人型支原体gyrA基因突变与耐喹诺酮类药物的关系
作者：向斌 吴移谋 尹卫国 余敏君
单位：421001湖南省衡阳医学院微生物学教研室
关键词：支原体；人型基因；gyrA突变喹诺酮类
中华皮肤科杂志000309
【摘要】目的探讨gyrA基因在人型支原体(Mh)耐喹诺酮类药物中的突变作用。方法从100株取自临床的Mh中，通过肉汤稀释法筛选出3株对9种喹诺酮类药物呈交叉耐药的Mh株，进行gyrA基因的PCR扩增，分析产物的核苷酸序列，与标准敏感株MhPG21的gyrA基因进行比较。结果3株Mh的gyrA基因PCR扩增均得到一350bp的阳性片段，产物核苷酸序列分析发现3株均有113位C→T、168位T→A、183位C→T、261位T→C的突变，其中113位C→T的突变导致其编码的83位丝氨酸转变为亮氨酸，其它突变未改变其编码的氨基酸。结论gyrA基因中C→T的突变与Mh耐喹诺酮类药物密切相关。
, 百拇医药
Study on gyrA Gene Mutations in Quinolone Resistant Mycoplasma Hominis
XIANG Bin
(Department of Microbiology, Hengyang Medical College, Hunan 421001)
WU Yimou
(Department of Microbiology, Hengyang Medical College, Hunan 421001)
YIN Weiguo
(Department of Microbiology, Hengyang Medical College, Hunan 421001)
, 百拇医药
【 Abstract】 Objective To study the role of gyrA gene in quinolone resistant mutants of Mycoplasma hominis(Mh). Methods Three cross resistant mutants of Mycoplasma hominis(Mh) to 9 quinolones were selected from 100 clinical strains of Mh by broth dilution method. Their gyrA were amplified by PCR, and the nucleotide sequences were compared to those of susceptible strain MhPG21 by DNA sequencing. Results A 350 bp DNA fragment was obtained by PCR. Three resistant mutants contained nucleotide 113 C→ T， 168 T→ A， 183 C→ T， 261 T→ C transitions. Only 113 C→ T transition lead to substitution of Ser- 83 by Leu in the gyrA protein, the others did not lead to the substitution of amino acid. Conclusion These results suggest that a gyrA mutation in Mh at Ser- 83 is associated with quinolone resistance.
, http://www.100md.com
【 Key words】 Mycoplasma hominis Genes,gyrA Mutation Quinolones
喹诺酮类药物是治疗泌尿生殖道人型支原体(Mh)感染的常用药物。其作用机制主要是通过抑制支原体DNA旋转酶活性而阻碍DNA复制。DNA旋转酶为A、B亚单位组成的A2B2四聚体，分别由gyrA和GyrB基因编码[1]。我们将3株对9种喹诺酮类药物呈交叉耐药的Mh株gyrA基因进行PCR扩增，分析产物的核苷酸序列，并与标准敏感株MhPG21比较，了解临床Mh株gyrA基因突变与耐喹诺酮类药物的关系。现将结果报道如下。
材料和方法
一、材料
1.标本来源及收集：按照文献[2]方法，从性病门诊收集的824份泌尿生殖道感染患者标本中分离，鉴定得到100株Mh。
, 百拇医药
2.抗菌药物：氧氟沙星(OFLX)、奈啶酸(NAL)、盐酸环丙沙星(CFLX)、左旋氧氟沙星(L-OFLX)、司帕沙星(SPLX)、Y98-37、Y98-23、Y98-31、Y98-32均为中国科学院上海药物研究所惠赠的粉剂。以上药物均用二甲基甲酰胺(DMF)与乙醇溶解，再用灭菌蒸馏水配成1600～3200μg/mL的母液作为储存液，置-70℃冰箱保存备用。
3.试剂：TaqDNA聚合酶，Marker,dNTP和Tris等试剂均购自上海生工公司；人型液体培养基按照文献[2,3]方法配制。
二、方法
1.药物敏感性试验：采用肉汤稀释法，按照文献[3]方法进行。
2.模板DNA提取：取耐药菌株培养物200μL，1400r/min，离心20min，弃上清液，沉淀物中加入50μL标本裂解液，100℃煮沸10min，1400r/min离心5min，取上清液10μL作为DNA模板。
, 百拇医药
3.PCR引物及反应条件：gyrA基因的PCR扩增引物、反应体系各成分浓度参照Bebear等[4]方法进行。上游引物5′-TATGGTATGAGTGAACTTGG-3′、下游引物5′-AATTAGGGAAACGTGATGGC-3′，由上海生工公司合成。扩增条件：92℃变性10min后进入循环，92℃60s，57℃60s,72℃120s，40个循环后72℃450s，终止反应。实验设空白对照组，取反应产物10μL在1.5%琼脂糖凝胶(含0.05%溴乙啶)电泳，紫外灯下观察结果并照相。-20℃保存产物。
4.序列测定：PCR扩增产物经回收、纯化，ABI、PRISMTMDYE末端标记，用上游引物进行单链测序反应，反应条件：96℃变性10s，56℃退火5s，60℃延伸4min，25个循环后，PE公司产377DNA自动测序仪进行核苷酸序列测定后，与标准敏感株MhPG21的gyrA基因核苷酸序列[4]进行比较。
结果
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1.从临床标本中分离的100株Mh株通过肉汤稀释法筛选出对9种喹诺酮类药物呈交叉耐药的3株，它们的MIC值见表1。
表1 3株人型支原体耐喹诺酮类药物MIC值
人型支原体 MIC(μg/mL) OFLX NAL CFLX L-OFLX SPLX Y98-37 Y98-23 Y98-31 Y98-32 Mh1 ≥32 128 128 64 16 32 16 16 32 Mh2 ≥8 128 32 8 8 8 8 8 32 Mh3 ≥64 128 128 64 32 32 32 16 64 2.gyrA基因PCR扩增与基因突变检测：对3株耐药Mh进行gyrA基因的PCR扩增后，得到一大小为350bp的片段。将此片段进行测序后与标准敏感株MhPG21的gyrA核苷酸序列进行比较后发现(图1)：
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图1标准敏感株MhPG21的gyrA基因核苷酸序列及其编码
的氨基酸，T*、A*、T*、C*表示3株耐药株碱基的改变
在3株喹诺酮类药物耐药株中均有碱基113位C→T、168位T→A、183位C→T、261位T→C的突变，其中只有113位C→T的突变为误义突变，使其编码的83位氨基酸由丝氨酸变为亮氨酸，而其它3个位点均为同义突变，它们编码的氨基酸没有改变。
讨论
关于喹诺酮类药物的耐药机制，国内外以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌研究的较多，对泌尿生殖道支原体的研究主要为诱导耐药的Mh。Yoshida等[5]报道大肠杆菌gyrA基因上至少10个点突变导致氨基酸被替代，从而引起高水平耐药。大肠杆菌gyrA基因序列上，残基67～106区域常常发生突变，因而命名为喹诺酮类药物耐药区(QRDR，quinoloneresistencedetermingregion)。对金黄色葡萄球菌研究也显示：gyrA亚基的QRDR位于残基68～107区域，其中84～88区域的突变与耐喹诺酮类药物的关系最为密切。最近Bebear等[4]用多种喹诺酮类药物对标准MhPG21株进行诱导耐药，经多次传代后获得耐药株，并对耐药株的gyrA基因进行序列分析发现：Mh的gyrA基因也有QRDR存在，位于残基63～181区域，其中第113位C→T的突变导致了83位丝氨酸被亮氨酸替代，引起Mh的耐药。每一种gyrA基因的突变都可造成对喹诺酮类所有药物的耐药。本研究通过对3株从临床上获得的对9种喹诺酮类药物交叉耐药的Mh进行gyrA基因的PCR扩增、核苷酸序列分析后，发现4个点突变，其中只有113位C→T为误义突变，导致其编码的83位丝氨酸被亮氨酸替代，这与Bebear等对诱导耐药株研究结果一致。其它3个则为同义突变，它们编码的氨基酸不变。此外，3株发生点突变的Mh都表现为对9种喹诺酮类药物不同程度的交叉耐药，这一点也提示MhgyrA基因上点突变都可造成对喹诺酮类中所有药物的交叉耐药。
, 百拇医药
本研究为湖南省教委资助重点课题部分工作
参 考 文 献
1，Recce RJ, Maxwell A. DNA gyrase: structure and function. Crit Rev Biochem Mol Biol, 1991,26:335- 375.
2，吴移谋，余敏君，尹卫国，等.从临床标本中定量检测泌尿生殖道支原体耐药性的研究.中华医学检验杂志，1998，21：335-337.
3，吴移谋，尹卫国，余敏君，等.三种抗菌药物体外抗5种支原体的活性研究.中国现代医学杂志，1996，12：9-10.
4，Bebear CM, Bove JM, Bebear C, et al. Characterization of Mycoplasma hominis mutations involved in resistance to fluoroquinolones. Antimicrobal Agent Chemother, 1997,41:269- 273.
5，Yoshida H, Bogaki M, Nakamura M, et al. Quinolone resistance determining region in the DNA gyrase gyrA gene of Escherichia coli. Antimicrob Agents Chemother, 1990,34:1271- 1272.
(收 稿 日 期 ： 1999- 08- 30), http://www.100md.com
单位：421001湖南省衡阳医学院微生物学教研室
关键词：支原体；人型基因；gyrA突变喹诺酮类
中华皮肤科杂志000309
【摘要】目的探讨gyrA基因在人型支原体(Mh)耐喹诺酮类药物中的突变作用。方法从100株取自临床的Mh中，通过肉汤稀释法筛选出3株对9种喹诺酮类药物呈交叉耐药的Mh株，进行gyrA基因的PCR扩增，分析产物的核苷酸序列，与标准敏感株MhPG21的gyrA基因进行比较。结果3株Mh的gyrA基因PCR扩增均得到一350bp的阳性片段，产物核苷酸序列分析发现3株均有113位C→T、168位T→A、183位C→T、261位T→C的突变，其中113位C→T的突变导致其编码的83位丝氨酸转变为亮氨酸，其它突变未改变其编码的氨基酸。结论gyrA基因中C→T的突变与Mh耐喹诺酮类药物密切相关。
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Study on gyrA Gene Mutations in Quinolone Resistant Mycoplasma Hominis
XIANG Bin
(Department of Microbiology, Hengyang Medical College, Hunan 421001)
WU Yimou
(Department of Microbiology, Hengyang Medical College, Hunan 421001)
YIN Weiguo
(Department of Microbiology, Hengyang Medical College, Hunan 421001)
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【 Abstract】 Objective To study the role of gyrA gene in quinolone resistant mutants of Mycoplasma hominis(Mh). Methods Three cross resistant mutants of Mycoplasma hominis(Mh) to 9 quinolones were selected from 100 clinical strains of Mh by broth dilution method. Their gyrA were amplified by PCR, and the nucleotide sequences were compared to those of susceptible strain MhPG21 by DNA sequencing. Results A 350 bp DNA fragment was obtained by PCR. Three resistant mutants contained nucleotide 113 C→ T， 168 T→ A， 183 C→ T， 261 T→ C transitions. Only 113 C→ T transition lead to substitution of Ser- 83 by Leu in the gyrA protein, the others did not lead to the substitution of amino acid. Conclusion These results suggest that a gyrA mutation in Mh at Ser- 83 is associated with quinolone resistance.
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【 Key words】 Mycoplasma hominis Genes,gyrA Mutation Quinolones
喹诺酮类药物是治疗泌尿生殖道人型支原体(Mh)感染的常用药物。其作用机制主要是通过抑制支原体DNA旋转酶活性而阻碍DNA复制。DNA旋转酶为A、B亚单位组成的A2B2四聚体，分别由gyrA和GyrB基因编码[1]。我们将3株对9种喹诺酮类药物呈交叉耐药的Mh株gyrA基因进行PCR扩增，分析产物的核苷酸序列，并与标准敏感株MhPG21比较，了解临床Mh株gyrA基因突变与耐喹诺酮类药物的关系。现将结果报道如下。
材料和方法
一、材料
1.标本来源及收集：按照文献[2]方法，从性病门诊收集的824份泌尿生殖道感染患者标本中分离，鉴定得到100株Mh。
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2.抗菌药物：氧氟沙星(OFLX)、奈啶酸(NAL)、盐酸环丙沙星(CFLX)、左旋氧氟沙星(L-OFLX)、司帕沙星(SPLX)、Y98-37、Y98-23、Y98-31、Y98-32均为中国科学院上海药物研究所惠赠的粉剂。以上药物均用二甲基甲酰胺(DMF)与乙醇溶解，再用灭菌蒸馏水配成1600～3200μg/mL的母液作为储存液，置-70℃冰箱保存备用。
3.试剂：TaqDNA聚合酶，Marker,dNTP和Tris等试剂均购自上海生工公司；人型液体培养基按照文献[2,3]方法配制。
二、方法
1.药物敏感性试验：采用肉汤稀释法，按照文献[3]方法进行。
2.模板DNA提取：取耐药菌株培养物200μL，1400r/min，离心20min，弃上清液，沉淀物中加入50μL标本裂解液，100℃煮沸10min，1400r/min离心5min，取上清液10μL作为DNA模板。
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3.PCR引物及反应条件：gyrA基因的PCR扩增引物、反应体系各成分浓度参照Bebear等[4]方法进行。上游引物5′-TATGGTATGAGTGAACTTGG-3′、下游引物5′-AATTAGGGAAACGTGATGGC-3′，由上海生工公司合成。扩增条件：92℃变性10min后进入循环，92℃60s，57℃60s,72℃120s，40个循环后72℃450s，终止反应。实验设空白对照组，取反应产物10μL在1.5%琼脂糖凝胶(含0.05%溴乙啶)电泳，紫外灯下观察结果并照相。-20℃保存产物。
4.序列测定：PCR扩增产物经回收、纯化，ABI、PRISMTMDYE末端标记，用上游引物进行单链测序反应，反应条件：96℃变性10s，56℃退火5s，60℃延伸4min，25个循环后，PE公司产377DNA自动测序仪进行核苷酸序列测定后，与标准敏感株MhPG21的gyrA基因核苷酸序列[4]进行比较。
结果
, http://www.100md.com
1.从临床标本中分离的100株Mh株通过肉汤稀释法筛选出对9种喹诺酮类药物呈交叉耐药的3株，它们的MIC值见表1。
表1 3株人型支原体耐喹诺酮类药物MIC值
人型支原体 MIC(μg/mL) OFLX NAL CFLX L-OFLX SPLX Y98-37 Y98-23 Y98-31 Y98-32 Mh1 ≥32 128 128 64 16 32 16 16 32 Mh2 ≥8 128 32 8 8 8 8 8 32 Mh3 ≥64 128 128 64 32 32 32 16 64 2.gyrA基因PCR扩增与基因突变检测：对3株耐药Mh进行gyrA基因的PCR扩增后，得到一大小为350bp的片段。将此片段进行测序后与标准敏感株MhPG21的gyrA核苷酸序列进行比较后发现(图1)：
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图1标准敏感株MhPG21的gyrA基因核苷酸序列及其编码
的氨基酸，T*、A*、T*、C*表示3株耐药株碱基的改变
在3株喹诺酮类药物耐药株中均有碱基113位C→T、168位T→A、183位C→T、261位T→C的突变，其中只有113位C→T的突变为误义突变，使其编码的83位氨基酸由丝氨酸变为亮氨酸，而其它3个位点均为同义突变，它们编码的氨基酸没有改变。
讨论
关于喹诺酮类药物的耐药机制，国内外以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌研究的较多，对泌尿生殖道支原体的研究主要为诱导耐药的Mh。Yoshida等[5]报道大肠杆菌gyrA基因上至少10个点突变导致氨基酸被替代，从而引起高水平耐药。大肠杆菌gyrA基因序列上，残基67～106区域常常发生突变，因而命名为喹诺酮类药物耐药区(QRDR，quinoloneresistencedetermingregion)。对金黄色葡萄球菌研究也显示：gyrA亚基的QRDR位于残基68～107区域，其中84～88区域的突变与耐喹诺酮类药物的关系最为密切。最近Bebear等[4]用多种喹诺酮类药物对标准MhPG21株进行诱导耐药，经多次传代后获得耐药株，并对耐药株的gyrA基因进行序列分析发现：Mh的gyrA基因也有QRDR存在，位于残基63～181区域，其中第113位C→T的突变导致了83位丝氨酸被亮氨酸替代，引起Mh的耐药。每一种gyrA基因的突变都可造成对喹诺酮类所有药物的耐药。本研究通过对3株从临床上获得的对9种喹诺酮类药物交叉耐药的Mh进行gyrA基因的PCR扩增、核苷酸序列分析后，发现4个点突变，其中只有113位C→T为误义突变，导致其编码的83位丝氨酸被亮氨酸替代，这与Bebear等对诱导耐药株研究结果一致。其它3个则为同义突变，它们编码的氨基酸不变。此外，3株发生点突变的Mh都表现为对9种喹诺酮类药物不同程度的交叉耐药，这一点也提示MhgyrA基因上点突变都可造成对喹诺酮类中所有药物的交叉耐药。
, 百拇医药
本研究为湖南省教委资助重点课题部分工作
参 考 文 献
1，Recce RJ, Maxwell A. DNA gyrase: structure and function. Crit Rev Biochem Mol Biol, 1991,26:335- 375.
2，吴移谋，余敏君，尹卫国，等.从临床标本中定量检测泌尿生殖道支原体耐药性的研究.中华医学检验杂志，1998，21：335-337.
3，吴移谋，尹卫国，余敏君，等.三种抗菌药物体外抗5种支原体的活性研究.中国现代医学杂志，1996，12：9-10.
4，Bebear CM, Bove JM, Bebear C, et al. Characterization of Mycoplasma hominis mutations involved in resistance to fluoroquinolones. Antimicrobal Agent Chemother, 1997,41:269- 273.
5，Yoshida H, Bogaki M, Nakamura M, et al. Quinolone resistance determining region in the DNA gyrase gyrA gene of Escherichia coli. Antimicrob Agents Chemother, 1990,34:1271- 1272.
(收 稿 日 期 ： 1999- 08- 30), http://www.100md.com