单纯疱疹病毒的聚合酶链反应——微孔板反向杂交检测和分型
作者：赖伟红 韩国柱 钟铭英 叶顺章
单位：210042南京，中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所
关键词：
中华皮肤科杂志000326
单纯疱疹病毒2型(HSV-2)和单纯疱疹病毒1型(HSV-1)引起的生殖器疱疹的预后不同[1]，检测HSV时有必要对其分型。目前，生殖器疱疹的实验室诊断“金标准”是HSV分离培养法，该法敏感性欠佳，费时费力。新近出现的PCR-ELISA及PCR-微孔板杂交法，将PCR、核酸杂交及酶联免疫技术结合起来，克服了传统方法的诸多弊端[2,3]。我们建立了HSV的PCR-微孔板反向杂交检测和分型方法，并初步评价其在生殖器标本HSV检测和分型中的应用价值。
一、材料与方法
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(一)材料：Vero细胞自中国科学院上海细胞生物研究所引进；HSV国际标准株：HSV-1Sam株自南京医科大学病毒室引进；HSV-2333株由本所药研室惠赠。HSV-1和HSV-2临床分离株各6株，均分离自本所门诊患者。与HSV同属人类疱疹病毒的巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)DNA及正常人DNA均由本室保存。FITC标记的HSV型特异性荧光单克隆抗体购自美国Biodesign公司。PCR引物和探针由中国科学院上海细胞生物研究所合成。89份生殖器标本来自1998年5～10月本所门诊中疑诊生殖器疱疹的患者。
(二)方法：
1.HSV分离培养及荧光单抗鉴定与分型：采用传统HSV分离培养法和直接免疫荧光法进行[4]。
2.HSV-DNA的PCR扩增：①在HSVDNA聚合酶基因保守序列区设计一对引物[5,6]，其中一条引物的5′端标记生物素。序列如下：引物1：5′-BiotinAAGGAGGCGCCCAAGCGTCCG-3′；引物2：5′-TGGGGTACAGGCTGGCAAAGT-3′。HSV-1和HSV-2DNA扩增片段长度分别为229bp和241bp。②用蛋白酶K裂解液处理标本，抽提DNA。③PCR条件：50μL反应体积，反应体系组成：Taq酶1.25U,dATP、dTTP、dCTP、dGTP各0.2mmol/L，引物各1μmol/L，KCl50mmol/L,Tris·Cl(pH9.0)10mmol/L，0.1%(v/v)TritonX-100,MgCl21.5mmol/L，模板5μL。热循环参数为95℃变性1min，55℃复性1min，72℃延伸1min，共35个循环，最后一循环延伸10min。
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3.PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测：取PCR产物10μL上样，以含0.5μg/mL溴乙锭(EB)的2.5%琼脂糖凝胶进行电泳，电压5V/cm，电泳1h后在紫外灯下观察和判断结果。
4.PCR产物的微孔板反向杂交及酶显色检测：
(1)在引物设计基础上，设计HSV型特异性探针[5,6]。序列如下：探针1(HSV-1)：5′-TTTCCCTCCTCGCGTTCGTCCTCG-3′,探针2(HSV-2)：5′-ATTCCGTCCTCGTCGTCGTCCTTATCC-3′。
(2)探针包被：用新鲜配制的1mol/L醋酸铵溶液制备两型探针液，含量均为200ng/50μL；取两型探针液各50μL分别加入96孔微孔板的微孔中；将微孔板置37℃真空抽吸干燥器中干燥，时间大约6h；干燥后密封，4℃贮存备用，或立即用于微孔板反向杂交检测，用前2×SSC洗去未被包被的探针。
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(3)微孔板反向杂交：取PCR产物20μL，95℃热变性5min后立即置冰浴中10min，再加入预冷的杂交液(10%甲酰胺，6×SSC，1%TritonX-100,1%BSA,2×Denhardt液)180μL，混匀；取100μL混合液分别加入包被了两型探针的微孔中，55℃杂交2h；室温下，2×SSC洗板2次，然后1×SSC洗板2次。
(4)酶显色反应与检测：每孔加入0.01mol/LPBS-1%BSA1∶1000稀释的辣根过氧化物酶标记的亲和素100μL，37℃作用1h；室温下，PBS-0.05%吐温20洗板5次；每孔加入100μLOPD底物液[OPD2mg，磷酸盐-柠檬酸缓冲液(pH5.0)5mL,30%H2O215μL，三蒸水加至10mL，新鲜配制]，37℃作用20min；每孔加入1mol/LH2SO4100μL以终止反应；在酶标仪(紫外线波长为492nm)下读取吸光度值(A值)。
二、结果
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1.PCR产物的微孔板反向杂交法阳性阈值(cutoff值)的确定：取20份HSV分离培养和型特异性PCR[7]均阴性的标本，作PCR产物的微孔板杂交，计算A值的均值(x)和标准差(s)，阳性阈值为x+3s。与HSV-1探针和HSV-2探针杂交后的
±s均为0.06±0.02。阳性阈值为0.12。
2.敏感性试验：将HSV-1Sam株和HSV-2333株培养液(培养液病毒滴度分别为3.5×106pfu/mL和6.4×106pfu/mL)连续10倍稀释，进行同条件下的PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、PCR产物的杂交及显色反应。电泳法可检测到3.5pfu/mL的HSV-1和0.64pfu/mL的HSV-2，而杂交法可检测到0.35pfu/mLHSV-1和6.4×10-3pfu/mLHSV-2，杂交法的敏感性是电泳法的10～100倍。
3.特异性试验：对HSV-1Sam株、HSV-2333株、HSV-1和HSV-2临床分离株、CMV、EBV、VZVDNA及人类DNA进行扩增和杂交，除HSV毒株的结果呈阳性外，其它疱疹病毒DNA及人类DNA的结果均阴性。PCR-微孔板反向杂交法分型与荧光单抗分型结果一致。
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4.重复性试验：用HSV-1Sam株和HSV-2333株(103pfu/mL)的PCR产物，重复作微孔板杂交10次，HSV-1和HSV-2的A值变异系数分别为7.33%和6.47%。
5.对89份生殖器标本的检测结果：89份生殖器标本中，分离培养法36份(40.4%)阳性，PCR-电泳法40份(44.9%)阳性，而PCR-微孔板杂交法47份(52.8%)阳性。分离培养阳性者，PCR-电泳法和PCR-微孔板反向杂交法均阳性；7份PCR-微孔板杂交法阳性者(1份HSV-1、6份HSV-2)，PCR-电泳法阴性；11份PCR-微孔板杂交法阳性者(1份HSV-1、10份HSV-2)，分离培养阴性。PCR-微孔板杂交法分型与分离培养及荧光单抗分型结果相符，但有1份HSV-1和HSV-2混合感染者，PCR-电泳法仅HSV-1阳性。
三、讨论
微孔板反向杂交法的关键在于探针包被。我们采用HSV型特异性寡聚核苷酸探针，通过1mol/L醋酸铵溶液在37℃真空环境中包被到微孔中，该方法简便易行，包被了探针的微孔板可于4℃保存2个月以上[8,9]。另外，我们对传统的杂交方法作了改进，省略了预杂交及大分子量DNA封闭过程，缩短了杂交时间。
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从对HSV标准株和临床分离株的检测来看，对于HSV-1和HSV-2，PCR-微孔板反向杂交法的敏感性较PCR-琼脂糖凝胶电泳法分别提高10倍和100倍，分型结果与荧光单克隆抗体分型结果相符，HSV型间未见明显交叉反应。从对89份生殖器标本的HSV检测结果来看，PCR-微孔板反向杂交法的敏感性较HSV分离培养法和PCR-电泳法均高，且分型准确。我们所用PCR对HSV-1和HSV-2DNA扩增片段长度仅相差12bp，需用高浓度(2.5%以上)琼脂糖凝胶电泳1h以上才能分型，且难以区分HSV-1和HSV-2混合感染。当采用杂交法时，结果判断较容易。
我们认为，PCR-微孔板反向杂交法可敏感、特异、客观地检测生殖器标本中的HSV，并能对HSV进行分型。我们的方法也存在待完善之处：①两型HSV的PCR产物作琼脂糖凝胶电泳EB染色时条带亮度相似，但杂交法时A值相差较远，如HSV-1和HSV-2同一模板量(104pfu/mL)时杂交法A值分别为0.42和0.68，可能是由于两型HSV探针长度不同而导致了杂交检测的敏感性不同。②未设立内参照，这是反应体系内部质控的重要指标，从中可看出扩增和杂交是否成功。③在酶联免疫检测时，我们采用辣根过氧化物酶标记的亲和素，而未用敏感性和特异性更高的碱性磷酸酶标记的链霉亲和素。为了进一步评价PCR-微孔板反向杂交法的应用价值，应作更大样本量的HSV检测，并在HSV的定量或半定量检测方面作深入研究。
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参 考 文 献
1，Pereira FA. Herpes simplex: evolving concepts. J Am Acad Dermatol, 1996,35:503- 520.
2，Vesanen M, Piiparinen H, Kallio A, et al. Detection of herpes simplex virus DNA in cerebrospinal fluid samples using the polymerase chain reaction and microplate hybridization. J Virol Methods, 1996,59:1- 11.
3，魏军，张正.聚合酶链反应产物微孔板杂交技术.中华医学检验杂志，1997，20：252-254.
4，叶顺章，张木有主编.性传播疾病诊断手册.广州：广东科技出版社，1991.100-108.
, http://www.100md.com
5，Piiparinen H, Vaheri A. Genotyping of herpes simplex viruses by polymerase chain reaction. Arch Virol, 1991,119:275- 283.
6，Safrin S, Shaw H, Bolan G, et al. Comparison of virus culture and the polymerase chain reaction for diagnosis of mucocutaneous herpes simplex virus infection. Sex Transm Dis, 1997,24:176- 180.
7，Kimura H, Shibata M, Kuzushima K, et al. Detection and direct typing of herpes simplex virus by polymerase chain reaction. Med Microbiol Immunol, 1990,179:177- 184.
, 百拇医药
8，Shindo M, Di Bisceglie AM, Silver J, et al. Detection and quantitation of hepatitis C virus RNA in serum using the polymerase chain reaction and a colorimetric enzymatic detection system. J Virol Methods, 1994,48:65- 72.
9，Peeling RW, Sparling PF. Sexually transmitted diseases: methods and protocols. New Jersey: Humana, 1999.71- 79.
(收 稿 日 期 :1999- 07- 12), http://www.100md.com
单位：210042南京，中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所
关键词：
中华皮肤科杂志000326
单纯疱疹病毒2型(HSV-2)和单纯疱疹病毒1型(HSV-1)引起的生殖器疱疹的预后不同[1]，检测HSV时有必要对其分型。目前，生殖器疱疹的实验室诊断“金标准”是HSV分离培养法，该法敏感性欠佳，费时费力。新近出现的PCR-ELISA及PCR-微孔板杂交法，将PCR、核酸杂交及酶联免疫技术结合起来，克服了传统方法的诸多弊端[2,3]。我们建立了HSV的PCR-微孔板反向杂交检测和分型方法，并初步评价其在生殖器标本HSV检测和分型中的应用价值。
一、材料与方法
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(一)材料：Vero细胞自中国科学院上海细胞生物研究所引进；HSV国际标准株：HSV-1Sam株自南京医科大学病毒室引进；HSV-2333株由本所药研室惠赠。HSV-1和HSV-2临床分离株各6株，均分离自本所门诊患者。与HSV同属人类疱疹病毒的巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)DNA及正常人DNA均由本室保存。FITC标记的HSV型特异性荧光单克隆抗体购自美国Biodesign公司。PCR引物和探针由中国科学院上海细胞生物研究所合成。89份生殖器标本来自1998年5～10月本所门诊中疑诊生殖器疱疹的患者。
(二)方法：
1.HSV分离培养及荧光单抗鉴定与分型：采用传统HSV分离培养法和直接免疫荧光法进行[4]。
2.HSV-DNA的PCR扩增：①在HSVDNA聚合酶基因保守序列区设计一对引物[5,6]，其中一条引物的5′端标记生物素。序列如下：引物1：5′-BiotinAAGGAGGCGCCCAAGCGTCCG-3′；引物2：5′-TGGGGTACAGGCTGGCAAAGT-3′。HSV-1和HSV-2DNA扩增片段长度分别为229bp和241bp。②用蛋白酶K裂解液处理标本，抽提DNA。③PCR条件：50μL反应体积，反应体系组成：Taq酶1.25U,dATP、dTTP、dCTP、dGTP各0.2mmol/L，引物各1μmol/L，KCl50mmol/L,Tris·Cl(pH9.0)10mmol/L，0.1%(v/v)TritonX-100,MgCl21.5mmol/L，模板5μL。热循环参数为95℃变性1min，55℃复性1min，72℃延伸1min，共35个循环，最后一循环延伸10min。
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3.PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测：取PCR产物10μL上样，以含0.5μg/mL溴乙锭(EB)的2.5%琼脂糖凝胶进行电泳，电压5V/cm，电泳1h后在紫外灯下观察和判断结果。
4.PCR产物的微孔板反向杂交及酶显色检测：
(1)在引物设计基础上，设计HSV型特异性探针[5,6]。序列如下：探针1(HSV-1)：5′-TTTCCCTCCTCGCGTTCGTCCTCG-3′,探针2(HSV-2)：5′-ATTCCGTCCTCGTCGTCGTCCTTATCC-3′。
(2)探针包被：用新鲜配制的1mol/L醋酸铵溶液制备两型探针液，含量均为200ng/50μL；取两型探针液各50μL分别加入96孔微孔板的微孔中；将微孔板置37℃真空抽吸干燥器中干燥，时间大约6h；干燥后密封，4℃贮存备用，或立即用于微孔板反向杂交检测，用前2×SSC洗去未被包被的探针。
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(3)微孔板反向杂交：取PCR产物20μL，95℃热变性5min后立即置冰浴中10min，再加入预冷的杂交液(10%甲酰胺，6×SSC，1%TritonX-100,1%BSA,2×Denhardt液)180μL，混匀；取100μL混合液分别加入包被了两型探针的微孔中，55℃杂交2h；室温下，2×SSC洗板2次，然后1×SSC洗板2次。
(4)酶显色反应与检测：每孔加入0.01mol/LPBS-1%BSA1∶1000稀释的辣根过氧化物酶标记的亲和素100μL，37℃作用1h；室温下，PBS-0.05%吐温20洗板5次；每孔加入100μLOPD底物液[OPD2mg，磷酸盐-柠檬酸缓冲液(pH5.0)5mL,30%H2O215μL，三蒸水加至10mL，新鲜配制]，37℃作用20min；每孔加入1mol/LH2SO4100μL以终止反应；在酶标仪(紫外线波长为492nm)下读取吸光度值(A值)。
二、结果
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1.PCR产物的微孔板反向杂交法阳性阈值(cutoff值)的确定：取20份HSV分离培养和型特异性PCR[7]均阴性的标本，作PCR产物的微孔板杂交，计算A值的均值(x)和标准差(s)，阳性阈值为x+3s。与HSV-1探针和HSV-2探针杂交后的
±s均为0.06±0.02。阳性阈值为0.12。2.敏感性试验：将HSV-1Sam株和HSV-2333株培养液(培养液病毒滴度分别为3.5×106pfu/mL和6.4×106pfu/mL)连续10倍稀释，进行同条件下的PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、PCR产物的杂交及显色反应。电泳法可检测到3.5pfu/mL的HSV-1和0.64pfu/mL的HSV-2，而杂交法可检测到0.35pfu/mLHSV-1和6.4×10-3pfu/mLHSV-2，杂交法的敏感性是电泳法的10～100倍。
3.特异性试验：对HSV-1Sam株、HSV-2333株、HSV-1和HSV-2临床分离株、CMV、EBV、VZVDNA及人类DNA进行扩增和杂交，除HSV毒株的结果呈阳性外，其它疱疹病毒DNA及人类DNA的结果均阴性。PCR-微孔板反向杂交法分型与荧光单抗分型结果一致。
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4.重复性试验：用HSV-1Sam株和HSV-2333株(103pfu/mL)的PCR产物，重复作微孔板杂交10次，HSV-1和HSV-2的A值变异系数分别为7.33%和6.47%。
5.对89份生殖器标本的检测结果：89份生殖器标本中，分离培养法36份(40.4%)阳性，PCR-电泳法40份(44.9%)阳性，而PCR-微孔板杂交法47份(52.8%)阳性。分离培养阳性者，PCR-电泳法和PCR-微孔板反向杂交法均阳性；7份PCR-微孔板杂交法阳性者(1份HSV-1、6份HSV-2)，PCR-电泳法阴性；11份PCR-微孔板杂交法阳性者(1份HSV-1、10份HSV-2)，分离培养阴性。PCR-微孔板杂交法分型与分离培养及荧光单抗分型结果相符，但有1份HSV-1和HSV-2混合感染者，PCR-电泳法仅HSV-1阳性。
三、讨论
微孔板反向杂交法的关键在于探针包被。我们采用HSV型特异性寡聚核苷酸探针，通过1mol/L醋酸铵溶液在37℃真空环境中包被到微孔中，该方法简便易行，包被了探针的微孔板可于4℃保存2个月以上[8,9]。另外，我们对传统的杂交方法作了改进，省略了预杂交及大分子量DNA封闭过程，缩短了杂交时间。
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从对HSV标准株和临床分离株的检测来看，对于HSV-1和HSV-2，PCR-微孔板反向杂交法的敏感性较PCR-琼脂糖凝胶电泳法分别提高10倍和100倍，分型结果与荧光单克隆抗体分型结果相符，HSV型间未见明显交叉反应。从对89份生殖器标本的HSV检测结果来看，PCR-微孔板反向杂交法的敏感性较HSV分离培养法和PCR-电泳法均高，且分型准确。我们所用PCR对HSV-1和HSV-2DNA扩增片段长度仅相差12bp，需用高浓度(2.5%以上)琼脂糖凝胶电泳1h以上才能分型，且难以区分HSV-1和HSV-2混合感染。当采用杂交法时，结果判断较容易。
我们认为，PCR-微孔板反向杂交法可敏感、特异、客观地检测生殖器标本中的HSV，并能对HSV进行分型。我们的方法也存在待完善之处：①两型HSV的PCR产物作琼脂糖凝胶电泳EB染色时条带亮度相似，但杂交法时A值相差较远，如HSV-1和HSV-2同一模板量(104pfu/mL)时杂交法A值分别为0.42和0.68，可能是由于两型HSV探针长度不同而导致了杂交检测的敏感性不同。②未设立内参照，这是反应体系内部质控的重要指标，从中可看出扩增和杂交是否成功。③在酶联免疫检测时，我们采用辣根过氧化物酶标记的亲和素，而未用敏感性和特异性更高的碱性磷酸酶标记的链霉亲和素。为了进一步评价PCR-微孔板反向杂交法的应用价值，应作更大样本量的HSV检测，并在HSV的定量或半定量检测方面作深入研究。
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参 考 文 献
1，Pereira FA. Herpes simplex: evolving concepts. J Am Acad Dermatol, 1996,35:503- 520.
2，Vesanen M, Piiparinen H, Kallio A, et al. Detection of herpes simplex virus DNA in cerebrospinal fluid samples using the polymerase chain reaction and microplate hybridization. J Virol Methods, 1996,59:1- 11.
3，魏军，张正.聚合酶链反应产物微孔板杂交技术.中华医学检验杂志，1997，20：252-254.
4，叶顺章，张木有主编.性传播疾病诊断手册.广州：广东科技出版社，1991.100-108.
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5，Piiparinen H, Vaheri A. Genotyping of herpes simplex viruses by polymerase chain reaction. Arch Virol, 1991,119:275- 283.
6，Safrin S, Shaw H, Bolan G, et al. Comparison of virus culture and the polymerase chain reaction for diagnosis of mucocutaneous herpes simplex virus infection. Sex Transm Dis, 1997,24:176- 180.
7，Kimura H, Shibata M, Kuzushima K, et al. Detection and direct typing of herpes simplex virus by polymerase chain reaction. Med Microbiol Immunol, 1990,179:177- 184.
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8，Shindo M, Di Bisceglie AM, Silver J, et al. Detection and quantitation of hepatitis C virus RNA in serum using the polymerase chain reaction and a colorimetric enzymatic detection system. J Virol Methods, 1994,48:65- 72.
9，Peeling RW, Sparling PF. Sexually transmitted diseases: methods and protocols. New Jersey: Humana, 1999.71- 79.
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