生殖器疱疹患者病毒DNA的定量测定研究
作者：程培华
单位：541001广西省桂林医学院附属医院皮肤科
关键词：HSVDNA定量；聚合酶链反应；酶联免疫吸附法；DNA印迹
中华皮肤科杂志000310
【摘要】目的对生殖器疱疹病毒(HSV)患者病毒DNA进行定量测定。方法以标准的HSV质粒作为标准，用聚合酶链反应(PCR)和酶联免疫吸附法(ELISA)，定量测定HSVDNA。结果100例生殖器疱疹患者中93例HSV测定阳性，7例阴性。在93例阳性者中有58例为HSV-2(占62.4%)，35例为HSV-1(占37.6%)。93例阳性者定量测定结果，250μL标本混悬液中DNA质粒数为115～1.1×105个，平均7.1×104个；58例HSV-2阳性者，250μL标本悬液DNA质粒数为136～1.1×105个，平均7.6×104个；35例HSV-1阳性者DNA质粒数为115～9.4×104个，平均6.3×104个。分别随机取HSV-2和HSV-1阳性患者各8例已淬取和纯化的DNA混悬液10μL，定量测定结果显示：HSV-2患者最高为2.7×104个DNA质粒数，最低35个，平均1.8×104个。HSV-1最高2.5×104个，最低29个，平均1.6×104个。结论所用几种检测法中ELISA定量总阳性率为93%，与DNA印迹法阳性率相同。诊断PCR阳性率为91%,HSV分型PCR阳性率为88%。
, 百拇医药
Quantitation of Genital Herpesvirus DNA with Polymerase Chain Reaction and ELISA
CHENG Peihua
(Department of Dermatology, Affiliated Hospital, Guilin Medical College, Guilin, Guangxi 541001)
【 Abstract】 Objective To detect and quantitate genital herpesvirus DNA in clinical specimens samples from 100 cases of genital herpes. Methods Using PCR and enzyme- linked immunosorbent assay (ELISA) and a standard curve of DNA copies of HSV as the quantitative contrast. Results Ninety three cases were HSV positive and 7 cases negative among 100 samples. There were 58 cases of HSV- 2(62.4% ) and 35 cases of HSV- 1(37.6% ) among 93 positive cases. The results of quantitation showed the number of DNA plasmids ranged from 115 to 1.1× 105/250 μ L of specimen among total 93 positive samples and the mean was 7.1× 104/250 μ L. The number of HSV DNA plasmids ranged from 136 to 1.1× 105 copies per 250 μ L, and the mean was 7.6× 104 among 58 positive samples of HSV- 2; the number of HSV DNA plasmids ranged from 115 to 9.4× 104 per 250 μ L， and the mean was 6.3× 104 among 35 positive samples of HSV- 1. Meanwhile 10 μ L of extracted and dissolved DNA randomly taken from 8 out of 58 cases of HSV- 2 and 35 cases of HSV- 1, respectively, were tested, the results indicated the number of HSV- 2 DNA plasmids ranged from 35 copies to 2.7× 104 and the mean was 1.8× 104 and the number of HSV- 1 DNA ranged from 29 to 2.5× 104 and the mean was 1.6× 104. In 7 negative cases, the results of quantitation were zero. Conclusions The sensitivity of ELISA quantitation (93% ) equals to that of Southern blot, and the sensitivity of PCR for diagnosis is 91% , and the PCR for typing is 88% .
, 百拇医药
【 Key words】 HSV DNA quantitation PCR ELISA Southern blot
泌尿生殖道单纯疱疹病毒2型(HSV-2)或1型(HSV-1)感染是一种临床上常见和复发性疾病。虽然已有几种抗病毒药用于临床治疗，但并不是非常有效或效果不稳定[1,2]，这已经成为一个世界问题[3]。我们采用标准的HSVDNA质粒作为定量测定标准，用聚合酶链反应(PCR)和酶联免疫吸附法(ELISA)对100例生殖器疱疹患者HSV-2和HSV-1DNA质粒数进行了定量测定研究。旨在检测临床泌尿生殖道HSVDNA感染的质粒数量情况及本文所使用的方法实用情况。现将有关结果报道如下。
材料和方法
一、材料
1.标本来源：渥太华大学医学院附属儿童医院、附属总医院就诊的青年男女患者，部分孕妇生殖器疱疹患者。其中男56例，女44例(含孕妇12例)。年龄14～57岁，平均32岁。取材时病期从初发1周到2个月，其中多数为初发患者，少数为复发患者。
, 百拇医药
2.取材方法：用棉拭子直接涂皮损处，然后将棉拭子转浸入内装有1mL“转移病毒液”(该液可使细胞内病毒保持存活，但不分裂增殖)的试管盖紧送检。转移病毒液组成成分为每升含明胶5g，Hanks平衡盐9.80g，2-氮羟乙基哌嗪-2氮′乙烷磺酸(HEPES)5.96g，碳酸氢钠0.35g，硫酸庆大霉素10mL。
二、方法
1.病毒模板DNA的制备：用“液体标本RNA/DNA蛋白质分离提取盒”(由美国MolecularResearchCenterInc提供)。其方法是取标本混悬液0.25mL加入至上述试剂盒DNA提取液0.75mL中，总容量为1mL。按试剂盒试验程序提取，最后将各标本提取的HSVDNA分别溶入40μL8mmol/L的氢氧化钠溶液中，并置-20℃备PCR分析。
2.PCR引物和条件：取上样10μL加入到90μLPCR反应液中，总反应容量为100μL/反应管。标准的HSV-1或HSV-2DNA质粒(107个质粒/μL，由美国ViralandCellularDNAControl提供)，分别用高压过的蒸馏水系列稀释为5×105DNA质粒/10μL，5×103质粒/10μL，5×101质粒/10μL和5×10-1质粒/10μL。然后分别加入到90μLPCR反应液中，总容量100μL。据此制出标准DNA测量曲线。PCR引物[3,4]：HSV引物-1序列为：1603CAGTACGGCCCCGAGTTCGTGA1624；HSV引物-2序列为：2059AACATCACCCGCACCATCTAC2079，但是HSV引物-22079的5′端被生物素化。分型PCR正向引物序列(DNAP5)为：5′-ATCGTGAACATCGACATGTACGG-3′；反向引物可分为：①DNAP3-1：5′-CCTCGCGTTCGTCCTCGTCCTCC-3′,可扩增HSV-1DNA;②DNAP3-2：5′-CCTCCTTGTTGTCGAGGCCCCGAAAC-3′，可扩增HSV-2DNA。PCR条件：使用480PCR机(Perkin-Elmer)DNA在94℃下变性60s，引物在65℃退火1.5min，引物在72℃下延伸2min，循环总数为30。最后1个循环，72℃下10min，在做HSVPCR时，每个标本均同时做β-肌动蛋白PCR加以验证。
, 百拇医药
3.DNA印迹分析[3,4]：电泳后的PCR产品转入硝酸纤维膜上，用生物素标记寡聚探针HSV-P3杂交。
4.PCR产物定量测定：各取PCR产物5μL，以及系列稀释过的标准HSV-1或HSV-2PCR产物5μL进行ELISA。反应1～2h，用2mol/L碳酸氢钠液终止反应后，经ELISA盘阅读机和电脑在405μm波长下阅读吸收值，其各标本产色吸收值与标准曲线色值相比较，便可得出各标本的病毒质粒数[5]。
结果
详见表1和表2。
表1 诊断PCR、HSV-1、HSV-2分型PCR、DNA印迹与ELISA DNA测量阳性率比较
测定方法 总例数 阳性例数(%) 阴性例数(%) 诊断PCR 100 91(91%) 9(9%) 分型PCR 100 88(88%) 12(12%) DNA印迹 100 93(93%) 7(7%) ELISA DNA定量 100 93(93%) 7(7%) 表2 PCR和ELISA测定93例阳性患者DNA质粒数结果讨论
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HSV分型 测定例数 标本容量(μL) DNA质粒数 最高值 最低值 平均值 HSV-2 8 10 2.7×104 35 1.8×104 HSV-1 8 10 2.5×104 29 1.6×104 HSV-2 58 250 1.1×105 136 7.6×104 HSV-1 35 250 9.4×104 115 6.3×104 HSV-1和HSV-2 93 250 1.1×105 115 7.1×104
注：7例阴性患者DNA质粒数测定均为0
讨论
从本文结果可看出，DNA质粒数最高与最低值之间存在一个巨大差距。其确切原因还不清楚，可能与患者取材的病期长短和初发或复发患者等因素有关。Cone等[6]报告用基因组同等物测定HSVDNA质粒数为11571/50μL标本混悬液，本文测定结果高于他们的结果(按几何平均值)，这可能与本文使用的方法更敏感有关。本文检测方法阳性率比较，DNA印迹法与ELISA测量均为93%，高于诊断PCR91%和HSV分型PCR88%。因此，PCR和ELISADNA测量同时使用可提高单用PCR对HSV的阳性诊断率。在实验中也同时发现在93例阳性患者中，HVS-1患者为35例，占阳性患者中的37.6%。表明近年来HSV-1在泌尿生殖器疱疹病毒感染中已有明显升高。
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志谢中国医学科学院皮肤病研究所吴绍熙教授
本文在加拿大渥太华大学医学院附属儿童医院研究所FranciscoDiazMitoma教授指导下完成
参 考 文 献
1，de Jong MD, Boucher CA, Cooper DA, et al. Summary of the Ⅱ international consensus symposium on combined antiviral therapy and implications for future therapies. Antiviral Res, 1997,35:65- 82.
2，Orozco- Topete R, Sierra Madero J, Cano Dominguez C, et al. Safety and efficacy of Virend for topical treatment of genital and anal herpes simplex lesions in patients with AIDS. Antiviral Res, 1997,35:91- 103.
, 百拇医药
3，Diaz- Mitoma F, Ruben M, Sacks S, et al. Detection of viral DNA to evaluate the outcome of antiviral treatment of patients with recurrent genital herpes. J Clin Microbiol, 1996,34:657- 663.
4，Kimura H, Shibata M, Kuzushima K, et al. Detection and direct typing of herpes simplex virus by polymerase chain reaction. Med Microbiol Immunol, 1990,179:177- 184.
5，Hammerle T, Falkner FG, Dorner F. A sensitive PCR assay system for the quantitation of viral genome equivalents: hepatitis C virus (HCV). Arch Virol, 1996,141:2103- 2114.
6，Cone RW, Hobson AC, Brown Z, et al. Frequent detection of genital herpes simplex virus DNA by polymerase chain reaction among pregnant women. JAMA, 1994,272:792- 796.
( 收 稿 日 期 ： 1999- 09- 16), http://www.100md.com
单位：541001广西省桂林医学院附属医院皮肤科
关键词：HSVDNA定量；聚合酶链反应；酶联免疫吸附法；DNA印迹
中华皮肤科杂志000310
【摘要】目的对生殖器疱疹病毒(HSV)患者病毒DNA进行定量测定。方法以标准的HSV质粒作为标准，用聚合酶链反应(PCR)和酶联免疫吸附法(ELISA)，定量测定HSVDNA。结果100例生殖器疱疹患者中93例HSV测定阳性，7例阴性。在93例阳性者中有58例为HSV-2(占62.4%)，35例为HSV-1(占37.6%)。93例阳性者定量测定结果，250μL标本混悬液中DNA质粒数为115～1.1×105个，平均7.1×104个；58例HSV-2阳性者，250μL标本悬液DNA质粒数为136～1.1×105个，平均7.6×104个；35例HSV-1阳性者DNA质粒数为115～9.4×104个，平均6.3×104个。分别随机取HSV-2和HSV-1阳性患者各8例已淬取和纯化的DNA混悬液10μL，定量测定结果显示：HSV-2患者最高为2.7×104个DNA质粒数，最低35个，平均1.8×104个。HSV-1最高2.5×104个，最低29个，平均1.6×104个。结论所用几种检测法中ELISA定量总阳性率为93%，与DNA印迹法阳性率相同。诊断PCR阳性率为91%,HSV分型PCR阳性率为88%。
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Quantitation of Genital Herpesvirus DNA with Polymerase Chain Reaction and ELISA
CHENG Peihua
(Department of Dermatology, Affiliated Hospital, Guilin Medical College, Guilin, Guangxi 541001)
【 Abstract】 Objective To detect and quantitate genital herpesvirus DNA in clinical specimens samples from 100 cases of genital herpes. Methods Using PCR and enzyme- linked immunosorbent assay (ELISA) and a standard curve of DNA copies of HSV as the quantitative contrast. Results Ninety three cases were HSV positive and 7 cases negative among 100 samples. There were 58 cases of HSV- 2(62.4% ) and 35 cases of HSV- 1(37.6% ) among 93 positive cases. The results of quantitation showed the number of DNA plasmids ranged from 115 to 1.1× 105/250 μ L of specimen among total 93 positive samples and the mean was 7.1× 104/250 μ L. The number of HSV DNA plasmids ranged from 136 to 1.1× 105 copies per 250 μ L, and the mean was 7.6× 104 among 58 positive samples of HSV- 2; the number of HSV DNA plasmids ranged from 115 to 9.4× 104 per 250 μ L， and the mean was 6.3× 104 among 35 positive samples of HSV- 1. Meanwhile 10 μ L of extracted and dissolved DNA randomly taken from 8 out of 58 cases of HSV- 2 and 35 cases of HSV- 1, respectively, were tested, the results indicated the number of HSV- 2 DNA plasmids ranged from 35 copies to 2.7× 104 and the mean was 1.8× 104 and the number of HSV- 1 DNA ranged from 29 to 2.5× 104 and the mean was 1.6× 104. In 7 negative cases, the results of quantitation were zero. Conclusions The sensitivity of ELISA quantitation (93% ) equals to that of Southern blot, and the sensitivity of PCR for diagnosis is 91% , and the PCR for typing is 88% .
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【 Key words】 HSV DNA quantitation PCR ELISA Southern blot
泌尿生殖道单纯疱疹病毒2型(HSV-2)或1型(HSV-1)感染是一种临床上常见和复发性疾病。虽然已有几种抗病毒药用于临床治疗，但并不是非常有效或效果不稳定[1,2]，这已经成为一个世界问题[3]。我们采用标准的HSVDNA质粒作为定量测定标准，用聚合酶链反应(PCR)和酶联免疫吸附法(ELISA)对100例生殖器疱疹患者HSV-2和HSV-1DNA质粒数进行了定量测定研究。旨在检测临床泌尿生殖道HSVDNA感染的质粒数量情况及本文所使用的方法实用情况。现将有关结果报道如下。
材料和方法
一、材料
1.标本来源：渥太华大学医学院附属儿童医院、附属总医院就诊的青年男女患者，部分孕妇生殖器疱疹患者。其中男56例，女44例(含孕妇12例)。年龄14～57岁，平均32岁。取材时病期从初发1周到2个月，其中多数为初发患者，少数为复发患者。
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2.取材方法：用棉拭子直接涂皮损处，然后将棉拭子转浸入内装有1mL“转移病毒液”(该液可使细胞内病毒保持存活，但不分裂增殖)的试管盖紧送检。转移病毒液组成成分为每升含明胶5g，Hanks平衡盐9.80g，2-氮羟乙基哌嗪-2氮′乙烷磺酸(HEPES)5.96g，碳酸氢钠0.35g，硫酸庆大霉素10mL。
二、方法
1.病毒模板DNA的制备：用“液体标本RNA/DNA蛋白质分离提取盒”(由美国MolecularResearchCenterInc提供)。其方法是取标本混悬液0.25mL加入至上述试剂盒DNA提取液0.75mL中，总容量为1mL。按试剂盒试验程序提取，最后将各标本提取的HSVDNA分别溶入40μL8mmol/L的氢氧化钠溶液中，并置-20℃备PCR分析。
2.PCR引物和条件：取上样10μL加入到90μLPCR反应液中，总反应容量为100μL/反应管。标准的HSV-1或HSV-2DNA质粒(107个质粒/μL，由美国ViralandCellularDNAControl提供)，分别用高压过的蒸馏水系列稀释为5×105DNA质粒/10μL，5×103质粒/10μL，5×101质粒/10μL和5×10-1质粒/10μL。然后分别加入到90μLPCR反应液中，总容量100μL。据此制出标准DNA测量曲线。PCR引物[3,4]：HSV引物-1序列为：1603CAGTACGGCCCCGAGTTCGTGA1624；HSV引物-2序列为：2059AACATCACCCGCACCATCTAC2079，但是HSV引物-22079的5′端被生物素化。分型PCR正向引物序列(DNAP5)为：5′-ATCGTGAACATCGACATGTACGG-3′；反向引物可分为：①DNAP3-1：5′-CCTCGCGTTCGTCCTCGTCCTCC-3′,可扩增HSV-1DNA;②DNAP3-2：5′-CCTCCTTGTTGTCGAGGCCCCGAAAC-3′，可扩增HSV-2DNA。PCR条件：使用480PCR机(Perkin-Elmer)DNA在94℃下变性60s，引物在65℃退火1.5min，引物在72℃下延伸2min，循环总数为30。最后1个循环，72℃下10min，在做HSVPCR时，每个标本均同时做β-肌动蛋白PCR加以验证。
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3.DNA印迹分析[3,4]：电泳后的PCR产品转入硝酸纤维膜上，用生物素标记寡聚探针HSV-P3杂交。
4.PCR产物定量测定：各取PCR产物5μL，以及系列稀释过的标准HSV-1或HSV-2PCR产物5μL进行ELISA。反应1～2h，用2mol/L碳酸氢钠液终止反应后，经ELISA盘阅读机和电脑在405μm波长下阅读吸收值，其各标本产色吸收值与标准曲线色值相比较，便可得出各标本的病毒质粒数[5]。
结果
详见表1和表2。
表1 诊断PCR、HSV-1、HSV-2分型PCR、DNA印迹与ELISA DNA测量阳性率比较
测定方法 总例数 阳性例数(%) 阴性例数(%) 诊断PCR 100 91(91%) 9(9%) 分型PCR 100 88(88%) 12(12%) DNA印迹 100 93(93%) 7(7%) ELISA DNA定量 100 93(93%) 7(7%) 表2 PCR和ELISA测定93例阳性患者DNA质粒数结果讨论
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HSV分型 测定例数 标本容量(μL) DNA质粒数 最高值 最低值 平均值 HSV-2 8 10 2.7×104 35 1.8×104 HSV-1 8 10 2.5×104 29 1.6×104 HSV-2 58 250 1.1×105 136 7.6×104 HSV-1 35 250 9.4×104 115 6.3×104 HSV-1和HSV-2 93 250 1.1×105 115 7.1×104
注：7例阴性患者DNA质粒数测定均为0
讨论
从本文结果可看出，DNA质粒数最高与最低值之间存在一个巨大差距。其确切原因还不清楚，可能与患者取材的病期长短和初发或复发患者等因素有关。Cone等[6]报告用基因组同等物测定HSVDNA质粒数为11571/50μL标本混悬液，本文测定结果高于他们的结果(按几何平均值)，这可能与本文使用的方法更敏感有关。本文检测方法阳性率比较，DNA印迹法与ELISA测量均为93%，高于诊断PCR91%和HSV分型PCR88%。因此，PCR和ELISADNA测量同时使用可提高单用PCR对HSV的阳性诊断率。在实验中也同时发现在93例阳性患者中，HVS-1患者为35例，占阳性患者中的37.6%。表明近年来HSV-1在泌尿生殖器疱疹病毒感染中已有明显升高。
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志谢中国医学科学院皮肤病研究所吴绍熙教授
本文在加拿大渥太华大学医学院附属儿童医院研究所FranciscoDiazMitoma教授指导下完成
参 考 文 献
1，de Jong MD, Boucher CA, Cooper DA, et al. Summary of the Ⅱ international consensus symposium on combined antiviral therapy and implications for future therapies. Antiviral Res, 1997,35:65- 82.
2，Orozco- Topete R, Sierra Madero J, Cano Dominguez C, et al. Safety and efficacy of Virend for topical treatment of genital and anal herpes simplex lesions in patients with AIDS. Antiviral Res, 1997,35:91- 103.
, 百拇医药
3，Diaz- Mitoma F, Ruben M, Sacks S, et al. Detection of viral DNA to evaluate the outcome of antiviral treatment of patients with recurrent genital herpes. J Clin Microbiol, 1996,34:657- 663.
4，Kimura H, Shibata M, Kuzushima K, et al. Detection and direct typing of herpes simplex virus by polymerase chain reaction. Med Microbiol Immunol, 1990,179:177- 184.
5，Hammerle T, Falkner FG, Dorner F. A sensitive PCR assay system for the quantitation of viral genome equivalents: hepatitis C virus (HCV). Arch Virol, 1996,141:2103- 2114.
6，Cone RW, Hobson AC, Brown Z, et al. Frequent detection of genital herpes simplex virus DNA by polymerase chain reaction among pregnant women. JAMA, 1994,272:792- 796.
( 收 稿 日 期 ： 1999- 09- 16), http://www.100md.com