两个家系单纯型大疱性表皮松解症Weber-Cockayne亚型的基因突变
作者：董慧婷 李冠群 陈喜雪 杨勇 王玮蓁 朱学骏
单位：李冠群 朱学骏 陈喜雪 杨勇 100034北京医科大学第一医院皮肤科；董慧婷 CMB项目资助研修生，现在河南医科大学第一附属医院皮肤科，郑州450052；王玮蓁 湖北省武汉市第一医院皮肤科
关键词：表皮松解；大疱性；单纯性角蛋白突变
中华皮肤科杂志/990601
【摘要】目的鉴定更多的单纯型大疱性表皮松解症(EBS)突变以研究EBS基因型和表型关系，为EBS的遗传咨询及基因诊断和基因治疗奠定基础。方法 应用聚合酶链反应、单链构象多态性和DNA直接测序明确基因突变位点和突变方式。结果 家系Ⅰ角蛋白K14L12区存在V268D错义突变，家系Ⅱ角蛋白K5L12区存在N329S错义突变。结论 进一步证明K5/K14的L12区是许多EBS-Weber-Cockayne突变定位的区域，K5/K14的L12区的多个位点的突变均可以引起EBS-Weber-Cockayne的发生。同时进一步证实了K5/K14的L12区对角蛋白装配不如其螺旋起始肽或螺旋终末肽重要，因而发生于K5/K14的L12区的突变仅能引起较轻的EBS-Weber-Cockayne亚型。
, 百拇医药
Analysis of K5/K14 L12 Domain Gene Mutations
of Two Epidermolysis Bullosa Simplex
Weber-Cockayne Subtype Families
DONG Huiting, LI Guanqun, CHEN Xixue,et al.
Department of Dermatology, First Hospital of Bejing
Medical University, Beijing 100034
【 Abstract】 Objective To identify additional epidermolysis bullosa simplex(EBS) mutations for studying the correlation between genotype and phenotype of EBS, and to provide basis for genetic counselling, as well as for gene diagnosis and gene therapy..Methods PCR, SSCP, direct DNA sequencing were employed to determine the mutation sites and mutation fashions. Results A V268D missense mutation within K14 L12 domain was determined in family one, and a N329S missense mutation within K5 L12 domain was found in family two. Conclusion The results verify further that K5/K14 L12 domain is a preferred region within which many EBS-WC mutations are located, and mutations in several different residues of K5/K14 L12 domain could lead to EBS-WC. The results also demonstrate that K5/K14 L12 domain is not as important as K5/K14 HIP (helix initiation peptide)or HTP(helix termination peptide) for keratin intermediate filament assembly, so the mutations within L12 domain only lead to the milder EBS-WC subtype.
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【 Key words】 Epidermolysis bullosa simplex Keratin Mutation
单纯型大疱性表皮松解症( epidermolysis bullosa simplex, EBS)主要分为WeberCockayne(EBS-WC)、Koebner(EBS-K)和DowlingMeara(EBS-DM)3种亚型，近年来国外的研究表明它们的发病是由角蛋白K5/K14基因突变所致[1]，K5/L14的L12区是EBS-WC亚型的基因突变热区。为了探索我国EBS患者是否存在同样的基因突变以及基因突变与表型的相关性，为EBS遗传咨询和设计EBS的基因诊断及基因治疗方法提供依据，我们应用PCR扩增基因突变好发区域、SSCP初筛基因突变以及DNA直接测序明确突变位点和突变方式，对两个EBS-WC家系的K5和K14的L12区进行了基因突变分析。
材料和方法
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(一)临床资料：两个家系分别为河南新乡(家系Ⅰ)和湖北黄梅(家系Ⅱ)来我科就诊的门诊患者，先证者在出生后不久即主要在手足部位发生大疱性皮肤损害，轻微外伤或摩擦后及夏季加重。家系Ⅰ5代共13例患者，家系Ⅱ3代有7例患者，两家系每一代均有患者，男女患者之比约为1∶1，为典型的常染色体显性遗传(详见家系谱)。患者的组织病理显示表皮基底细胞空泡变性，表皮真皮间水疱形成和真皮浅层少量炎症细胞浸润。透射电镜显示表皮基底细胞胞质和核周空泡变性，基底细胞核下裂隙形成。结合临床、组织病理和电镜，这2个家系均确诊为EBS-WC亚型。
家系Ⅰ
家系Ⅱ
(二)外周血基因组DNA提取：取每个家系数个患者和正常人静脉血各10mL，2%EDTA抗凝，然后常规低渗溶血法提取基因组DNA。
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(三)聚合酶链反应(PCR)：应用2对引物对2个家系的患者和正常人的角蛋白K5第4外显子和K14第5外显子(分别编码K5L12区和K14L12区，预计PCR产物分别为156bp和162bp)进行扩增。K5第4外显子引物序列为：上游5′-GAGCTGTCCCAGATGCAGAC-3′，下游5′-ATACCAGGACTCGGCTTCTGT-3′；K14第5外显子引物序列为：上游5′-GAGATGAATGC
CCTGAGAGG-3′，下游5′-CTTGGTGAACCATTCCTC-3′。PCR反应体系均为25μL。扩增K5第4外显子，反应条件94℃1min，55℃1min，72℃1min，共35个循环。扩增K14第5外显子，反应条件为94℃1min，57℃1min，72℃1min，共35个循环。PCR扩增产物用3%琼脂糖凝胶电泳分析。
(四)单链构象多态性(SSCP)：取PCR扩增产物1～5μL，超纯水调整，使其体积相同，浓度相近。碱变性液变性，加变性加样缓冲液，混匀，45～50℃变性20min后加样，于4℃、200V的条件下经15%聚丙烯凝胶电泳8h左右，硝酸银染色观察结果。DNA片段标准物采用pBR322DNA/HaeⅢ。
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(五)DNA测序：SSCP分析有异常单链条带患者的PCR扩增产物及相应家系正常人同一基因的PCR产物用ABI373型DNA全自动测序仪测序。
结果
(一)PCR扩增：K5第4外显子引物扩增家系Ⅰ和家系Ⅱ的患者和正常人的基因组DNA，均扩出一条156bp的DNA片段，它是K5第4外显子的一部分，编码K5的L12区。K14第5外显子引物扩增家系Ⅰ和家系Ⅱ的患者和正常人的基因组DNA，均扩出一条162bp的DNA片段，它是K14的第5外显子的完整序列，编码K14的L12区。
(二)SSCP分析：家系Ⅰ的K14PCR产物和家系Ⅱ的K5PCR产物SSCP结果显示患者标本存在异常的单链条带(图1、2)；家系Ⅰ的K5PCR产物和家系Ⅱ的K14PCR产物反复经SSCP分析，未发现患者标本有与家系中正常人不同的单链条带。
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M:标准分子量(pbr322/HaeⅢ),～4:家系1中的4例患者,5～8:家系1中的4例正常人,*:异常单链条带
图1 家系1k14PGR 产物SSCP分析
M:标准分子量(pbr322/HaeⅢ),1～5：家系2中的5例患者,家系2中的4例正常人,*:异常单链条带
图2 家系2k5PGR 产物SSCP分析
(三)PCR产物DNA直接测序：家系Ⅰ患者K14的第268位密码子出现GTC→GAC的错义突变，导致K14L12区第268位正常的缬氨酸(V)被天冬氨酸(D)代替。家系Ⅱ患者K5的第329位密码子由AAC突变为AGC，导致K5L12区发生N329S错义突变。
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讨论
本研究对2个EBS-WC家系K5/K14L12区进行基因突变的分析发现家系Ⅰ的患者K14发生了V268D突变，家系Ⅱ患者K5发生了N329S突变。根据突变仅在家系的患者基因中检出，而家系中的正常人不存在此突变。而且测出的突变位点位于EBS-WC的突变好发区——K5/K14L12区。曾有EBS-WC家系发生于K5L12区的N329K、D328V、R331C和发生于K14的L12区的V270M、A274D突变的报道[1]，这些引起EBS-WC亚型的突变与本研究检测出的突变位点相同或相近，突变方式都是错义突变。影响角蛋白丝的装配，破坏表皮角蛋白丝网络的完整性，从而导致EBS-WC发生。说明检测出的突变是这两个家系发病的分子遗传学基础而不是该位点的多态性。
根据文献报道的EBS基因突变研究，发现EBS的基因型和表型间具有良好的相关性：临床表现最重的EBSDM的基因突变都发生在K5/K14高度保守的HIP(helix initiation peptide)或HTP(helix termination peptide)区域；病情最轻的EBSWC基因突变多发生在H1和L12区；而病情中等严重的EBS-K和EBS-MP的基因突变除少数发生在HIP、HTP、H1、V1和L12区外，多数位于HIP和HTP以外比较保守的中央α-螺旋杆区[1]。EBS基因型与表型的相关性与角蛋白基因不同位点对角蛋白中间丝装配和功能的影响不同有关。发生在角蛋白基因HIP或HTP区域内的轻微改变即可严重影响角蛋白丝的装配，破坏表皮细胞内角蛋白网络的完整性，从而引起最严重的EBS-DM亚型。HIP和HTP以外的中央α-螺旋杆区和连接区则对角蛋白中间丝装配的影响较小；这些区域发生的基因突变则引起病情较轻的EBS-K、EBS-WC或EBS-MP亚型[2]。吴安等[3，4]报道的两个分别发生M327I和T346S突变的EBS-WC家系与本文报道的两个分别发生V268D和N329S突变的EBS-WC家系的基因突变均位于K5/K14L12区，进一步证明了K5/K14L12区是EBS-WC的突变热区；同时也进一步支持了角蛋白L12区对角蛋白中间丝的装配和功能作用不如其HIP或HTP重要的观点。
, 百拇医药
中华医学会(CMB)项目基金资助
参考文献
1 Corder LD, McLean WH. Human keratin diseases: hereditary fragility of specific epithelial tissues. Exp Dermatol, 1996,5:297- 307.
2 Albers KM.Keratin biochemistry. Clin Dermatol, 1996,14:309- 320.
3吴安，李冠群，朱学骏.手足复发型大疱性表皮松解症角蛋白5基因突变位点的检测.中华皮肤科杂志，1997，30：221-223.
4李冠群，吴安，朱学骏.PCRDNA直接测序检测1例单纯型大疱性表皮松解症Weber-Cockayne亚型(WC-EBS)患者角蛋白K5基因点突变.临床皮肤科杂志，1997，26：219-221.
(收稿：1998-10-23修回：1999-03-22), http://www.100md.com
单位：李冠群 朱学骏 陈喜雪 杨勇 100034北京医科大学第一医院皮肤科；董慧婷 CMB项目资助研修生，现在河南医科大学第一附属医院皮肤科，郑州450052；王玮蓁 湖北省武汉市第一医院皮肤科
关键词：表皮松解；大疱性；单纯性角蛋白突变
中华皮肤科杂志/990601
【摘要】目的鉴定更多的单纯型大疱性表皮松解症(EBS)突变以研究EBS基因型和表型关系，为EBS的遗传咨询及基因诊断和基因治疗奠定基础。方法 应用聚合酶链反应、单链构象多态性和DNA直接测序明确基因突变位点和突变方式。结果 家系Ⅰ角蛋白K14L12区存在V268D错义突变，家系Ⅱ角蛋白K5L12区存在N329S错义突变。结论 进一步证明K5/K14的L12区是许多EBS-Weber-Cockayne突变定位的区域，K5/K14的L12区的多个位点的突变均可以引起EBS-Weber-Cockayne的发生。同时进一步证实了K5/K14的L12区对角蛋白装配不如其螺旋起始肽或螺旋终末肽重要，因而发生于K5/K14的L12区的突变仅能引起较轻的EBS-Weber-Cockayne亚型。
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Analysis of K5/K14 L12 Domain Gene Mutations
of Two Epidermolysis Bullosa Simplex
Weber-Cockayne Subtype Families
DONG Huiting, LI Guanqun, CHEN Xixue,et al.
Department of Dermatology, First Hospital of Bejing
Medical University, Beijing 100034
【 Abstract】 Objective To identify additional epidermolysis bullosa simplex(EBS) mutations for studying the correlation between genotype and phenotype of EBS, and to provide basis for genetic counselling, as well as for gene diagnosis and gene therapy..Methods PCR, SSCP, direct DNA sequencing were employed to determine the mutation sites and mutation fashions. Results A V268D missense mutation within K14 L12 domain was determined in family one, and a N329S missense mutation within K5 L12 domain was found in family two. Conclusion The results verify further that K5/K14 L12 domain is a preferred region within which many EBS-WC mutations are located, and mutations in several different residues of K5/K14 L12 domain could lead to EBS-WC. The results also demonstrate that K5/K14 L12 domain is not as important as K5/K14 HIP (helix initiation peptide)or HTP(helix termination peptide) for keratin intermediate filament assembly, so the mutations within L12 domain only lead to the milder EBS-WC subtype.
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【 Key words】 Epidermolysis bullosa simplex Keratin Mutation
单纯型大疱性表皮松解症( epidermolysis bullosa simplex, EBS)主要分为WeberCockayne(EBS-WC)、Koebner(EBS-K)和DowlingMeara(EBS-DM)3种亚型，近年来国外的研究表明它们的发病是由角蛋白K5/K14基因突变所致[1]，K5/L14的L12区是EBS-WC亚型的基因突变热区。为了探索我国EBS患者是否存在同样的基因突变以及基因突变与表型的相关性，为EBS遗传咨询和设计EBS的基因诊断及基因治疗方法提供依据，我们应用PCR扩增基因突变好发区域、SSCP初筛基因突变以及DNA直接测序明确突变位点和突变方式，对两个EBS-WC家系的K5和K14的L12区进行了基因突变分析。
材料和方法
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(一)临床资料：两个家系分别为河南新乡(家系Ⅰ)和湖北黄梅(家系Ⅱ)来我科就诊的门诊患者，先证者在出生后不久即主要在手足部位发生大疱性皮肤损害，轻微外伤或摩擦后及夏季加重。家系Ⅰ5代共13例患者，家系Ⅱ3代有7例患者，两家系每一代均有患者，男女患者之比约为1∶1，为典型的常染色体显性遗传(详见家系谱)。患者的组织病理显示表皮基底细胞空泡变性，表皮真皮间水疱形成和真皮浅层少量炎症细胞浸润。透射电镜显示表皮基底细胞胞质和核周空泡变性，基底细胞核下裂隙形成。结合临床、组织病理和电镜，这2个家系均确诊为EBS-WC亚型。
家系Ⅰ
家系Ⅱ
(二)外周血基因组DNA提取：取每个家系数个患者和正常人静脉血各10mL，2%EDTA抗凝，然后常规低渗溶血法提取基因组DNA。
, 百拇医药
(三)聚合酶链反应(PCR)：应用2对引物对2个家系的患者和正常人的角蛋白K5第4外显子和K14第5外显子(分别编码K5L12区和K14L12区，预计PCR产物分别为156bp和162bp)进行扩增。K5第4外显子引物序列为：上游5′-GAGCTGTCCCAGATGCAGAC-3′，下游5′-ATACCAGGACTCGGCTTCTGT-3′；K14第5外显子引物序列为：上游5′-GAGATGAATGC
CCTGAGAGG-3′，下游5′-CTTGGTGAACCATTCCTC-3′。PCR反应体系均为25μL。扩增K5第4外显子，反应条件94℃1min，55℃1min，72℃1min，共35个循环。扩增K14第5外显子，反应条件为94℃1min，57℃1min，72℃1min，共35个循环。PCR扩增产物用3%琼脂糖凝胶电泳分析。
(四)单链构象多态性(SSCP)：取PCR扩增产物1～5μL，超纯水调整，使其体积相同，浓度相近。碱变性液变性，加变性加样缓冲液，混匀，45～50℃变性20min后加样，于4℃、200V的条件下经15%聚丙烯凝胶电泳8h左右，硝酸银染色观察结果。DNA片段标准物采用pBR322DNA/HaeⅢ。
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(五)DNA测序：SSCP分析有异常单链条带患者的PCR扩增产物及相应家系正常人同一基因的PCR产物用ABI373型DNA全自动测序仪测序。
结果
(一)PCR扩增：K5第4外显子引物扩增家系Ⅰ和家系Ⅱ的患者和正常人的基因组DNA，均扩出一条156bp的DNA片段，它是K5第4外显子的一部分，编码K5的L12区。K14第5外显子引物扩增家系Ⅰ和家系Ⅱ的患者和正常人的基因组DNA，均扩出一条162bp的DNA片段，它是K14的第5外显子的完整序列，编码K14的L12区。
(二)SSCP分析：家系Ⅰ的K14PCR产物和家系Ⅱ的K5PCR产物SSCP结果显示患者标本存在异常的单链条带(图1、2)；家系Ⅰ的K5PCR产物和家系Ⅱ的K14PCR产物反复经SSCP分析，未发现患者标本有与家系中正常人不同的单链条带。
, 百拇医药
M:标准分子量(pbr322/HaeⅢ),～4:家系1中的4例患者,5～8:家系1中的4例正常人,*:异常单链条带
图1 家系1k14PGR 产物SSCP分析
M:标准分子量(pbr322/HaeⅢ),1～5：家系2中的5例患者,家系2中的4例正常人,*:异常单链条带
图2 家系2k5PGR 产物SSCP分析
(三)PCR产物DNA直接测序：家系Ⅰ患者K14的第268位密码子出现GTC→GAC的错义突变，导致K14L12区第268位正常的缬氨酸(V)被天冬氨酸(D)代替。家系Ⅱ患者K5的第329位密码子由AAC突变为AGC，导致K5L12区发生N329S错义突变。
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讨论
本研究对2个EBS-WC家系K5/K14L12区进行基因突变的分析发现家系Ⅰ的患者K14发生了V268D突变，家系Ⅱ患者K5发生了N329S突变。根据突变仅在家系的患者基因中检出，而家系中的正常人不存在此突变。而且测出的突变位点位于EBS-WC的突变好发区——K5/K14L12区。曾有EBS-WC家系发生于K5L12区的N329K、D328V、R331C和发生于K14的L12区的V270M、A274D突变的报道[1]，这些引起EBS-WC亚型的突变与本研究检测出的突变位点相同或相近，突变方式都是错义突变。影响角蛋白丝的装配，破坏表皮角蛋白丝网络的完整性，从而导致EBS-WC发生。说明检测出的突变是这两个家系发病的分子遗传学基础而不是该位点的多态性。
根据文献报道的EBS基因突变研究，发现EBS的基因型和表型间具有良好的相关性：临床表现最重的EBSDM的基因突变都发生在K5/K14高度保守的HIP(helix initiation peptide)或HTP(helix termination peptide)区域；病情最轻的EBSWC基因突变多发生在H1和L12区；而病情中等严重的EBS-K和EBS-MP的基因突变除少数发生在HIP、HTP、H1、V1和L12区外，多数位于HIP和HTP以外比较保守的中央α-螺旋杆区[1]。EBS基因型与表型的相关性与角蛋白基因不同位点对角蛋白中间丝装配和功能的影响不同有关。发生在角蛋白基因HIP或HTP区域内的轻微改变即可严重影响角蛋白丝的装配，破坏表皮细胞内角蛋白网络的完整性，从而引起最严重的EBS-DM亚型。HIP和HTP以外的中央α-螺旋杆区和连接区则对角蛋白中间丝装配的影响较小；这些区域发生的基因突变则引起病情较轻的EBS-K、EBS-WC或EBS-MP亚型[2]。吴安等[3，4]报道的两个分别发生M327I和T346S突变的EBS-WC家系与本文报道的两个分别发生V268D和N329S突变的EBS-WC家系的基因突变均位于K5/K14L12区，进一步证明了K5/K14L12区是EBS-WC的突变热区；同时也进一步支持了角蛋白L12区对角蛋白中间丝的装配和功能作用不如其HIP或HTP重要的观点。
, 百拇医药
中华医学会(CMB)项目基金资助
参考文献
1 Corder LD, McLean WH. Human keratin diseases: hereditary fragility of specific epithelial tissues. Exp Dermatol, 1996,5:297- 307.
2 Albers KM.Keratin biochemistry. Clin Dermatol, 1996,14:309- 320.
3吴安，李冠群，朱学骏.手足复发型大疱性表皮松解症角蛋白5基因突变位点的检测.中华皮肤科杂志，1997，30：221-223.
4李冠群，吴安，朱学骏.PCRDNA直接测序检测1例单纯型大疱性表皮松解症Weber-Cockayne亚型(WC-EBS)患者角蛋白K5基因点突变.临床皮肤科杂志，1997，26：219-221.
(收稿：1998-10-23修回：1999-03-22), http://www.100md.com