2.87
5.53
, 百拇医药
<0.01
缓解期
10
1.25±0.20
1.93
>0.05
16,52±2.02
3.40
<0.01
注：*与正常对照组比较
2.活动期SLE患者PBMC的CD40L表达在经抗CD3单抗刺激6h后就显著增多，24h达高峰，到48h有所下降，但仍然高于正常。而缓解期SLE患者与正常对照组相似，在6h达高峰，至48h已接近正常。与CD40L不同，活动期SLE患者CD25(Tac)表达与缓解期SLE患者、正常对照组在48h内较相似(表2、3)。
, 百拇医药
表2 SLE患者外周血单一核细胞经抗CD3单抗刺激后的CD40L表达(荧光道数)
分 组
例数
时间
oh
6h
24h
48h
正常对照组
20
51.5±17.4
128.6±65.8
, http://www.100md.com
98.2±27.9
70.2±25.7
SLE患者
0
0
0
0
0
活动期
10
75.4±20.9
187.2±64.3
198.4±87.2
, http://www.100md.com
111.8±39.8
缓解期
10
53.1±16.3
178.4±50.9
112.8±25.9
78.9±22.3
表3 SLE患者外周血单一核细胞经搞CD3单搞刺激后的CD25表达(荧光道数)
分 组
例数
时间
oh
, 百拇医药
6h
24h
48h
正常对照组
20
49.2±13.2
53.2±12.8
159.8±66.9
400.6±201.4
SLE患者
活动期
10
64.2±25.1
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67.5±33.5
175.8±76.9
543.6±236.8
缓解期
10
52.6±22.5
59.7±33.8
165.7±15.4
523.4±234.2
讨论
SLE患者免疫系统出现紊乱，包括高γ-球蛋白血症、免疫复合物形成和补体损害。在体外试验中，SLE患者B细胞增殖，产生大量抗体，对T细胞来源的细胞因子具有高反应性。为了解SLE中Th细胞与B细胞间的作用，我们应用流式细胞计数仪，分析活动期SLE、缓解期SLE患者及正常人PBMC在抗CD3单抗刺激前后的CD40L表达。结果表明，未经抗CD3单抗刺激时，活动期SLE患者PBMC中CD40L的表达比正常对照组显著增高(P<0.01),这与以前在SLE模型NZB/NZW：F1代小鼠中CD401水平显著高于正常小鼠的研究结果一致[3]。进一步，不仅活动期，而且缓解期SLE患者的PBMC对抗CD3单抗的刺激均产生高反应。这提示SLE患者中CD41L表达的调控机制有缺陷。有研究表明，SLE患者中T细胞的其它信号转导途径也存在缺陷[4]。我们的结果还表明，SLE患者PBMC的CD40L表达在经抗CD3单抗刺激6h后显著增多，活动期患者48h内持续高于正常，而缓解期患者与正常对照组相似，至48h已接近正常。与CD40L不同，活动期SLE患者的CD25(Tac)表达与缓解期SLE患者、正常对照组在48h内较相似。然而CD40L表达的动力学与疾病病程间似无直接联系。患者的基础CD40L更能反映病情。在我们的病例中，处于晚期的患者的CD40L较早期患者高。已有研究表明，抗CD40L单抗在SLE模型NZB/NZW：F1代小鼠中具有疗效[5]。CD40-CD40L途径可作为SLE免疫治疗的一条线索。
, http://www.100md.com
国家自然科学基金资助(编号39770702)
参考文献
1 Banchereau JF,Bazan D,Blanchard F,et al.The CD40 antigen and its ligand.Ann Rev Immunol，1994，12:881- 885.
2 Tan EM,Cohen AS,Fries JF,et al.The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum, 1982,25:1271- 1273.
3 Mohan C,Shi Y,Laman JD,et al.Interaction between CD40 and its ligand gp39 in the development of murine lupus nephritis.J Immunol,1995,154:1470- 1475.
, http://www.100md.com
4 Vassilopoulos D,Kovacs B, GC Tsokos.TCR/CD3 complex-mediated signal transduction pathway in T cell lines from patients with SLE .J Immunol, 1995,155:2269- 2275.
5 Mary K,Douglas B,Mary KC. Increased expression of CD40L on systemic lupus erythematosus lymphocyte. J Clin Invest,1996,98:826- 829.
收稿：1998-08-26修回：1999-01-04, http://www.100md.com
单位：200003上海第二军医大学附属长征医院全军临床免疫中心(邓安梅 仲人前 孔宪涛 施笑梅)，皮肤科(陈孙孝)
关键词：红斑狼疮；系统性CD40L
中华皮肤科杂志990404
【摘要】目的 了解CD40L在SLE患者自身抗体及免疫复合物形成中的作用。方法 采用流式细胞计数仪,对10例活动期SLE、10例缓解期SLE患者外周血单一核细胞CD40L的表达进行了研究。结果 活动期SLE组CD40L表达在抗CD3单抗刺激前后均显著高于正常对照组，而缓解期SLE组T细胞在抗CD3单抗刺激前的CD40L表达在正常范围内，在刺激后显著高于正常对照组。结论 SLE中CD40-CD40L途径存在缺陷，为进一步探讨SLE的发病机制提供了线索。
, 百拇医药
Increased Expression of CD40L on PBMC in Patients
with Systemic Lupus Erythematosus
DENG Anmei, ZHONG Renqian, CHEN Sunxiao, et al.
Clinical Immunology Center, Changzheng Hospital, Shanghai 200003
【Abstract】Objective To investigate the role of CD40L in the production of autoantibody and immune complex-mediated tissue damage. Methods The expression of CD40L on PBMC in patients with active or remission SLE was examined by flowcytometry. Results The CD40L expression in pateints with active SLE increased significantly before and after the stimulation of anti-CD3 mAb in comparison with normal controls. However, the CD40L expression in patients with remission SLE was normal before the stimulation and increased significantly after the stimulation of anti-CD3 mAb. Conclusion There is a defect of the CD40-CD40L pathway in SLE.
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【Key words】Lupus erythematosus, systemic CD40L
系统性红斑狼疮(SLE)的主要病理改变是免疫复合物造成的器官和组织损伤。自身抗原特异性辅助性T细胞(Th)在病理性自身抗体的形成中起重要作用。而Th细胞通过CD40-CD40L连接作用于B细胞，从而诱导B细胞活化、增殖，产生从IgM到IgG的抗体[1]。为了研究CD40-CD40L途径在SLE中的作用，我们应用流式细胞计数仪，对10例活动期SLE、10例缓解期SLE患者及正常人外周血T细胞在抗CD3单抗刺激前后的CD40L表达进行了分析。
材料与方法
(一)患者:活动期SLE患者10例，平均年龄40岁，均为女性；缓解期SLE患者10例，平均年龄45岁，均为女性。所有患者均符合1982年美国风湿病学会制定的SLE分类标准[2]。正常对照组20例，取自献血者。
, 百拇医药
(二)主要试剂和仪器:FITC标记的抗CD40L、抗CD25抗体，TRITC标记的抗CD3单抗,正常小鼠IgG(Sigma公司)。细胞洗涤液为含2%灭活小牛血清和0.01%NaN3的PBS，0.15mol/LRBS溶解液，含0.8%戊二醛固定液的PBS。
稀释液：PEG6000 40.0g,NaF 10.0g,Na2HPO4·12H2O 101.5g,NaH2PO4·2H2O 10.0g,NaN31.0g,用蒸馏水溶解后加至1000mL,用G3玻璃滤器过滤，室温保存。
流式细胞计数仪为EPICS型(美国Coulter公司产品)。
(三)细胞培养:患者和正常人外周血单一核细胞(PBMC)经Ficoll-Hypaque液分离，在37℃，5%CO2中培养，培养基含RPMI1640，10%小牛血清，160U/mL青霉素和链霉素。1×106外周血单一核细胞(PBMC)在1mL培养基中单独或与抗CD3单抗共同孵育6h、24h、48h。
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(四)流式细胞术分析:取50μL细胞悬液，分别加入FITC标记的抗CD40L、抗CD25单抗各20μL，在对照管中加入正常小鼠IgG 20μL,混匀后置4℃30min,用PBS洗3次，弃去上清液，加固定液0.5mL，尼龙网过滤后进行流式细胞计数分析。
(五)应用t检验进行统计学分析。
结果
1.在未经抗CD3单抗刺激时，活动期SLE患者PBMC中CD40L的表达比正常对照组显著增高(P<0.01),而缓解期SLE患者与正常对照组差异无显著性.在经搞CD3音搞刺激6h后,3组的CD40L表达均增加,而活动期和缓解期SLE患者均与正常对照组差别有显著性.见表1.
表1 SLE患者外周血单一核细胞CD40L在搞CD3单搞刺激前后的表达(%)
分组
, 百拇医药
例数
刺激前
刺激后
±stt值*
P值
±stt值*
P值
正常对照组
20
0.89±
, 百拇医药
-
-
3.98±1.28
-
-
SLE患者
活动期
10
18.04±2.10
6.50
<0.01
25.24±2.87
5.53
, 百拇医药
<0.01
缓解期
10
1.25±0.20
1.93
>0.05
16,52±2.02
3.40
<0.01
注：*与正常对照组比较
2.活动期SLE患者PBMC的CD40L表达在经抗CD3单抗刺激6h后就显著增多，24h达高峰，到48h有所下降，但仍然高于正常。而缓解期SLE患者与正常对照组相似，在6h达高峰，至48h已接近正常。与CD40L不同，活动期SLE患者CD25(Tac)表达与缓解期SLE患者、正常对照组在48h内较相似(表2、3)。
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表2 SLE患者外周血单一核细胞经抗CD3单抗刺激后的CD40L表达(荧光道数)
分 组
例数
时间
oh
6h
24h
48h
正常对照组
20
51.5±17.4
128.6±65.8
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98.2±27.9
70.2±25.7
SLE患者
0
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活动期
10
75.4±20.9
187.2±64.3
198.4±87.2
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111.8±39.8
缓解期
10
53.1±16.3
178.4±50.9
112.8±25.9
78.9±22.3
表3 SLE患者外周血单一核细胞经搞CD3单搞刺激后的CD25表达(荧光道数)
分 组
例数
时间
oh
, 百拇医药
6h
24h
48h
正常对照组
20
49.2±13.2
53.2±12.8
159.8±66.9
400.6±201.4
SLE患者
活动期
10
64.2±25.1
, http://www.100md.com
67.5±33.5
175.8±76.9
543.6±236.8
缓解期
10
52.6±22.5
59.7±33.8
165.7±15.4
523.4±234.2
讨论
SLE患者免疫系统出现紊乱，包括高γ-球蛋白血症、免疫复合物形成和补体损害。在体外试验中，SLE患者B细胞增殖，产生大量抗体，对T细胞来源的细胞因子具有高反应性。为了解SLE中Th细胞与B细胞间的作用，我们应用流式细胞计数仪，分析活动期SLE、缓解期SLE患者及正常人PBMC在抗CD3单抗刺激前后的CD40L表达。结果表明，未经抗CD3单抗刺激时，活动期SLE患者PBMC中CD40L的表达比正常对照组显著增高(P<0.01),这与以前在SLE模型NZB/NZW：F1代小鼠中CD401水平显著高于正常小鼠的研究结果一致[3]。进一步，不仅活动期，而且缓解期SLE患者的PBMC对抗CD3单抗的刺激均产生高反应。这提示SLE患者中CD41L表达的调控机制有缺陷。有研究表明，SLE患者中T细胞的其它信号转导途径也存在缺陷[4]。我们的结果还表明，SLE患者PBMC的CD40L表达在经抗CD3单抗刺激6h后显著增多，活动期患者48h内持续高于正常，而缓解期患者与正常对照组相似，至48h已接近正常。与CD40L不同，活动期SLE患者的CD25(Tac)表达与缓解期SLE患者、正常对照组在48h内较相似。然而CD40L表达的动力学与疾病病程间似无直接联系。患者的基础CD40L更能反映病情。在我们的病例中，处于晚期的患者的CD40L较早期患者高。已有研究表明，抗CD40L单抗在SLE模型NZB/NZW：F1代小鼠中具有疗效[5]。CD40-CD40L途径可作为SLE免疫治疗的一条线索。
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国家自然科学基金资助(编号39770702)
参考文献
1 Banchereau JF,Bazan D,Blanchard F,et al.The CD40 antigen and its ligand.Ann Rev Immunol，1994，12:881- 885.
2 Tan EM,Cohen AS,Fries JF,et al.The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum, 1982,25:1271- 1273.
3 Mohan C,Shi Y,Laman JD,et al.Interaction between CD40 and its ligand gp39 in the development of murine lupus nephritis.J Immunol,1995,154:1470- 1475.
, http://www.100md.com
4 Vassilopoulos D,Kovacs B, GC Tsokos.TCR/CD3 complex-mediated signal transduction pathway in T cell lines from patients with SLE .J Immunol, 1995,155:2269- 2275.
5 Mary K,Douglas B,Mary KC. Increased expression of CD40L on systemic lupus erythematosus lymphocyte. J Clin Invest,1996,98:826- 829.
收稿：1998-08-26修回：1999-01-04, http://www.100md.com