线性IgA大疱病基底膜带自身抗体的靶抗原异质性
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中华皮肤科杂志 2000年第5期第33卷
作者：张学军 王再兴 杨森 王培光
单位：230022合肥，安徽医科大学第一附属医院皮肤科
关键词：线性IgA大疱病；印迹法；蛋白质
中华皮肤科杂志000514
【摘要】目的了解线性IgA大疱病基底膜带自身抗体(BMZ-Ab)靶抗原及其与其它表皮下自身免疫性大疱病相关抗原的关系。方法用热分离法提取真表皮抗原，免疫印迹检测11例线性IgA大疱病中IgA型和IgG型BMZ-Ab靶抗原的分布情况。结果11例线性IgA大疱病患者中9例血清中IgA型BMZ-Ab可分别与真、表皮抗原结合，其中7例结合97000表皮抗原(LABD97)，2例同时结合180000抗原，另有2例成人型线性IgA大疱病分别结合180000或230000表皮抗原。5例IgG型BMZ-Ab结合表皮97000、145000、180000、230000抗原，未见与真皮抗原发生反应。结论线性IgA大疱病中BMZ-Ab的靶抗原表现为异质性，除LABD97以外，还可以是BP180、BP230等大疱性类天疱疮(BP)相关抗原。LABD97可能是BP180分子的降解产物，线性IgA大疱病是否是一种独立疾病应深入研究。
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Heterogeneity of Target Antigens of Basal Membrane Zone Antibodies in Linear IgA Bullous Dermatosis
ZHANG Xuejun，WANG Zaixing，YANG Sen，et al.
(Dermatology of Department, First Affiliated Hospital, Anhui Medical University, Hefei 230022)
【Abstract】 Objective To detect the target antigens of basal membrane zone antibodies (BMZ- Ab) in linear IgA bullous dermatosis (LABD). Methods Dermal and epidermal antigens were extracted by heat- separated procedure, then the target antigens of BMZ- Abs in 11 LABD sera were detected. Results The IgA BMZ- Abs in 9/11 LABD sera could reacted with dermal and epidermal antigens respectively. 7/11 LABD sera reacted with 97 000 epidermal antigen (LABD 97), 2 sera reacted with 180 000 epidermal antigen simultaneously. 2 adult LABD sera recognized 180 000 and 230 000 epidermal antigen respectively. IgG BMZ- Ab in 5/11 LABD sera reacted with 97 000, 145 000, 180 000, 230 000 epidermal antigens, and did not react with dermal antigens. Conclusions The target antigens of IgA BMZ- Abs in LABD were heterogeneous including LABD 97, BP 180 and BP 230. LABD 97 may be a degraded fragment of BP 180. Whether LABD is an independent entity or not should be further investigated.
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【Key words】 Linear IgA bullous dermatosis Blotting, Western
线性IgA大疱病(LABD)是一种以粘膜和皮肤基底膜带(BMZ)IgA型自身抗体线状沉积为特征的自身免疫性表皮下大疱病(SABD)。根据发病年龄不同分为成人LABD和儿童慢性大疱性皮肤病(CBDC)两种。免疫印迹(IB)结果显示其靶抗原呈现明显的异质性，以97000表、真皮抗原(LABD97)检出率最高，也可以是真皮255000[1]、285000[2]抗原，近来有人表明大疱性类天疱疮(BP)、获得性大疱性表皮松解症(EBA)的特征性靶抗原BP180、BP230[3]和290000Ⅶ型胶原[4]也可被LABD血清识别。我们曾报道LABDIgA型BMZ-Ab可识别多种BMZ抗原成分[5]，为进一步阐明LABD靶抗原的特性及其与其它SABD相关抗原的关系，我们采用IB法检测11例LABD患者血清中IgA型和IgG型BMZ-Ab识别的靶抗原。
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材料与方法
1.病例选择：11例LABD，其中成人型LABD8例，儿童型CBDC3例，皆为我科近年来收住院的患者，经临床、普通病理和免疫病理检查后确诊。按现行的诊断标准，直接免疫荧光(DIF)仅有IgA型Ab沉积于皮肤BMZ或间接免疫荧光(IIF)仅检出IgA型循环BMZ抗体确定为LABD。平均年龄(28±17.6)岁，最大47岁，最小2岁。同时选取我科收住院的3例BP、2例EBA患者和3例正常人作对照。
2.方法：热分离法[6]分离真、表皮，取真、表皮抗原提取物经SDS-PAGE和转移电泳，将抗原转印至NC膜上，3%BSA封闭5h。加入1∶10稀释的待检血清反应4h，血清稀释液(50mmol/LTris-HCl，pH7.4，含0.5mol/LNaCl，0.5%BSA，0.3%吐温20)漂洗10min×3次，加入1∶400稀释的HRP标记的兔抗人IgA或IgG抗体(Sigma产品)反应1h。血清稀释液漂洗10min×3次，加入DAB显色。与标准蛋白对照，计算阳性条带分子量大小。
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图1LABD血清中IgA型BMZ-Ab与表皮抗原结合
图2LABD血清中IgG型BMZ-Ab与表皮抗原结合
结果
11例LABD患者中9例血清中IgA型BMZ-Ab可与真、表皮抗原结合，其中7例结合97000表皮抗原，2例同时结合180000抗原，另有2例成人型LABD分别单独结合180000或230000表皮抗原。4例结合97000真皮抗原，未见与其它分子量的真表皮抗原结合(图1)。5例IgG型BMZ-Ab结合97000、145000、180000或230000表皮抗原，未见IgG型BMZ-Ab与真皮抗原发生反应(图2)。
作为对照的BP血清可识别180000或230000表皮抗原，EBA血清识别290000真皮抗原，而正常人血清不与上述特定分子量抗原结合。
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讨论
LABD作为自身免疫性大疱病的一种，自1979年Chorzelski首次命名以来，国内外学者研究表明其临床表现、免疫荧光(IIF)、免疫电镜(IEM)及IB研究均表现出一定的异质性。LABD中IgA型BMZ-Ab可识别多种BMZ蛋白。我们的结果显示9/11例LABD中存在IgA型BMZ-Ab，其中7/11例结合LABD97，该抗原是检出率最高的一种蛋白，符合国外相关文献的报道。此外还有2例成人型LABD可结合表皮180000或230000抗原。Arechalde[7]曾报道在儿童CBDC中出现抗BP180和BP230的特异性IgA型BMZ-Ab，尽管其具有LABD的临床表现和免疫病理特征，但可能是BP的IgA型反应。我们进一步证实在成人LABD中也可出现同样的反应，同时也提示LABD是BP或
EBA的亚型，而不是一种独立疾病。
目前对LABD的IB研究多集中在研究其IgA型BMZ-Ab的靶抗原上，我们的结果表明部分LABD患者存在IgA型BMZ-Ab的同时，也存在针对表皮提取物中97000和/或180000抗原的IgG型BMZ-Ab，表现为抗体异质性。有学者将这种情况定义为线性IgA/IgG大疱性皮肤病(LAGBD)，其原因可能是这类患者血清中BMZ-Ab可同时识别BP180分子上IgA和IgG型自身抗体所识别的表位。BP180是BP血清中BMZ-Ab的特征性靶抗原之一，部分BP血清也可识别LABD97[8]。这种LABD和BP靶抗原相互交叉的现象提示两种疾病间存在的内部联系。成人LABD和儿童CBDC除了发病年龄和皮肤、粘膜的受累程度及分布不同，在免疫病理和自身抗体的靶抗原方面都无法相互鉴别。我们的结果显示，儿童CBDC中IgA型BMZ-Ab同样识别表皮97000和180000抗原，进一步证实两者是同一疾病在不同年龄阶段的表现，而不是两种不同的疾病。
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LABD97作为LABD靶抗原的分子标准，IEM显示它位于BP180胞外NC16A区和其羧基端之间[9]，提示它参与构成BP180的胞外部分，同时LABD97在组成上具有与BP180胞外部分同源的氨基酸序列，LABD97的表位可能位于或邻近BP180的胶原区[10]。LABD97被高度怀疑是BP180的分解片段，我们首次证实在部分LABD血清中IgA型BMZ-Ab可同时结合LABD97和BP180分子，进一步证实了人们的设想，但由于多数患者血清识别的只是LABD97分子，说明在降解过程中LABD97分子可能会产生一些构象上特异的表位而BP180分子没有。
国家自然科学基金资助课题(39570659),安徽省自然科学基金资助课题(97424005)
参考文献
[1]Dmochowski M, Hashimoto T, Bhogal B, et al. Immunoblotting studies of linear IgA diseases. J Dermatol Sci, 1993,6:194- 200.
, 百拇医药
[2]Wojnarowska F, Whitehead P, Leigh IM, et al. Identification of the target antigen in chronic bullous disease of childhood and linear IgA diseases of adults. Br J Dermatol, 1991,124:157- 162.
[3]Ghohestani R, Nicolas J, Kanitakis J, et al. Linear IgA bullous dermatosis with IgA antibodies exclusively directed against the 180- or 230- kDa epidermal antigens. J Invest Dermatol, 1997,108:854- 858.
[4]Allen J, Zhou S, Wakelin S, et al. Linear IgA diseases: a report of two dermal binding sera which recognize a pepsin- sensitive epitope of collagen type VII. Br J Dermatol, 1997,137:526- 533.
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[5]张学军，王培光，翁孟武，等.自身免疫性大疱病中IgA型基底膜带抗体分析.中华皮肤科杂志，1999,32：393.
[6]张学军，翁孟武，施守义.热分离真表皮快速制备表皮下大疱病抗原.中华微生物学与免疫学杂志，1994,14：329-331.
[7]Arechalde A, Braun P, Calza A, et al. Children bullous pemphigoid associated with IgA antibodies against BP180 or BP230 antigens. Br J Dermatol, 1999,140:112- 118.
[8]Egan C, Taylor T, Meyer L, et al. Bullous pemphigoid sera that contain antibodies to BPAg2 also contain antibodies to LABD97 that recognize epitopes distal to the NC16A Domain. J Invest Dermatol, 1999,112:148- 152.
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[9]Ishiko A, Shimizu H, Masunaga T, et al. 97kDa linear IgA bullous dermatosis antigen localizes in the lamina lucida between the NC16A and carboxyl terminal domains of the 180000a bullous pemphigoid antigen. J Invest Dermatol, 1998,111:93- 96.
[10]Zone J, Taylor T, Meyer L, et al. The 97 kDa linear IgA bullous diseases antigen is identical to a portion of the extracellular domain of the 180kDa bullous pemphigoid antigen, BPAg2. J Invest Dermatol, 1998, 110:207- 210.
(收稿日期：2000-01- 7), 百拇医药
单位：230022合肥，安徽医科大学第一附属医院皮肤科
关键词：线性IgA大疱病；印迹法；蛋白质
中华皮肤科杂志000514
【摘要】目的了解线性IgA大疱病基底膜带自身抗体(BMZ-Ab)靶抗原及其与其它表皮下自身免疫性大疱病相关抗原的关系。方法用热分离法提取真表皮抗原，免疫印迹检测11例线性IgA大疱病中IgA型和IgG型BMZ-Ab靶抗原的分布情况。结果11例线性IgA大疱病患者中9例血清中IgA型BMZ-Ab可分别与真、表皮抗原结合，其中7例结合97000表皮抗原(LABD97)，2例同时结合180000抗原，另有2例成人型线性IgA大疱病分别结合180000或230000表皮抗原。5例IgG型BMZ-Ab结合表皮97000、145000、180000、230000抗原，未见与真皮抗原发生反应。结论线性IgA大疱病中BMZ-Ab的靶抗原表现为异质性，除LABD97以外，还可以是BP180、BP230等大疱性类天疱疮(BP)相关抗原。LABD97可能是BP180分子的降解产物，线性IgA大疱病是否是一种独立疾病应深入研究。
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Heterogeneity of Target Antigens of Basal Membrane Zone Antibodies in Linear IgA Bullous Dermatosis
ZHANG Xuejun，WANG Zaixing，YANG Sen，et al.
(Dermatology of Department, First Affiliated Hospital, Anhui Medical University, Hefei 230022)
【Abstract】 Objective To detect the target antigens of basal membrane zone antibodies (BMZ- Ab) in linear IgA bullous dermatosis (LABD). Methods Dermal and epidermal antigens were extracted by heat- separated procedure, then the target antigens of BMZ- Abs in 11 LABD sera were detected. Results The IgA BMZ- Abs in 9/11 LABD sera could reacted with dermal and epidermal antigens respectively. 7/11 LABD sera reacted with 97 000 epidermal antigen (LABD 97), 2 sera reacted with 180 000 epidermal antigen simultaneously. 2 adult LABD sera recognized 180 000 and 230 000 epidermal antigen respectively. IgG BMZ- Ab in 5/11 LABD sera reacted with 97 000, 145 000, 180 000, 230 000 epidermal antigens, and did not react with dermal antigens. Conclusions The target antigens of IgA BMZ- Abs in LABD were heterogeneous including LABD 97, BP 180 and BP 230. LABD 97 may be a degraded fragment of BP 180. Whether LABD is an independent entity or not should be further investigated.
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【Key words】 Linear IgA bullous dermatosis Blotting, Western
线性IgA大疱病(LABD)是一种以粘膜和皮肤基底膜带(BMZ)IgA型自身抗体线状沉积为特征的自身免疫性表皮下大疱病(SABD)。根据发病年龄不同分为成人LABD和儿童慢性大疱性皮肤病(CBDC)两种。免疫印迹(IB)结果显示其靶抗原呈现明显的异质性，以97000表、真皮抗原(LABD97)检出率最高，也可以是真皮255000[1]、285000[2]抗原，近来有人表明大疱性类天疱疮(BP)、获得性大疱性表皮松解症(EBA)的特征性靶抗原BP180、BP230[3]和290000Ⅶ型胶原[4]也可被LABD血清识别。我们曾报道LABDIgA型BMZ-Ab可识别多种BMZ抗原成分[5]，为进一步阐明LABD靶抗原的特性及其与其它SABD相关抗原的关系，我们采用IB法检测11例LABD患者血清中IgA型和IgG型BMZ-Ab识别的靶抗原。
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材料与方法
1.病例选择：11例LABD，其中成人型LABD8例，儿童型CBDC3例，皆为我科近年来收住院的患者，经临床、普通病理和免疫病理检查后确诊。按现行的诊断标准，直接免疫荧光(DIF)仅有IgA型Ab沉积于皮肤BMZ或间接免疫荧光(IIF)仅检出IgA型循环BMZ抗体确定为LABD。平均年龄(28±17.6)岁，最大47岁，最小2岁。同时选取我科收住院的3例BP、2例EBA患者和3例正常人作对照。
2.方法：热分离法[6]分离真、表皮，取真、表皮抗原提取物经SDS-PAGE和转移电泳，将抗原转印至NC膜上，3%BSA封闭5h。加入1∶10稀释的待检血清反应4h，血清稀释液(50mmol/LTris-HCl，pH7.4，含0.5mol/LNaCl，0.5%BSA，0.3%吐温20)漂洗10min×3次，加入1∶400稀释的HRP标记的兔抗人IgA或IgG抗体(Sigma产品)反应1h。血清稀释液漂洗10min×3次，加入DAB显色。与标准蛋白对照，计算阳性条带分子量大小。
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图1LABD血清中IgA型BMZ-Ab与表皮抗原结合
图2LABD血清中IgG型BMZ-Ab与表皮抗原结合
结果
11例LABD患者中9例血清中IgA型BMZ-Ab可与真、表皮抗原结合，其中7例结合97000表皮抗原，2例同时结合180000抗原，另有2例成人型LABD分别单独结合180000或230000表皮抗原。4例结合97000真皮抗原，未见与其它分子量的真表皮抗原结合(图1)。5例IgG型BMZ-Ab结合97000、145000、180000或230000表皮抗原，未见IgG型BMZ-Ab与真皮抗原发生反应(图2)。
作为对照的BP血清可识别180000或230000表皮抗原，EBA血清识别290000真皮抗原，而正常人血清不与上述特定分子量抗原结合。
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讨论
LABD作为自身免疫性大疱病的一种，自1979年Chorzelski首次命名以来，国内外学者研究表明其临床表现、免疫荧光(IIF)、免疫电镜(IEM)及IB研究均表现出一定的异质性。LABD中IgA型BMZ-Ab可识别多种BMZ蛋白。我们的结果显示9/11例LABD中存在IgA型BMZ-Ab，其中7/11例结合LABD97，该抗原是检出率最高的一种蛋白，符合国外相关文献的报道。此外还有2例成人型LABD可结合表皮180000或230000抗原。Arechalde[7]曾报道在儿童CBDC中出现抗BP180和BP230的特异性IgA型BMZ-Ab，尽管其具有LABD的临床表现和免疫病理特征，但可能是BP的IgA型反应。我们进一步证实在成人LABD中也可出现同样的反应，同时也提示LABD是BP或
EBA的亚型，而不是一种独立疾病。
目前对LABD的IB研究多集中在研究其IgA型BMZ-Ab的靶抗原上，我们的结果表明部分LABD患者存在IgA型BMZ-Ab的同时，也存在针对表皮提取物中97000和/或180000抗原的IgG型BMZ-Ab，表现为抗体异质性。有学者将这种情况定义为线性IgA/IgG大疱性皮肤病(LAGBD)，其原因可能是这类患者血清中BMZ-Ab可同时识别BP180分子上IgA和IgG型自身抗体所识别的表位。BP180是BP血清中BMZ-Ab的特征性靶抗原之一，部分BP血清也可识别LABD97[8]。这种LABD和BP靶抗原相互交叉的现象提示两种疾病间存在的内部联系。成人LABD和儿童CBDC除了发病年龄和皮肤、粘膜的受累程度及分布不同，在免疫病理和自身抗体的靶抗原方面都无法相互鉴别。我们的结果显示，儿童CBDC中IgA型BMZ-Ab同样识别表皮97000和180000抗原，进一步证实两者是同一疾病在不同年龄阶段的表现，而不是两种不同的疾病。
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LABD97作为LABD靶抗原的分子标准，IEM显示它位于BP180胞外NC16A区和其羧基端之间[9]，提示它参与构成BP180的胞外部分，同时LABD97在组成上具有与BP180胞外部分同源的氨基酸序列，LABD97的表位可能位于或邻近BP180的胶原区[10]。LABD97被高度怀疑是BP180的分解片段，我们首次证实在部分LABD血清中IgA型BMZ-Ab可同时结合LABD97和BP180分子，进一步证实了人们的设想，但由于多数患者血清识别的只是LABD97分子，说明在降解过程中LABD97分子可能会产生一些构象上特异的表位而BP180分子没有。
国家自然科学基金资助课题(39570659),安徽省自然科学基金资助课题(97424005)
参考文献
[1]Dmochowski M, Hashimoto T, Bhogal B, et al. Immunoblotting studies of linear IgA diseases. J Dermatol Sci, 1993,6:194- 200.
, 百拇医药
[2]Wojnarowska F, Whitehead P, Leigh IM, et al. Identification of the target antigen in chronic bullous disease of childhood and linear IgA diseases of adults. Br J Dermatol, 1991,124:157- 162.
[3]Ghohestani R, Nicolas J, Kanitakis J, et al. Linear IgA bullous dermatosis with IgA antibodies exclusively directed against the 180- or 230- kDa epidermal antigens. J Invest Dermatol, 1997,108:854- 858.
[4]Allen J, Zhou S, Wakelin S, et al. Linear IgA diseases: a report of two dermal binding sera which recognize a pepsin- sensitive epitope of collagen type VII. Br J Dermatol, 1997,137:526- 533.
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[5]张学军，王培光，翁孟武，等.自身免疫性大疱病中IgA型基底膜带抗体分析.中华皮肤科杂志，1999,32：393.
[6]张学军，翁孟武，施守义.热分离真表皮快速制备表皮下大疱病抗原.中华微生物学与免疫学杂志，1994,14：329-331.
[7]Arechalde A, Braun P, Calza A, et al. Children bullous pemphigoid associated with IgA antibodies against BP180 or BP230 antigens. Br J Dermatol, 1999,140:112- 118.
[8]Egan C, Taylor T, Meyer L, et al. Bullous pemphigoid sera that contain antibodies to BPAg2 also contain antibodies to LABD97 that recognize epitopes distal to the NC16A Domain. J Invest Dermatol, 1999,112:148- 152.
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[9]Ishiko A, Shimizu H, Masunaga T, et al. 97kDa linear IgA bullous dermatosis antigen localizes in the lamina lucida between the NC16A and carboxyl terminal domains of the 180000a bullous pemphigoid antigen. J Invest Dermatol, 1998,111:93- 96.
[10]Zone J, Taylor T, Meyer L, et al. The 97 kDa linear IgA bullous diseases antigen is identical to a portion of the extracellular domain of the 180kDa bullous pemphigoid antigen, BPAg2. J Invest Dermatol, 1998, 110:207- 210.
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