一种丝状真菌DNA提取方法的介绍
作者：陈官芝 刘维达
单位：210042南京，中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所
关键词：
中华皮肤科杂志000327
由曲霉、毛霉、镰刀菌、青霉等丝状真菌引起的人类感染日益多见。研究丝状真菌致病的分子机制以及进行临床快速基因诊断已成为热点。而这些工作的前提就是获取足量高质稳定的供分析用的DNA分子。丝状真菌的生长周期、菌丝形态、孢壁成分等均与酵母样真菌有相当差别，其DNA的提取有一定难度。我们经过反复摸索、比较，找出一个较为简便、经济、可靠的方法，现介绍如下。
一、菌种
烟曲霉(A1)、黑曲霉(A3)、岛青霉(B2)、色斑青霉(B6)、本色镰刀菌(B16)、串珠镰刀菌(B36)、多变毛霉(B3)和马内菲青霉(B33c)，均由中国微生物菌种保藏管理委员会医学真菌中心(中国医学科学院皮肤病研究所)提供。常规保藏，定期传种。
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二、DNA提取
方法1：将8种菌接种至马铃薯葡萄糖培养基(PDA)平皿上，置30℃温箱培养24h，然后移至室温继续培养至成熟(平均7～14d)。用含0.0125%吐温20的生理盐水10mL洗下孢子，4层无菌纱布过滤，菌孢子悬液离心，3500r/min,10min。孢子沉淀用SCE液(120mmol/L柠檬酸钠，1mol/L山梨醇，0.1mol/LEDTA)洗2次。用细胞计数板调整孢子浓度为1～5×107个/mL，取1mL移入1.5mLEp管中。离心后沉淀加裂解液Ⅰ(50mmol/LTris-HCl,pH7.5,10mmol/LEDTA,1%β-巯基乙醇，1%Novozym234)0.5mL，混匀，30℃孵育lh，离心，4000r/min。沉淀加裂解液Ⅱ(10%SDS,lmg/mL蛋白酶K)0.5mL混匀后置55℃水浴2h或过夜。将Ep管置冷冻离心机，4℃，12000r/min，离心10min，取上清液加等体积酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)，充分混匀。离心后取上清液置另管。重复抽提2～3次后加2倍体积无水乙醇，轻微晃动可见丝状或絮状物出现。若不满意则置-20℃2h至过夜。12000r/min，4℃离心沉淀DNA，70%乙醇漂洗，充分晾干后加20μLTE缓冲液溶解，放4℃冰箱备用。
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方法2：取保藏菌种PDA传种24h后，接种至20mL沙堡液基，置30℃恒温摇床160次/min振荡培养。约3～5d后可见培养液中有丰富的菌丝球。称取湿重为10mg的菌丝球置Ep管中，加裂解液Ⅰ，其余步骤同方法1。
三、PCR扩增及凝胶电泳
引物选自vanBurik等[1]推荐的来自rRNA高度保守序列的两对引物，由上海生工生物工程公司合成。在50μL反应总体积中，含5μL模板DNA，2UTag酶，200μmol/LdNTP,2×30pmol引物，1.5mmolMgCl。除模板外均为Promega公司产品。反应在Perkin-Elmer2400PCR扩增仪上进行。94℃，5min初始变性后进入循环：94℃30s、55℃30s、72℃60s，共35个循环，最后72℃延伸5min。取15μL扩增产物加入2%琼脂糖凝胶孔中。电泳缓冲液为0.5×TBE，电压100V，电流50mA,电泳2h。电泳后凝胶用EB染色，双蒸水脱色，在透射紫外灯下观察、照像。
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四、结果
方法1选用的真菌通用引物可将8种真菌的靶DNA扩增出一条580bp大小的条带(见图1)，只是黑曲霉的带较弱。方法2所用引物的扩增产物较小，平均大小为245bp，且大小随种属的不同而略有差异，但8种菌的DNA条带亮度基本一致，如图2所示。另外，方法2示RNA较多，但未影响扩增效果。
图1 通用引物1扩增8丝状真菌DNA电泳图谱
图2 通用引物2扩增8丝状真菌DNA电泳图谱
参 考 文 献
1，van Burik J A, Myerson D, Schreckhise RW,et al. Panfungal PCR assay for detection of fungal infection in human blood specimens. J Clin Miorobiol, 1998,36:1169- 1175.
(收 稿 日 期 ： 1999- 02- 04), http://www.100md.com
单位：210042南京，中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所
关键词：
中华皮肤科杂志000327
由曲霉、毛霉、镰刀菌、青霉等丝状真菌引起的人类感染日益多见。研究丝状真菌致病的分子机制以及进行临床快速基因诊断已成为热点。而这些工作的前提就是获取足量高质稳定的供分析用的DNA分子。丝状真菌的生长周期、菌丝形态、孢壁成分等均与酵母样真菌有相当差别，其DNA的提取有一定难度。我们经过反复摸索、比较，找出一个较为简便、经济、可靠的方法，现介绍如下。
一、菌种
烟曲霉(A1)、黑曲霉(A3)、岛青霉(B2)、色斑青霉(B6)、本色镰刀菌(B16)、串珠镰刀菌(B36)、多变毛霉(B3)和马内菲青霉(B33c)，均由中国微生物菌种保藏管理委员会医学真菌中心(中国医学科学院皮肤病研究所)提供。常规保藏，定期传种。
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二、DNA提取
方法1：将8种菌接种至马铃薯葡萄糖培养基(PDA)平皿上，置30℃温箱培养24h，然后移至室温继续培养至成熟(平均7～14d)。用含0.0125%吐温20的生理盐水10mL洗下孢子，4层无菌纱布过滤，菌孢子悬液离心，3500r/min,10min。孢子沉淀用SCE液(120mmol/L柠檬酸钠，1mol/L山梨醇，0.1mol/LEDTA)洗2次。用细胞计数板调整孢子浓度为1～5×107个/mL，取1mL移入1.5mLEp管中。离心后沉淀加裂解液Ⅰ(50mmol/LTris-HCl,pH7.5,10mmol/LEDTA,1%β-巯基乙醇，1%Novozym234)0.5mL，混匀，30℃孵育lh，离心，4000r/min。沉淀加裂解液Ⅱ(10%SDS,lmg/mL蛋白酶K)0.5mL混匀后置55℃水浴2h或过夜。将Ep管置冷冻离心机，4℃，12000r/min，离心10min，取上清液加等体积酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)，充分混匀。离心后取上清液置另管。重复抽提2～3次后加2倍体积无水乙醇，轻微晃动可见丝状或絮状物出现。若不满意则置-20℃2h至过夜。12000r/min，4℃离心沉淀DNA，70%乙醇漂洗，充分晾干后加20μLTE缓冲液溶解，放4℃冰箱备用。
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方法2：取保藏菌种PDA传种24h后，接种至20mL沙堡液基，置30℃恒温摇床160次/min振荡培养。约3～5d后可见培养液中有丰富的菌丝球。称取湿重为10mg的菌丝球置Ep管中，加裂解液Ⅰ，其余步骤同方法1。
三、PCR扩增及凝胶电泳
引物选自vanBurik等[1]推荐的来自rRNA高度保守序列的两对引物，由上海生工生物工程公司合成。在50μL反应总体积中，含5μL模板DNA，2UTag酶，200μmol/LdNTP,2×30pmol引物，1.5mmolMgCl。除模板外均为Promega公司产品。反应在Perkin-Elmer2400PCR扩增仪上进行。94℃，5min初始变性后进入循环：94℃30s、55℃30s、72℃60s，共35个循环，最后72℃延伸5min。取15μL扩增产物加入2%琼脂糖凝胶孔中。电泳缓冲液为0.5×TBE，电压100V，电流50mA,电泳2h。电泳后凝胶用EB染色，双蒸水脱色，在透射紫外灯下观察、照像。
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四、结果
方法1选用的真菌通用引物可将8种真菌的靶DNA扩增出一条580bp大小的条带(见图1)，只是黑曲霉的带较弱。方法2所用引物的扩增产物较小，平均大小为245bp，且大小随种属的不同而略有差异，但8种菌的DNA条带亮度基本一致，如图2所示。另外，方法2示RNA较多，但未影响扩增效果。
图1 通用引物1扩增8丝状真菌DNA电泳图谱
图2 通用引物2扩增8丝状真菌DNA电泳图谱
参 考 文 献
1，van Burik J A, Myerson D, Schreckhise RW,et al. Panfungal PCR assay for detection of fungal infection in human blood specimens. J Clin Miorobiol, 1998,36:1169- 1175.
(收 稿 日 期 ： 1999- 02- 04), http://www.100md.com