性病患者泌尿生殖道沙眼衣原体感染和基因分型研究
作者：杨文林 宁波 杨健
单位：510260广州医学院第二附属医院皮肤科
关键词：
中华皮肤科杂志000321
为了解性病患者生殖道沙眼衣原体(Ct)感染的血清型及其对性伴的传染，我们对Ct抗原快速免疫检测阳性的泌尿生殖道标本，用PCR技术扩增Ct的主要外膜蛋白MOMP，并用MOMP限制性内切酶片段多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)分析法，对Ct进行分型。
一、材料和方法
(一)标本收集：对我院1998年1～10月性病门诊疑为非淋菌性尿道炎(表现有尿道刺痒、刺痛，尿频，尿道口有少量粘液性分泌物或晨起尿道口有痂膜封口等症状)和粘液脓性宫颈炎(表现有白带增多，子宫颈水肿或糜烂)及部分无症状患者(主要为衣原体阳性患者的性伴)泌尿生殖道标本，用英国Oxoid公司生产的衣原体抗原快速免疫法检测Ct，其阳性标本留作PCR检测。共收集Ct阳性标本100份，其中男67例，年龄19～61岁，平均29.2岁；女33例，年龄20～46岁，平均26.6岁。病程1周至2年。部分患者泌尿生殖道的症状反复发作。
, 百拇医药
(二)MOMP基因PCR检测：
1.引物：根据沙眼衣原体L2血清型MOMP基因序列设计2对引物，由上海生物工程有限公司合成。引物序列为：引物对1：CtMOMP1：5′-ATGAAAAAACTCTTGAAATCGG-3′；CtMOMP2：5′-ATTTTCTAGACTTCATTTTGTT-3′。扩增片段约1.2kb，为MOMP基因全序列片段。当引物对1扩增产物太少，不足以进行酶切分析时，则再用MOMP基因内套式引物对扩增。引物对2：CtMOMP3：5′-GGGAATCCTGCTGCTGAACCAAG-3′；CtMOMP4：5′-AATTGCAAGGAAACGATTTG-3′。扩增片段约0.97kb。
2.PCR：PCR步骤参照文献[1]进行，反应完毕取5μL产物用0.9%琼脂糖凝胶电泳。紫外灯观察如有预期1.2kb或0.97kb大小片段，则进一步酶切分析。
(三)MOMP基因限制性内切酶片段多态性分析：取PCR产物8μL，10×酶切缓冲液1μL，AluⅠ5U，37℃消化1h。65℃水浴10min终止反应。酶切产物于12.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染观察结果。
, 百拇医药
二、结果
衣原体抗原快速免疫法检测出的100例Ct阳性标本，用PCR检测有49份为阳性，对其进行基因分型，参照有关文献[1]标准读取基因分型结果。49份阳性标本中，E型24份，F型11份，G型5份，D型4份，有4份未进一步分型(主要包括C、H、I、J型)，混合型(D/F)1份。
三、讨论
我们通过Ct抗原快速免疫法检测出的100份阳性标本，用Ct的MOMP基因PCR检测出阳性49例，阳性率为49%，阳性率较低。因MOMP基因在衣原体颗粒中只有一个拷贝，加之扩增片段较长，敏感性较低。另外，可能与部分标本存放时间过长，或标本量太少等有关。此外，Taq酶抑制物亦可影响PCR扩增[2]。用MOMP-RFLP分型技术对49株标本进行分型的结果与有关报道[3]相似。我们发现：E型最多，占50.0%；其次是F型，占22.4%；G型占10.2%，D型占8.2%，还发现1株D/F混合型，占2.0%。关于混合感染率报道[4,5]高低不等。Lan等[1]发现性病门诊患者宫颈标本衣原体分型以D、E、和F血清型最多见。说明不同地域Ct的流行优势型别不尽相同。
, http://www.100md.com
在我们发现的24株E型中，女性占16株，可能与部分患者症状不明显，较少用药而菌量较多，检出率较高有关。3例患者因症状反复发作，先后分别作了2次检测，3例中1例先后2次分型一致，自诉患病后无性接触史，提示治疗失败；1例先后2次分型不同，第1次为E型，第2次为F型，提示再感染；1例第1次为D型，第2次为混合型(D/F)，后2例为卖淫女，有多个性伴，接触各种型别衣原体的机会多。49例阳性病例中，有3对夫妻，其中2对的分型一致，分别为E型和F型；1对分型不同，一个为D型，一个为G型，说明少数性伴中具不同血清型感染。文献报道[6，7]认为衣原体感染的型别与临床表现相关，而我们的结果显示，患者的年龄、症状、病程与Ct分型无明显相关。
由于Ct感染无特异性，临床上很难确诊。以往的细胞培养法操作繁琐，灵敏度低，难以推广。应用基于PCR的RFLP法做Ct分型，精确度高于细胞培养的血清分型，且分辨力强，而且简单易做，应可作为确定Ct早期感染的可靠方法，但由于需累积一定的标本才进行检测，又因本法能鉴定不同的血清型和混合感染，对临床上症状反复发作和久治不愈的患者，可区分究竟是治疗失败还是再感染，并可追踪传染来源，故用于流行病学研究更有价值。
, 百拇医药
参 考 文 献
1，Lan J, Walboomers JMM, Roosendaal R, et al. Direct detection and genotying of Chlamydia trachomatis in cervical scrapes by using PCR and restriction fragment length polymorphism analysis. J Clin Microbiol, 1993,31:1060- 1065.
2，StephenAM.同性病实验室诊断的新进展.见叶干运,主编.性传播疾病诊疗与预防.广州:广东科技出版社,1996.48-67.
3，王千秋,叶顺章,钟铭英,等.沙眼衣原体的基因分型及其临床意义.中华皮肤科杂志,1998,31:156-159.
, 百拇医药 4，Barnes RC, Suchland RJ, Wang SP, et al. Detection of multiple serovar of Chlamydia trachomatis in genital infection. J Infect Dis, 1985, 152: 985- 989.
5，Gaydos CH, Bobo L,Welsh L, et al. Gene typing of Chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction and restriction endonuclease digestion. Sex Transm Dis, 1992, 19: 303- 308.
6，Starmm WE, Stevens CE, Suchland RJ, et al. Association of infecting serovar with clinical manifestation in Chlamydia trachomatis genital infection in women. In: Bowie WR,eds. Chlamydial infections. Cambridge: Cambridge University Press, 1990.303- 306.
7，Lan J, Melgers I, Meijer CJ, et al. Prevalence and serovar distribution of asymptomatic cervical Chlamydia trachomatis infections as determined by highly sensitive PCR. J Clin Microbiol, 1995, 33: 3194- 3197.
(收 稿 日 期 ： 1999- 06- 21), 百拇医药
单位：510260广州医学院第二附属医院皮肤科
关键词：
中华皮肤科杂志000321
为了解性病患者生殖道沙眼衣原体(Ct)感染的血清型及其对性伴的传染，我们对Ct抗原快速免疫检测阳性的泌尿生殖道标本，用PCR技术扩增Ct的主要外膜蛋白MOMP，并用MOMP限制性内切酶片段多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)分析法，对Ct进行分型。
一、材料和方法
(一)标本收集：对我院1998年1～10月性病门诊疑为非淋菌性尿道炎(表现有尿道刺痒、刺痛，尿频，尿道口有少量粘液性分泌物或晨起尿道口有痂膜封口等症状)和粘液脓性宫颈炎(表现有白带增多，子宫颈水肿或糜烂)及部分无症状患者(主要为衣原体阳性患者的性伴)泌尿生殖道标本，用英国Oxoid公司生产的衣原体抗原快速免疫法检测Ct，其阳性标本留作PCR检测。共收集Ct阳性标本100份，其中男67例，年龄19～61岁，平均29.2岁；女33例，年龄20～46岁，平均26.6岁。病程1周至2年。部分患者泌尿生殖道的症状反复发作。
, 百拇医药
(二)MOMP基因PCR检测：
1.引物：根据沙眼衣原体L2血清型MOMP基因序列设计2对引物，由上海生物工程有限公司合成。引物序列为：引物对1：CtMOMP1：5′-ATGAAAAAACTCTTGAAATCGG-3′；CtMOMP2：5′-ATTTTCTAGACTTCATTTTGTT-3′。扩增片段约1.2kb，为MOMP基因全序列片段。当引物对1扩增产物太少，不足以进行酶切分析时，则再用MOMP基因内套式引物对扩增。引物对2：CtMOMP3：5′-GGGAATCCTGCTGCTGAACCAAG-3′；CtMOMP4：5′-AATTGCAAGGAAACGATTTG-3′。扩增片段约0.97kb。
2.PCR：PCR步骤参照文献[1]进行，反应完毕取5μL产物用0.9%琼脂糖凝胶电泳。紫外灯观察如有预期1.2kb或0.97kb大小片段，则进一步酶切分析。
(三)MOMP基因限制性内切酶片段多态性分析：取PCR产物8μL，10×酶切缓冲液1μL，AluⅠ5U，37℃消化1h。65℃水浴10min终止反应。酶切产物于12.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染观察结果。
, 百拇医药
二、结果
衣原体抗原快速免疫法检测出的100例Ct阳性标本，用PCR检测有49份为阳性，对其进行基因分型，参照有关文献[1]标准读取基因分型结果。49份阳性标本中，E型24份，F型11份，G型5份，D型4份，有4份未进一步分型(主要包括C、H、I、J型)，混合型(D/F)1份。
三、讨论
我们通过Ct抗原快速免疫法检测出的100份阳性标本，用Ct的MOMP基因PCR检测出阳性49例，阳性率为49%，阳性率较低。因MOMP基因在衣原体颗粒中只有一个拷贝，加之扩增片段较长，敏感性较低。另外，可能与部分标本存放时间过长，或标本量太少等有关。此外，Taq酶抑制物亦可影响PCR扩增[2]。用MOMP-RFLP分型技术对49株标本进行分型的结果与有关报道[3]相似。我们发现：E型最多，占50.0%；其次是F型，占22.4%；G型占10.2%，D型占8.2%，还发现1株D/F混合型，占2.0%。关于混合感染率报道[4,5]高低不等。Lan等[1]发现性病门诊患者宫颈标本衣原体分型以D、E、和F血清型最多见。说明不同地域Ct的流行优势型别不尽相同。
, http://www.100md.com
在我们发现的24株E型中，女性占16株，可能与部分患者症状不明显，较少用药而菌量较多，检出率较高有关。3例患者因症状反复发作，先后分别作了2次检测，3例中1例先后2次分型一致，自诉患病后无性接触史，提示治疗失败；1例先后2次分型不同，第1次为E型，第2次为F型，提示再感染；1例第1次为D型，第2次为混合型(D/F)，后2例为卖淫女，有多个性伴，接触各种型别衣原体的机会多。49例阳性病例中，有3对夫妻，其中2对的分型一致，分别为E型和F型；1对分型不同，一个为D型，一个为G型，说明少数性伴中具不同血清型感染。文献报道[6，7]认为衣原体感染的型别与临床表现相关，而我们的结果显示，患者的年龄、症状、病程与Ct分型无明显相关。
由于Ct感染无特异性，临床上很难确诊。以往的细胞培养法操作繁琐，灵敏度低，难以推广。应用基于PCR的RFLP法做Ct分型，精确度高于细胞培养的血清分型，且分辨力强，而且简单易做，应可作为确定Ct早期感染的可靠方法，但由于需累积一定的标本才进行检测，又因本法能鉴定不同的血清型和混合感染，对临床上症状反复发作和久治不愈的患者，可区分究竟是治疗失败还是再感染，并可追踪传染来源，故用于流行病学研究更有价值。
, 百拇医药
参 考 文 献
1，Lan J, Walboomers JMM, Roosendaal R, et al. Direct detection and genotying of Chlamydia trachomatis in cervical scrapes by using PCR and restriction fragment length polymorphism analysis. J Clin Microbiol, 1993,31:1060- 1065.
2，StephenAM.同性病实验室诊断的新进展.见叶干运,主编.性传播疾病诊疗与预防.广州:广东科技出版社,1996.48-67.
3，王千秋,叶顺章,钟铭英,等.沙眼衣原体的基因分型及其临床意义.中华皮肤科杂志,1998,31:156-159.
, 百拇医药 4，Barnes RC, Suchland RJ, Wang SP, et al. Detection of multiple serovar of Chlamydia trachomatis in genital infection. J Infect Dis, 1985, 152: 985- 989.
5，Gaydos CH, Bobo L,Welsh L, et al. Gene typing of Chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction and restriction endonuclease digestion. Sex Transm Dis, 1992, 19: 303- 308.
6，Starmm WE, Stevens CE, Suchland RJ, et al. Association of infecting serovar with clinical manifestation in Chlamydia trachomatis genital infection in women. In: Bowie WR,eds. Chlamydial infections. Cambridge: Cambridge University Press, 1990.303- 306.
7，Lan J, Melgers I, Meijer CJ, et al. Prevalence and serovar distribution of asymptomatic cervical Chlamydia trachomatis infections as determined by highly sensitive PCR. J Clin Microbiol, 1995, 33: 3194- 3197.
(收 稿 日 期 ： 1999- 06- 21), 百拇医药