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链球菌抗原刺激的银屑病患者外周血单一核细胞培养上清液中TNF-α和IL-6的检测
http://www.100md.com 中华皮肤科杂志 2000年第5期第33卷
     作者:张理涛 吕克己 高兴华 陈学荣 殷金珠 陈洪铎

    单位:张理涛 高兴华 陈洪铎(110001沈阳,中国医科大学第一临床医院皮肤科);吕克己(北京大学第三医院皮肤科);陈学荣(北京大学第三医院皮肤科);殷金珠(临床免疫室)

    关键词:

    中华皮肤科杂志000522

    以往的研究表明[1],银屑病患者外周血单一核细胞(PBMC)对链球菌抗原刺激反应明显;而且,链球菌抗原刺激PBMC的培养上清液可促进人角质形成细胞DNA合成和细胞间粘附因子1(ICMA-1)、HLA-DR分子表达。说明培养上清液中的细胞因子发生了质或量的变化。为此,我们进一步检测了银屑病患者链球菌抗原刺激的PBMC培养上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素6(IL-6)变化。期望有助于探讨银屑病的发病机制。
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    表1银屑病患者PBMC培养上清液中TNF-α和IL-6的检测结果

    组别

    例数

    TNF-α活性(细胞死亡%)

    IL-6活性(A值)

    链球菌刺激*

    PHA刺激**

    PHA刺激

    链球菌刺激

    对照组

    8

    17.57±5.85
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    28.66±18.39

    0.686±0.202

    0.436±0.038

    银屑病组

    12

    11.47±5.78△

    22.37±14.16

    0.766±0.212

    0.645±0.110△

    注:*链球菌刺激的PBMC培养上清液,**PHA刺激的PBMC培养上清液,△与对照组比较,P<0.05

    一、材料和方法
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    (一)临床资料:临床和病理确诊的点滴状银屑病患者7例、斑块状5例;健康对照8例。点滴状病例多为初发,其中6例有上呼吸道感染病史;年龄17~39岁;病程1周至2年。斑块状患者年龄17~57岁;病程6个月至20年;所有患者至少1个月内未接受皮质类固醇及其他免疫抑制剂治疗。

    (二)方法:

    1.细胞:鼠纤维肉瘤细胞株WEHI-164、IL-6依赖细胞株7TD-1,来自北京大学临床免疫室。

    2.细菌:β溶血型链球菌菌株,北京大学微生物教研室提供。

    3.β溶血型链球菌的培养、收获及定量:见文献[1]

    4.各组PBMC24h培养上清液的收获及贮存见文献[1]
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    5.结晶紫比色法检测PBMC培养上清液中TNF-α改变[2]:生长良好的WEHI-164细胞,用PRMI-1640配成5×105/mL细胞悬液。每孔100μL加入96孔板;分银屑病和对照组加入PHA和链球菌刺激的PBMC培养上清液,每孔100μL;37℃,体积分数5%CO2条件下24h;弃上清液,PBS洗1次;每孔加入0.5%结晶紫200μL,30min;弃结晶紫,用蒸馏水洗6~8次;每孔加入冰醋酸水溶液120μL振荡3min,测波长570nm处A值。TNF-α活性以细胞死亡百分比表示。细胞死亡百分比=[1-(实验组A-空白组A)/(对照组A-空白组A)]×100%,其中对照组为未加PBMC培养上清液者。

    6.MTT法检测PBMC培养上清液中IL-6改变[2]:7TD-1细胞配成1×105/mL细胞悬液;每孔100μL加入96孔板;同时加入各组PBMC培养上清液,每孔20μL;再加入PRMI-1640培养基80μL/孔;
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    37℃,体积分数5%CO2条件下48h;培养结束前4h,每孔加入MTT50μL(5mg/mL);继续培养4h,离心弃上清液;加入盐酸异丙醇(1∶300)120μL/孔,测波长570nm处A值。以各组A值比较PBMC培养上清液中IL-6活性。

    (三)统计学处理:用SPSS软件作组间t检验。

    二、结果

    链球菌抗原刺激的银屑病患者PBMC培养上清液中TNF-α水平下降(与健康对照比较,P<0.05)、IL-6水平升高(与对照组比较,P<0.05);而PHA刺激的PBMC培养上清液中各组TNF-α和IL-6水平两组比较差异无显著性。见表1。

    三、讨论

    TNF-α主要由单核/巨噬细胞产生,活化的角质形成细胞也可以产生[3]。由于许多实验证明TNF-α体外可以明显抑制表皮细胞增殖[4],所以银屑病患者PBMC的链球菌抗原刺激培养上清液中TNF-α活性降低可能对疾病的发展有意义。银屑病患者在一定条件下,不能有效足量地产生抑制角质形成细胞增殖的TNF-α,可能是银屑病角质形成细胞过度增殖的原因之一。至于出现TNF-α活性下降的原因,除遗传因素导致PBMC功能缺陷之外,有可能链球菌抗原或超抗原只作用于T淋巴细胞,而对单核/巨噬细胞少有影响。本实验的另一个发现是链球菌抗原刺激的银屑病PBMC培养上清液中IL-6水平升高,从一个侧面证实了银屑病患者链球菌反应性T淋巴细胞的存在,有可能受链球菌抗原刺激活化的T淋巴细胞是IL-6的主要来源。
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    参考文献

    [1]张理涛,陈学荣,殷金珠.β溶血型链球菌诱发点滴型银屑病发病机制的研究.中华皮肤科杂志,1999,32:99-100.

    [2]钱玉昆,殷金珠.实用免疫学新技术.第1版.北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社,1994.53-55.

    [3] Kock A, Schwarz T, Kirnbauer R,et al. Human keratinocytes are a source for tumor necrosis factor alpha: Evidence for synthesis and release upon stimulation with endotoxin or ultraviolet light. J Exp Med, 1990, 172:1609- 1614.

    [4] Kono T, Tanii T, Furukawa M, et al. Effect of human recombinant tumor necrosis alpha(TNF- alpha) on the proliferation potential of human keratinocytes cultured in serum- free medium. J Dermatol, 1990,17:409- 413.

    (收稿日期:1999-11-09), 百拇医药