天疱疮抗体结合靶抗原的定位研究
作者：杨春俊 张学军 杨森 王培光 王再兴 刘江波
单位：230022合肥，安徽医科大学第一附属医院皮肤科
关键词：天疱疮自身抗体抗原
中华皮肤科杂志/990606
【摘要】目的 研究天疱疮抗体结合表皮细胞间抗原在超微结构水平的部位。方法 采用LRWhite树脂为包埋剂，用金标记包埋后直接和间接免疫电镜技术，观察天疱疮患者皮损中IgG的沉积部位和患者血清中IgG型自身抗体结合正常人皮肤的部位。结果 寻常型天疱疮和落叶型天疱疮的直接和间接免疫电镜均在表皮细胞间的桥粒部位见金颗粒沉积，在非桥粒部位的角质形成细胞间未见金颗粒沉积。结论 寻常型天疱疮和落叶型天疱疮的靶抗原均是桥粒成分，均位于桥粒复合体上。
The Location of Binding Sites of Pemphigus
, 百拇医药
Antibodies with Target Antigens
YANG Chunjun, ZHANG Xuejun, YANG Sen, et al.
Department of Dermatology, First Hospital of Anhui
Medical University, Hefei 230022
【 Abstract】 Objective To explore the location of binding sites of autoantibodies in patients with pemphigus. Methods The direct and indirect immunogold labeling electron microscopic techniques were used to detect the ultrastructural location of the immunoglobulin G in the skin lesions of five patients(pemphigus vulgaris 4, pemphigus foliaceus 1), and location of binding sites of the circulating autoantibodies with normal human skin in the sera of eight patients(pemphigus vulgaris 6,pemphigus foliaceus 2), using LR White resin as embedding reagent. Results Binding of gold labeling anti human IgG was observed predominantly on desmosomal complex, but not on non desmosomal cell surface of keratinocytes.Conclusion The target antigens of pemphigus vulgaris and pemphigus foliaceus are components of desmosome, and these antigens are located on the desmosomal complex.
, http://www.100md.com
【 Key words】 Pemphigus Autoantibodies Antigens
天疱疮是一种累及全身皮肤粘膜的自身免疫性水疱性疾病，研究发现寻常型天疱疮(PV)自身抗体的靶抗原是桥粒核心糖蛋白3(dsg3)，落叶型天疱疮(PF)自身抗体的靶抗原是桥粒核心糖蛋白1(dsg1)，它们是桥粒的主要成分，均位于桥粒复合体上[1-3]。PF的靶抗原定位于桥粒上，但有关PV靶抗原的定位研究结果存在着分歧，有认为其靶抗原位于桥粒上，也有认为其靶抗原广泛地存在于角质形成细胞膜上。我们利用LRWhite树脂作为包埋剂，胶体金作为标记物，对天疱疮患者皮损和血清分别进行直接和间接免疫电镜(IEM)研究。
材料和方法
一、临床资料
5份天疱疮患者皮损(PV4例，PF1例)、8份天疱疮血清(PV6例，PF2例)取自经临床、病理和免疫病理确诊的活动期天疱疮患者，置-30℃冰箱中保存备用。8份血清均经间接免疫荧光证实存在循环抗棘细胞间抗体IgG[4]。用于间接免疫电镜的皮肤标本取自正常人皮肤。LRWhite树脂购于美国EMS公司，金标记羊抗人IgG(直径为10nm)购于武汉博士德公司(美国Sigma公司产品)。
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二、方法
取新鲜天疱疮皮损周围外观正常皮肤或正常人皮肤，置预冷的玻璃板上，切成1mm×1mm×2mm大小，用2%的多聚甲醛(常温下60min)和4%甘氨酸(常温下40min)固定后，PBS清洗2次×15min，后置PBS液中4℃过夜；用滤纸吸干后乙醇逐级脱水；LRWhite树脂和95%乙醇(2∶1)常温下浸透1h；LRWhite树脂再次浸透1h；换新鲜LRWhite树脂4℃冰箱中过夜，标本放包埋管中用LRWhite树脂包埋后置40℃温箱中聚合20～24h；常规超薄切片捞于100目有支持膜的镍网上待作免疫染色。
直接免疫电镜：皮损组织超薄切片，1%BSA室温下作用30min，加金标记羊抗人IgG(1∶40)室温下60min，0.1mol/LPBS洗3次×10min，铀染20min，铅染2min；JEM-100XS电镜下观片。
间接免疫电镜：正常人皮肤组织超薄切片，1%BSA室温下作用30min，PV或PF患者血清(1∶40稀释)4℃冰箱中过夜；PBS清洗10min×3次；金标记羊抗人IgG(1∶40)37℃孵育30min，重蒸水清洗10min×3次，铀染30min，铅染2min；电镜下观片。直接免疫电镜的对照以正常人皮肤为底物，间接免疫电镜以正常人血清为对照，免疫染色和电子染色分别同上。
, 百拇医药
结果
1.皮损及正常人皮肤组织标本电镜下见结构保存较好，组织层次清楚。细胞内的细胞器如细胞核、线粒体清晰可见，胞膜保存完好，特别是桥粒结构清晰。
2.直接免疫电镜见5例天疱疮皮损组织的角质形成细胞间桥粒部位有金颗粒沉积，在非桥粒部位的角质形成细胞间未见金颗粒沉积，提示皮损组织中免疫复合物沉积在桥粒复合体上。在细胞质内及皮肤基底膜带偶见金颗粒沉积，但无特异性。比较PV和PF的直接免疫电镜结果显示金颗粒沉积部位无差别。
3.以正常人皮肤为底物，对6例PV和2例PF血清中的自身抗体IgG进行金标记包埋后间接免疫电镜(IEM)检测，结果6例PV和2例PF均见金颗粒沉积在桥粒上及其细胞膜附近的桥粒斑上。比较PV和PF的金颗粒沉积部位，无明显区别(见图1、2)。而非桥粒部位的表皮细胞间未见金颗粒沉积，在表皮的其他部位偶见金颗粒沉积，但无特异性。在基底膜带上也未见特异性金颗粒沉积。结果提示PV和PF血清中IgG型自身抗体均结合在正常人皮肤角质形成细胞间的桥粒部位。
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图1 间接免疫电镜测寻常型天疱疮血清见金颗粒沉
积在桥粒复合体上,在非桥部位的角质形成细胞间未见特异性金颗粒沉积(×50000)
图2 间接免疫电镜检测落叶型天疱疮血清见金颗粒沉积在
桥粒复合体上,在非桥粒部位的角质形成细胞间未见特导师性金颗沉积(×800000)
讨论
以往多采用过氧化物酶标记包埋前IEM对PV和PF的靶抗原进行定位研究，结果通常显示酶标记抗体结合于角质形成细胞间，沿角质形成细胞膜弥散性分布。Bedance[5]等报道对14例PV的循环抗体IgG结合正常人皮肤的位置进行包埋前辣根过氧化物酶标记间接IEM研究，发现循环抗体IgG不仅结合在角质形成细胞的桥粒部位，在其中的4例患者中见非桥粒部位的细胞间也有循环抗体的结合。
, 百拇医药
我们采用包埋后金标记直接IEM技术对4例PV和1例PF皮损组织中IgG的沉积部位进行研究，结果发现4例PV和1例PF皮损组织中的免疫复合物的沉积部位均位于桥粒部位。对6例PV和2例PF的间接免疫电镜研究结果发现金颗粒也均沉积在桥粒部位，位于桥粒间及桥粒斑上。提示PV和PF患者血清中自身抗体所识别正常人皮肤的抗原部位均位于桥粒复合体上。由于金标记包埋后IEM技术既克服了辣根过氧化物酶作用底物较弥散而遮盖组织的超微结构的弊端，又克服了包埋前IEM技术的标记抗体难以达到细胞内的缺点，因此认为PV和PF的靶抗原均位于桥粒斑上，在非桥粒部位的角质形成细胞间并不存在PV和PF的靶抗原。最近Zhou[6]等采用LRWhite树脂包埋剂对4例PV和1例PF进行金标记包埋后间接IEM研究，结果提示金颗粒沉积在桥粒部位。由于对PV循环抗体的靶抗原的研究方法有所不同，导致结果有所差别，我们的研究结果提示PF和PV的靶抗原在角质形成细胞间的部位相同，均位于桥粒复合体上。
安徽省自然科学基金资助课题(97424005)
, 百拇医药
参考文献
1 Stanley JR, Koulu L, Thiovolet C， et al. Distinction between epidermal antigens binding pemphigus vulgaris and pemphigus foliaceus autoantibodies. J Clin Invest, 1984， 74:313- 320.
2 Korman NJ, Eyre RW, Klaus Kovtum V,et al. Demonstration of an adhering junction molecule in the autoantigens of pemphigus vulgaris and pemphigus foliaceus. N Engl J Med, 1989,321:631- 635.
3 Amagai M, Klaus Kovtum V, Stanley JR， et al. Autoantibodies against a novel epithelial cadherin in pemphigus vulgaris, a disease of cell adhesion. Cell, 1991,67:869- 877.
, 百拇医药
4 杨春俊，张学军，杨森,等.牛舌为底物间接免疫荧光检测天疱疮抗体的研究.临床皮肤科杂志，1999，28:8-9.
5 Bedance C, Prost C, Thomine E, et al. Binding of autoantibodies is not restricted to desmosomes in pemphigus vulgaris: comparison of 14 cases of pemphigus vulgaris and 10 cases of pemphigus foliaceus studied by Western immunoblot and immunoelectron microscopy. Arch Dermatol Res, 1996,288:343-352.
6 Zhou S, Ferguson DJP, Allen J, et al. The location of binding sites of pemphigus vulgaris and pemphigus foliaceus autoantibodies: a postembedding immunoelectron microscopic study. Br J Dermatol, 1997,136:878-883.
(收稿：1999-02-25修回：1999-05-31), http://www.100md.com
单位：230022合肥，安徽医科大学第一附属医院皮肤科
关键词：天疱疮自身抗体抗原
中华皮肤科杂志/990606
【摘要】目的 研究天疱疮抗体结合表皮细胞间抗原在超微结构水平的部位。方法 采用LRWhite树脂为包埋剂，用金标记包埋后直接和间接免疫电镜技术，观察天疱疮患者皮损中IgG的沉积部位和患者血清中IgG型自身抗体结合正常人皮肤的部位。结果 寻常型天疱疮和落叶型天疱疮的直接和间接免疫电镜均在表皮细胞间的桥粒部位见金颗粒沉积，在非桥粒部位的角质形成细胞间未见金颗粒沉积。结论 寻常型天疱疮和落叶型天疱疮的靶抗原均是桥粒成分，均位于桥粒复合体上。
The Location of Binding Sites of Pemphigus
, 百拇医药
Antibodies with Target Antigens
YANG Chunjun, ZHANG Xuejun, YANG Sen, et al.
Department of Dermatology, First Hospital of Anhui
Medical University, Hefei 230022
【 Abstract】 Objective To explore the location of binding sites of autoantibodies in patients with pemphigus. Methods The direct and indirect immunogold labeling electron microscopic techniques were used to detect the ultrastructural location of the immunoglobulin G in the skin lesions of five patients(pemphigus vulgaris 4, pemphigus foliaceus 1), and location of binding sites of the circulating autoantibodies with normal human skin in the sera of eight patients(pemphigus vulgaris 6,pemphigus foliaceus 2), using LR White resin as embedding reagent. Results Binding of gold labeling anti human IgG was observed predominantly on desmosomal complex, but not on non desmosomal cell surface of keratinocytes.Conclusion The target antigens of pemphigus vulgaris and pemphigus foliaceus are components of desmosome, and these antigens are located on the desmosomal complex.
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【 Key words】 Pemphigus Autoantibodies Antigens
天疱疮是一种累及全身皮肤粘膜的自身免疫性水疱性疾病，研究发现寻常型天疱疮(PV)自身抗体的靶抗原是桥粒核心糖蛋白3(dsg3)，落叶型天疱疮(PF)自身抗体的靶抗原是桥粒核心糖蛋白1(dsg1)，它们是桥粒的主要成分，均位于桥粒复合体上[1-3]。PF的靶抗原定位于桥粒上，但有关PV靶抗原的定位研究结果存在着分歧，有认为其靶抗原位于桥粒上，也有认为其靶抗原广泛地存在于角质形成细胞膜上。我们利用LRWhite树脂作为包埋剂，胶体金作为标记物，对天疱疮患者皮损和血清分别进行直接和间接免疫电镜(IEM)研究。
材料和方法
一、临床资料
5份天疱疮患者皮损(PV4例，PF1例)、8份天疱疮血清(PV6例，PF2例)取自经临床、病理和免疫病理确诊的活动期天疱疮患者，置-30℃冰箱中保存备用。8份血清均经间接免疫荧光证实存在循环抗棘细胞间抗体IgG[4]。用于间接免疫电镜的皮肤标本取自正常人皮肤。LRWhite树脂购于美国EMS公司，金标记羊抗人IgG(直径为10nm)购于武汉博士德公司(美国Sigma公司产品)。
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二、方法
取新鲜天疱疮皮损周围外观正常皮肤或正常人皮肤，置预冷的玻璃板上，切成1mm×1mm×2mm大小，用2%的多聚甲醛(常温下60min)和4%甘氨酸(常温下40min)固定后，PBS清洗2次×15min，后置PBS液中4℃过夜；用滤纸吸干后乙醇逐级脱水；LRWhite树脂和95%乙醇(2∶1)常温下浸透1h；LRWhite树脂再次浸透1h；换新鲜LRWhite树脂4℃冰箱中过夜，标本放包埋管中用LRWhite树脂包埋后置40℃温箱中聚合20～24h；常规超薄切片捞于100目有支持膜的镍网上待作免疫染色。
直接免疫电镜：皮损组织超薄切片，1%BSA室温下作用30min，加金标记羊抗人IgG(1∶40)室温下60min，0.1mol/LPBS洗3次×10min，铀染20min，铅染2min；JEM-100XS电镜下观片。
间接免疫电镜：正常人皮肤组织超薄切片，1%BSA室温下作用30min，PV或PF患者血清(1∶40稀释)4℃冰箱中过夜；PBS清洗10min×3次；金标记羊抗人IgG(1∶40)37℃孵育30min，重蒸水清洗10min×3次，铀染30min，铅染2min；电镜下观片。直接免疫电镜的对照以正常人皮肤为底物，间接免疫电镜以正常人血清为对照，免疫染色和电子染色分别同上。
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结果
1.皮损及正常人皮肤组织标本电镜下见结构保存较好，组织层次清楚。细胞内的细胞器如细胞核、线粒体清晰可见，胞膜保存完好，特别是桥粒结构清晰。
2.直接免疫电镜见5例天疱疮皮损组织的角质形成细胞间桥粒部位有金颗粒沉积，在非桥粒部位的角质形成细胞间未见金颗粒沉积，提示皮损组织中免疫复合物沉积在桥粒复合体上。在细胞质内及皮肤基底膜带偶见金颗粒沉积，但无特异性。比较PV和PF的直接免疫电镜结果显示金颗粒沉积部位无差别。
3.以正常人皮肤为底物，对6例PV和2例PF血清中的自身抗体IgG进行金标记包埋后间接免疫电镜(IEM)检测，结果6例PV和2例PF均见金颗粒沉积在桥粒上及其细胞膜附近的桥粒斑上。比较PV和PF的金颗粒沉积部位，无明显区别(见图1、2)。而非桥粒部位的表皮细胞间未见金颗粒沉积，在表皮的其他部位偶见金颗粒沉积，但无特异性。在基底膜带上也未见特异性金颗粒沉积。结果提示PV和PF血清中IgG型自身抗体均结合在正常人皮肤角质形成细胞间的桥粒部位。
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图1 间接免疫电镜测寻常型天疱疮血清见金颗粒沉
积在桥粒复合体上,在非桥部位的角质形成细胞间未见特异性金颗粒沉积(×50000)
图2 间接免疫电镜检测落叶型天疱疮血清见金颗粒沉积在
桥粒复合体上,在非桥粒部位的角质形成细胞间未见特导师性金颗沉积(×800000)
讨论
以往多采用过氧化物酶标记包埋前IEM对PV和PF的靶抗原进行定位研究，结果通常显示酶标记抗体结合于角质形成细胞间，沿角质形成细胞膜弥散性分布。Bedance[5]等报道对14例PV的循环抗体IgG结合正常人皮肤的位置进行包埋前辣根过氧化物酶标记间接IEM研究，发现循环抗体IgG不仅结合在角质形成细胞的桥粒部位，在其中的4例患者中见非桥粒部位的细胞间也有循环抗体的结合。
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我们采用包埋后金标记直接IEM技术对4例PV和1例PF皮损组织中IgG的沉积部位进行研究，结果发现4例PV和1例PF皮损组织中的免疫复合物的沉积部位均位于桥粒部位。对6例PV和2例PF的间接免疫电镜研究结果发现金颗粒也均沉积在桥粒部位，位于桥粒间及桥粒斑上。提示PV和PF患者血清中自身抗体所识别正常人皮肤的抗原部位均位于桥粒复合体上。由于金标记包埋后IEM技术既克服了辣根过氧化物酶作用底物较弥散而遮盖组织的超微结构的弊端，又克服了包埋前IEM技术的标记抗体难以达到细胞内的缺点，因此认为PV和PF的靶抗原均位于桥粒斑上，在非桥粒部位的角质形成细胞间并不存在PV和PF的靶抗原。最近Zhou[6]等采用LRWhite树脂包埋剂对4例PV和1例PF进行金标记包埋后间接IEM研究，结果提示金颗粒沉积在桥粒部位。由于对PV循环抗体的靶抗原的研究方法有所不同，导致结果有所差别，我们的研究结果提示PF和PV的靶抗原在角质形成细胞间的部位相同，均位于桥粒复合体上。
安徽省自然科学基金资助课题(97424005)
, 百拇医药
参考文献
1 Stanley JR, Koulu L, Thiovolet C， et al. Distinction between epidermal antigens binding pemphigus vulgaris and pemphigus foliaceus autoantibodies. J Clin Invest, 1984， 74:313- 320.
2 Korman NJ, Eyre RW, Klaus Kovtum V,et al. Demonstration of an adhering junction molecule in the autoantigens of pemphigus vulgaris and pemphigus foliaceus. N Engl J Med, 1989,321:631- 635.
3 Amagai M, Klaus Kovtum V, Stanley JR， et al. Autoantibodies against a novel epithelial cadherin in pemphigus vulgaris, a disease of cell adhesion. Cell, 1991,67:869- 877.
, 百拇医药
4 杨春俊，张学军，杨森,等.牛舌为底物间接免疫荧光检测天疱疮抗体的研究.临床皮肤科杂志，1999，28:8-9.
5 Bedance C, Prost C, Thomine E, et al. Binding of autoantibodies is not restricted to desmosomes in pemphigus vulgaris: comparison of 14 cases of pemphigus vulgaris and 10 cases of pemphigus foliaceus studied by Western immunoblot and immunoelectron microscopy. Arch Dermatol Res, 1996,288:343-352.
6 Zhou S, Ferguson DJP, Allen J, et al. The location of binding sites of pemphigus vulgaris and pemphigus foliaceus autoantibodies: a postembedding immunoelectron microscopic study. Br J Dermatol, 1997,136:878-883.
(收稿：1999-02-25修回：1999-05-31), http://www.100md.com