p16基因在尖锐湿疣及其癌变中的意义
作者：苏向阳 徐广坤 苏祖兰 赖维 陆春
单位：苏向阳 徐广坤 赖维 陆春(510630广州，中山医科大学附属第三医院皮肤性病科)；苏祖兰(510630广州，中山医科大学附属第三医院病理科)
关键词：尖锐湿疣基因；p16
中华皮肤科杂志000304
【摘要】目的探讨p16基因在尖锐湿疣及其癌变中的作用及临床意义。方法应用聚合酶链-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)检测33例尖锐湿疣和7例尖锐湿疣癌变患者p16基因有无纯合性缺失和点突变。结果p16基因在尖锐湿疣及其癌变中存在纯合性缺失，而且缺失程度在尖锐湿疣癌变中明显升高，且是尖锐湿疣癌变的早期表现；未发现p16基因点突变。结论尖锐湿疣及其癌变与抑癌基因p16失活有关，临床上通过对尖锐湿疣患者p16基因的检测，有可能对尖锐湿疣癌变作出可能性预测及早期诊断，为发现癌变高危人群提供新的依据。
, 百拇医药
Significance of p16 Gene in Condyloma Acuminatum
SU Xiangyang
(Department of Dermatology and Venereology, The Third Affiliated Hospital, Sun Yet- Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510630)
XU Guangkun
(Department of Dermatology and Venereology, The Third Affiliated Hospital, Sun Yet- Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510630)
, 百拇医药
SU Zhulan
(Department of Dermatology and Venereology, The Third Affiliated Hospital, Sun Yet- Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510630)
【 Abstract】 Objective To investigate the clinical significance of p16 gene in condyloma acuminatum (CA) and the role in its canceration. Methods Both homologous deletion and mutation of p16 gene were tested in 33 CA samples and 7 samples of CA with canceration by polymerase chain reaction- single strand conformation polymorphism( PCR- SSCP) .Results The homologous deletion of p16 gene occurred in CA and CA with canceration. The deletion rate of p16 gene increased significantly in CA with canceration, and homologous deletion of p16 gene was found in the early stage of CA with canceration. There was no mutation of p16 gene in CA and its canceration. Conclusion The change of p16 gene is related to CA and its canceration. Detecting p16 gene in CA patients might be used to find high risk canceration group.
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【 Key words】 Condylomata acuminata Genes,p16
尖锐湿疣是最常见的性传播疾病之一，5%的外阴及肛周尖锐湿疣和4.7%～10%的宫颈尖锐湿疣患者，可发展为间变、原位癌和侵袭癌，故研究其癌变机理十分重要。本研究通过检测抑癌p16基因的两种失活机制——基因的纯合性缺失和点突变，探讨p16基因失活与尖锐湿疣及其癌变的关系，目的是了解尖锐湿疣及其癌变的内在机理，探索尖锐湿疣从良性转为恶性肿瘤的渐进规律，为其早期诊断及干预提供依据。
材料与方法
一、研究对象
本研究收集了从1996年12月至1997年12月的4组病例：30例正常人皮肤，33例尖锐湿疣患者，7例尖锐湿疣癌变患者[尖锐湿疣基础上出现鳞状细胞癌(鳞癌)的临床及病理改变]，25例外阴鳞状细胞癌患者。正常人皮肤组、尖锐湿疣组、尖锐湿疣癌变组第7例(大体及病理片见图1、2)、外阴鳞癌组第25例为新鲜标本，其余为石蜡标本。男53例，女42例，年龄17～84岁。收集标本时，每一病例的确诊均经严格的临床及病理检查。肿瘤标本确保组织来自肿瘤中央。
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二、研究方法
(一)标本病理形态复查：所有标本经石蜡切片常规HE染色，观察病理形态，再次确诊。
(二)DNA的提取：
1.新鲜组织的DNA提取：将米粒大组织和500μLTE充分匀浆后8000r/min离心5min，弃尽上清液，沉淀中加入200μLDNA提取液混匀，放沸水浴10min，12000r/min离心5min，取上清液存4℃冰箱备用。DNA提取液由我校达安基因诊断中心提供，含50mmol/LNaOH,10mmol/LTris-HCl(pH8.3),1%NP-40,1%TritonX-100,0.1mmol/LEDTA。
2.石蜡组织切片的DNA提取：取5μm厚的组织石蜡切片5张，加入1mL正辛烷与二甲苯的混合物30min，16000r/min离心5min，弃上清液。重复1次。加入0.5mL无水乙醇，盖好后反转数次，16000r/min离心5min，弃上清液。重复1次。用干净保鲜膜封好管口，上面用消毒针头穿几个小孔，4℃下静置过夜以挥干乙醇。随后的步骤与“新鲜组织的DNA提取”相同。
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图1 尖锐湿疣癌变组第7例病理图(HE10×20)：左上角可见灶性空泡细胞，真皮中大量癌细胞浸润并形成癌巢，可见角珠。右下角为该例临床皮损：阴茎包皮和冠状沟处见一菜花样肿物，约3cm×4cm大小，表面溃烂并有多量淡黄色水样渗液，周围皮肤有浸润及水肿
(三)p16基因外显子1(E1)、外显子2(E2A，E2B)的聚合酶链-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)：
1.PCR检测4组病例标本的p16基因：分别进行p16基因E1、E2A、E2B扩增，引物序列为E1：5′-CTTCGGCTGACTGGCTG-3′(正向)和5′-GGATCGGCCTCCGACC-3′(反向)；E2A：5′-TGGCTCTGACCATTCTGT-3′(正向)和5′-GGCGCAGTTGGGCTGG-3′(反向)；E2B：5′-TTTTCTTTCTGCCCTCTGCA-3′(正向)和5′-GACCTTCGGTGACTGATGAT-3′(反向)，均由我校达安基因诊断中心负责合成。PCR总反应体积为30μL，含10×PCR缓冲液3μL，2.0mmol/LdNTPS3μL，引物各10pmol，稀释5倍的模板DNA2μL，1U/μLTaq酶1.5μL，二甲基亚砜(DMSO)1μL，双蒸水18.5μL。反应条件：94℃预变性3min，然后94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸60s，共做35个循环，最后置72℃延伸5min。扩增产物行质量分数为2%琼脂糖电泳。E1、E2A、E2B电泳条带分别为280bp、244bp、242bp。每次均设置阳性和阴性对照。出现阳性条带者则取扩增产物行SSCP分析。
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2.p16基因PCR阳性扩增产物的SSCP分析：取8μLPCR阳性扩增产物加入变性剂(95%甲酰胺，0.25%溴酚蓝，0.5mol/LEDTA)，97℃变性6min，然后在质量分数为8%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，条件是：上样后300V10min，120V4h。最后以银染法显示单链泳动带型。每次电泳均将同一PCR扩增的正常对照和病变组织的PCR产物一起电泳，以前者为标准判定病变样本的单链带泳动是否异常。
结果
一、p16基因纯合性缺失检测结果
在PCR检测p16基因E1、E2A、E2B中，只要有其中1种PCR扩增产物缺失，即统称为p16基因纯合性缺失。在PCR扩增p16基因E1、E2A和E2B中，若只有1种或2种PCR扩增产物缺失，则称为p16基因部分缺失；若3种PCR扩增产物都缺失，则称为p16基因完全缺失。具体检测结果见表1。经χ2检验，各组缺失率之间差异存在显著性。
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二、p16基因点突变检测结果
本实验采用PCR-SSCP技术检测各组p16基因是否存在点突变。4组标本的p16基因E1、E2A、E2BPCR阳性产物SSCP电泳分析，结果与正常对照相比，未发现电泳带型异常改变，提示所有标本均无p16基因点突变。
表1各组p16基因纯合性缺失率和缺失类别
组 别 例数 缺失例数 缺失率(%) 缺失类别 部分缺失 完全缺失 正常人皮肤组 30 0 0 0 0 尖锐湿疣组 33 6 18.1 3 3 尖锐湿疣癌变组 7 5 5/7 5 0 外阴鳞癌组 25 10 40.0 9 1 合 计 95 21 22.1 17 4 讨论
p16基因变异的主要机制之一是p16基因纯合性缺失。目前已在多种鳞癌中观察到p16基因的纯合性缺失。Reed等[1]分析了29例侵袭性头颈部鳞癌，发现16例存在纯合性缺失，缺失率为67%；Wong等[2]进行了6例外阴鳞癌、125例宫颈鳞癌的检测，发现3例外阴鳞癌、7例宫颈鳞癌存在p16基因纯合性缺失。本实验结果发现：尖锐湿疣组p16基因缺失率为18.1%，与正常人皮肤组比较，差异有显著性(χ2检验，P<0.05)表明在尖锐湿疣阶段就出现p16缺失，而且基因的缺失类别与局灶性早期癌变以及原位癌一致。
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p16基因点突变是p16基因在某些肿瘤中失活的另一个主要机制，Reed等[1]在29例侵袭性原发性头颈部鳞癌中，只发现1例出现p16位点重排。Saunders等[3]发现原发性头颈部鳞癌p16基因有20%出现纯合性缺失，20%出现甲基化，但没有发现p16基因点突变。Chang等[4]研究了30例皮肤恶性肿瘤(其中有6例为鳞癌)，结果只有1例(非鳞癌)出现点突变。本实验所检测的标本均未发现p16基因点突变，提示尖锐湿疣及其癌变中可能无p16基因点突变机制参与，点突变是否尖锐湿疣及其癌变p16基因变异的主要机制，它与尖锐湿疣及其癌变的关系如何还有待进一步研究。
参 考 文 献
1，Reed AL, Califano J, Cairns P, et al. High frequency of p16(CDKN2/MTS- 1/INK4A) inactivation in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Res, 1996,56:3630- 3633.
, 百拇医药
2，Wong YF, Chung TK, Cheung TH, et al. p16INK4 and p15INK4B alterations in primary gynecologic malignancy. Gynecol Oncol, 1997,65 :319- 324.
3，Saunders JR Jr. The genetic basis of head and neck carcinoma. Am J Surg,1997,174:459- 461.
4，Chang TG, Wang J, Chen LW, et al. Loss of expression of the p16 gene is frequent in malignant skin tumors. Biochem Biophys Res Commun, 1997, 230:85- 88.
(收 稿 日 期 ： 1999- 05- 31), 百拇医药
单位：苏向阳 徐广坤 赖维 陆春(510630广州，中山医科大学附属第三医院皮肤性病科)；苏祖兰(510630广州，中山医科大学附属第三医院病理科)
关键词：尖锐湿疣基因；p16
中华皮肤科杂志000304
【摘要】目的探讨p16基因在尖锐湿疣及其癌变中的作用及临床意义。方法应用聚合酶链-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)检测33例尖锐湿疣和7例尖锐湿疣癌变患者p16基因有无纯合性缺失和点突变。结果p16基因在尖锐湿疣及其癌变中存在纯合性缺失，而且缺失程度在尖锐湿疣癌变中明显升高，且是尖锐湿疣癌变的早期表现；未发现p16基因点突变。结论尖锐湿疣及其癌变与抑癌基因p16失活有关，临床上通过对尖锐湿疣患者p16基因的检测，有可能对尖锐湿疣癌变作出可能性预测及早期诊断，为发现癌变高危人群提供新的依据。
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Significance of p16 Gene in Condyloma Acuminatum
SU Xiangyang
(Department of Dermatology and Venereology, The Third Affiliated Hospital, Sun Yet- Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510630)
XU Guangkun
(Department of Dermatology and Venereology, The Third Affiliated Hospital, Sun Yet- Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510630)
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SU Zhulan
(Department of Dermatology and Venereology, The Third Affiliated Hospital, Sun Yet- Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510630)
【 Abstract】 Objective To investigate the clinical significance of p16 gene in condyloma acuminatum (CA) and the role in its canceration. Methods Both homologous deletion and mutation of p16 gene were tested in 33 CA samples and 7 samples of CA with canceration by polymerase chain reaction- single strand conformation polymorphism( PCR- SSCP) .Results The homologous deletion of p16 gene occurred in CA and CA with canceration. The deletion rate of p16 gene increased significantly in CA with canceration, and homologous deletion of p16 gene was found in the early stage of CA with canceration. There was no mutation of p16 gene in CA and its canceration. Conclusion The change of p16 gene is related to CA and its canceration. Detecting p16 gene in CA patients might be used to find high risk canceration group.
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【 Key words】 Condylomata acuminata Genes,p16
尖锐湿疣是最常见的性传播疾病之一，5%的外阴及肛周尖锐湿疣和4.7%～10%的宫颈尖锐湿疣患者，可发展为间变、原位癌和侵袭癌，故研究其癌变机理十分重要。本研究通过检测抑癌p16基因的两种失活机制——基因的纯合性缺失和点突变，探讨p16基因失活与尖锐湿疣及其癌变的关系，目的是了解尖锐湿疣及其癌变的内在机理，探索尖锐湿疣从良性转为恶性肿瘤的渐进规律，为其早期诊断及干预提供依据。
材料与方法
一、研究对象
本研究收集了从1996年12月至1997年12月的4组病例：30例正常人皮肤，33例尖锐湿疣患者，7例尖锐湿疣癌变患者[尖锐湿疣基础上出现鳞状细胞癌(鳞癌)的临床及病理改变]，25例外阴鳞状细胞癌患者。正常人皮肤组、尖锐湿疣组、尖锐湿疣癌变组第7例(大体及病理片见图1、2)、外阴鳞癌组第25例为新鲜标本，其余为石蜡标本。男53例，女42例，年龄17～84岁。收集标本时，每一病例的确诊均经严格的临床及病理检查。肿瘤标本确保组织来自肿瘤中央。
, http://www.100md.com
二、研究方法
(一)标本病理形态复查：所有标本经石蜡切片常规HE染色，观察病理形态，再次确诊。
(二)DNA的提取：
1.新鲜组织的DNA提取：将米粒大组织和500μLTE充分匀浆后8000r/min离心5min，弃尽上清液，沉淀中加入200μLDNA提取液混匀，放沸水浴10min，12000r/min离心5min，取上清液存4℃冰箱备用。DNA提取液由我校达安基因诊断中心提供，含50mmol/LNaOH,10mmol/LTris-HCl(pH8.3),1%NP-40,1%TritonX-100,0.1mmol/LEDTA。
2.石蜡组织切片的DNA提取：取5μm厚的组织石蜡切片5张，加入1mL正辛烷与二甲苯的混合物30min，16000r/min离心5min，弃上清液。重复1次。加入0.5mL无水乙醇，盖好后反转数次，16000r/min离心5min，弃上清液。重复1次。用干净保鲜膜封好管口，上面用消毒针头穿几个小孔，4℃下静置过夜以挥干乙醇。随后的步骤与“新鲜组织的DNA提取”相同。
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图1 尖锐湿疣癌变组第7例病理图(HE10×20)：左上角可见灶性空泡细胞，真皮中大量癌细胞浸润并形成癌巢，可见角珠。右下角为该例临床皮损：阴茎包皮和冠状沟处见一菜花样肿物，约3cm×4cm大小，表面溃烂并有多量淡黄色水样渗液，周围皮肤有浸润及水肿
(三)p16基因外显子1(E1)、外显子2(E2A，E2B)的聚合酶链-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)：
1.PCR检测4组病例标本的p16基因：分别进行p16基因E1、E2A、E2B扩增，引物序列为E1：5′-CTTCGGCTGACTGGCTG-3′(正向)和5′-GGATCGGCCTCCGACC-3′(反向)；E2A：5′-TGGCTCTGACCATTCTGT-3′(正向)和5′-GGCGCAGTTGGGCTGG-3′(反向)；E2B：5′-TTTTCTTTCTGCCCTCTGCA-3′(正向)和5′-GACCTTCGGTGACTGATGAT-3′(反向)，均由我校达安基因诊断中心负责合成。PCR总反应体积为30μL，含10×PCR缓冲液3μL，2.0mmol/LdNTPS3μL，引物各10pmol，稀释5倍的模板DNA2μL，1U/μLTaq酶1.5μL，二甲基亚砜(DMSO)1μL，双蒸水18.5μL。反应条件：94℃预变性3min，然后94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸60s，共做35个循环，最后置72℃延伸5min。扩增产物行质量分数为2%琼脂糖电泳。E1、E2A、E2B电泳条带分别为280bp、244bp、242bp。每次均设置阳性和阴性对照。出现阳性条带者则取扩增产物行SSCP分析。
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2.p16基因PCR阳性扩增产物的SSCP分析：取8μLPCR阳性扩增产物加入变性剂(95%甲酰胺，0.25%溴酚蓝，0.5mol/LEDTA)，97℃变性6min，然后在质量分数为8%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，条件是：上样后300V10min，120V4h。最后以银染法显示单链泳动带型。每次电泳均将同一PCR扩增的正常对照和病变组织的PCR产物一起电泳，以前者为标准判定病变样本的单链带泳动是否异常。
结果
一、p16基因纯合性缺失检测结果
在PCR检测p16基因E1、E2A、E2B中，只要有其中1种PCR扩增产物缺失，即统称为p16基因纯合性缺失。在PCR扩增p16基因E1、E2A和E2B中，若只有1种或2种PCR扩增产物缺失，则称为p16基因部分缺失；若3种PCR扩增产物都缺失，则称为p16基因完全缺失。具体检测结果见表1。经χ2检验，各组缺失率之间差异存在显著性。
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二、p16基因点突变检测结果
本实验采用PCR-SSCP技术检测各组p16基因是否存在点突变。4组标本的p16基因E1、E2A、E2BPCR阳性产物SSCP电泳分析，结果与正常对照相比，未发现电泳带型异常改变，提示所有标本均无p16基因点突变。
表1各组p16基因纯合性缺失率和缺失类别
组 别 例数 缺失例数 缺失率(%) 缺失类别 部分缺失 完全缺失 正常人皮肤组 30 0 0 0 0 尖锐湿疣组 33 6 18.1 3 3 尖锐湿疣癌变组 7 5 5/7 5 0 外阴鳞癌组 25 10 40.0 9 1 合 计 95 21 22.1 17 4 讨论
p16基因变异的主要机制之一是p16基因纯合性缺失。目前已在多种鳞癌中观察到p16基因的纯合性缺失。Reed等[1]分析了29例侵袭性头颈部鳞癌，发现16例存在纯合性缺失，缺失率为67%；Wong等[2]进行了6例外阴鳞癌、125例宫颈鳞癌的检测，发现3例外阴鳞癌、7例宫颈鳞癌存在p16基因纯合性缺失。本实验结果发现：尖锐湿疣组p16基因缺失率为18.1%，与正常人皮肤组比较，差异有显著性(χ2检验，P<0.05)表明在尖锐湿疣阶段就出现p16缺失，而且基因的缺失类别与局灶性早期癌变以及原位癌一致。
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p16基因点突变是p16基因在某些肿瘤中失活的另一个主要机制，Reed等[1]在29例侵袭性原发性头颈部鳞癌中，只发现1例出现p16位点重排。Saunders等[3]发现原发性头颈部鳞癌p16基因有20%出现纯合性缺失，20%出现甲基化，但没有发现p16基因点突变。Chang等[4]研究了30例皮肤恶性肿瘤(其中有6例为鳞癌)，结果只有1例(非鳞癌)出现点突变。本实验所检测的标本均未发现p16基因点突变，提示尖锐湿疣及其癌变中可能无p16基因点突变机制参与，点突变是否尖锐湿疣及其癌变p16基因变异的主要机制，它与尖锐湿疣及其癌变的关系如何还有待进一步研究。
参 考 文 献
1，Reed AL, Califano J, Cairns P, et al. High frequency of p16(CDKN2/MTS- 1/INK4A) inactivation in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Res, 1996,56:3630- 3633.
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2，Wong YF, Chung TK, Cheung TH, et al. p16INK4 and p15INK4B alterations in primary gynecologic malignancy. Gynecol Oncol, 1997,65 :319- 324.
3，Saunders JR Jr. The genetic basis of head and neck carcinoma. Am J Surg,1997,174:459- 461.
4，Chang TG, Wang J, Chen LW, et al. Loss of expression of the p16 gene is frequent in malignant skin tumors. Biochem Biophys Res Commun, 1997, 230:85- 88.
(收 稿 日 期 ： 1999- 05- 31), 百拇医药