消疲怡神口服液对慢性束缚致大鼠疲劳骨骼肌能量代谢的影响*
作者：康纯洁 王天芳 刘晓兰 刘燕 陈易新
单位：北京中医药大学中医诊断教研室 北京100029
关键词：消疲怡神口服液；慢性束缚；骨骼肌；组织化学；能量代谢；大鼠
北京中医药大学学报990408 摘要：运用组织化学染色及定量技术观察慢性束缚致大鼠疲劳模型骨骼肌中糖原、与能量代谢有关酶的变化及中药复方消疲怡神口服液的作用。实验结果表明：慢性束缚所致疲劳大鼠的糖原与琥珀酸脱氢酶(SDH)含量无显著改变，肌球蛋白三磷酸腺苷酶(M-ATPase)明显降低，乳酸脱氢酶(LDH)明显升高；而服用消疲怡神口服液与人参皂甙后可明显提高糖原与SDH含量，纠正因造模所致M-ATPase的降低及LDH的升高。比较消疲怡神口服液与人参皂甙的作用，人参皂甙在增强M-ATPase含量方面的作用较强。
Effects of XiaoPiYiShen Oral Fluid on Rat Skeletal Muscles Energy Metabolism in Fatigue State by Chronically Enchainedment
, 百拇医药
Kang Chunjie Wang Tianfang Liu Xiaolan et al.
(Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100029)
ABSTRACT: Using histochemical staining and quantitative technology, observe rat glycogen in the skeletal muscles, changes of the enzyme related with energy metabolism and effects of TCM compound prescription Xiaopiyishen oral fluid (XPYS) in the rat model. Results show that: the contents of rat glycogen and succinic dehydrogenase (SDH) were not remarkably changed, while the level of myoglobulin-adenosine triphosphatase (M-ATPase) decreased and LDH increased markedly. After the administration of XPYS and panaxoside, the content of glycogen and SDH was remarkably increased, which improved the decrease of M-ATPase and increase of LDH caused by establishing the rat model. Compared with the effect of XPYS, panaxoside was more effective on increasing the content of M-ATPase.
, 百拇医药
KEY WORDS: XiaoPiYiShen oral fluid; Chronically enchainedment; Skeletal muscles; Histochemistry; Energy metabolism; Rat
许多研究表明，以慢性疲劳为主要特征的慢性疲劳综合征(CFS)的发病与精神紧张、过度劳累等应激因素有关[1～3]，本实验通过用组织化学染色及定量技术观察慢性束缚致大鼠疲劳模型骨骼肌中糖原及与能量代谢有关酶的变化，探讨慢性疲劳的发生机理及消疲怡神口服液的抗疲劳作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物：二级Wistar雄性大鼠，体重160～180g，由中国医学科学院流行病研究所实验动物中心提供。
, 百拇医药
1.1.2 药物：消疲怡神口服液由黄芪、枳壳、人参、柴胡、陈皮等药组成，10mL/支，每mL相当于生药1g，委托北京市永定中药厂加工，批号：960928；人参皂甙片：每片0.1g，含总皂甙25mg，中美合资吉林省亚威制药有限公司产品，批号：94032019。
1.1.3 实验器材：①造模用具：用硬塑料特制的束缚筒，该筒为管状，长20cm，筒口外径6cm，内径5.3cm。筒内前端置一直径略小于筒的内径，并可以前后调节的无底圆嘴玻璃瓶，其瓶口为通气口(距离筒口5cm左右)，后端为可开关闸门。大鼠头向通气口置入后，关闭闸门，可通过调节玻璃瓶改变大鼠的活动空间。②CM-1900恒冷箱冰冻切片机(德国LEICA)。③美国NT 8502图像分析仪。
1.2 方法
1.2.1 动物分组及造模[4]：实验动物饲养于室温(20±2)℃，每5只1笼。适应性饲养2d后，将45只大鼠随机分为正常对照组(A)、模型组(B)、中药组(C)、人参皂甙组(D)。第3天开始造模(造模全过程均在动物室中进行)，造模周期为14d，造模期间每天将B、C、D组束缚1次，束缚时将大鼠轻置于束缚筒内，固定、平置在自然光、安静的环境中，持续3h后，3组同步取出，在整个束缚过程中，各组动物在同一环境中，未进食水。而于每次造模前1 h，C组给予消疲怡神口服液灌胃，5g/(kg.d)；D组予以人参皂甙片灌胃，70mg/(kg.d)；其余2组则给予同等体积的蒸馏水。
, 百拇医药
1.2.2 观察指标及测定方法：将各组大鼠经10%水合氯醛(400mg/kg)麻醉、颈动脉取血后，切断其左后肢，取腓肠肌，用黄芪胶包埋后放入液氮预冷的异戊烷内骤冷10s，放置-70℃冰箱内保存待用。测定时用恒冷箱冰冻切片机制成6μm切片，运用组织化学染色法[5]，分别进行肌糖原(PAS，过碘酸雪夫反应法)、肌球蛋白ATP酶(中性ATPase法)，乳酸脱氢酶(LDH，硝基四氮盐法)及琥珀酸脱氢酶(SDH，硝基四氮盐法)的染色显示。
1.2.3 图像分析及统计学处理：利用美国NT 8502图像分析仪进行定量分析，每张切片随机选取3个视野，检测光密度值(OD值)、绝对面积及面积百分比3个指标。实验结果均以平均值±标准差(
±s)表示，组间差异采用方差分析用Duncan's检验，以P<0.05作为差异具有显著性的标准。
2 结果
, 百拇医药
2.1 大鼠骨骼肌中糖原及M-ATPase的含量变化
结果见表1。
表1 各组大鼠骨骼肌中糖原及M-ATPase含量的变化 (±s) 组 别
n
肌糖原
M-ATPase
光密度(OD值)
绝对面积/μm2
面积百分比
光密度(OD值)
, 百拇医药
绝对面积/μm2
面积百分比
正常对照组
11
19.22±15.10
209.17±69.75
0.07±0.04
41.54±19.54
5214.80±2470.45△
1.590±0.230△
模型组
, 百拇医药
11
5.32±1.16
40.34±3.23
0.02±0.01
14.31±6.91
630.00±378.12
0.255±0.186
中药组
12
10.26±9.35
1038.58±1137.15
0.40±0.44
, 百拇医药
97.82±59.01*△△
7417.75±3113.52△△
2.979±0.956
人参皂甙组
11
7.49±1.77
2027.92±1232.52**△△
0.78±0.47△△*
125.93±38.01**△△
13970.61±3991.13##
, 百拇医药
5.805±1.114△△**
注：与模型组比△P<0.05 △△P<0.01;与正常对照组比*P<0.05 **P<0.01;与中药组比##P<0.01
2.2 大鼠骨骼肌中SDH及LDH的含量变化
结果见表2。
表2 各组大鼠骨骼肌中SDH及LDH含量的变化 (±s) 组 别
n
SDH
LDH
光密度(OD值)
, http://www.100md.com
绝对面积/μm2
面积百分比
光密度(OD值)
绝对面积/μm2
面积百分比
正常对照组
11
12.13±3.01
2212.39±1677.371
0.848±0.668
54.390±25.01△
, 百拇医药
10071.83±2129.72
4.712±2.280△△
模型组
11
12.99±4.47
4406.92±3769.757
1.695±1.449
102.320±30.67
22879.50±9033.22
18.796±3.473
中药组
, http://www.100md.com
12
260.29±139.12**△△
42518.41±8850.686*△
20.321±12.936**△△
71.892±9.92
13475.59±9452.98△
10.181±2.645*△△
入参皂甙组
11
177.05±122.19*△△
, 百拇医药
1469.59±7933.032*△
15.674±3.080△△**
125.930±38.01**△△
13970.61±3991.13##
5.805±1.114△△**
注：与模型组比△P<0.05 △△P<0.01;与正常对照组比*P<0.05 **P<0.01;与中药组比##P<0.01
3 讨论
根据CFS的发病特征与临床表现，中医学对慢性疲劳的认识及现代医学的应激学说，我们提出肝脾功能失调为慢性疲劳发生的机理之一，并运用慢性束缚法研制了大鼠的慢性疲劳模型[4]。通过行为学评定，观察到该模型大鼠出现了体力、记忆力下降，情绪低落等与CFS临床表现相似的征象。通过服用消疲怡神口服液及人参皂甙后，均能显著逆转因造模所致上述变化，其中前者在改善记忆力方面的作用较明显，后者在提高运动能力方面略强。因为肌肉运动能力的强弱与骨骼肌能量代谢密切相关[6]，本实验进一步观测了模型大鼠骨骼肌糖原、与能量代谢有关酶的含量变化，以及补气理气、调理肝脾为组方原则的中药复方消疲怡神口服液对其的作用，以探讨其抗疲劳的机理。
, 百拇医药
CFS不仅有明显的疲劳主观感受，并且影响到了日常的活动能力。因此，它有可能影响到了机体骨骼肌的能量代谢。骨骼肌的能量代谢过程中以肌糖原做为肌组织的能量贮存形式，由三磷酸腺苷(ATP)做为骨骼肌运动的直接供能物质，其分解供能在ATPase的作用下进行。主要通过有氧化和糖酵解进行，SDH为线粒体的标志酶，可很敏感地反映骨骼肌中的有氧代谢情况。LDH是骨骼肌无氧代谢中一个很主要的酶，其活性可反映糖酵解的情况。实验结果表明，用慢性束缚法造模后，大鼠骨骼肌中的糖原含量较正常对照组略有下降的趋势，M-ATPase明显下降，SDH无明显变化，LDH含量显著增高。因此，该模型大鼠所出现的疲劳(运动能力下降)可能与M-ATPase含量下降，ATP的分解减弱，无氧代谢增强，乳酸堆积等有关。通过服用消疲怡神口服液及人参皂甙后可以提高糖原储备，促进有氧代谢，并在一定程度上抑制无氧代谢的亢进，增加M-ATPase含量，增加能量供给，从而纠正了能量代谢的失调，达到消除疲劳增进运动能力的作用。
*国家中医药管理局资助课题(NO.95B109)
, http://www.100md.com
作者简介：康纯洁，女，43岁，实验师
参考文献
1 Akinori Masuda. Psychobehavioral and Immunological Characteristic of Adult People with Chronic Fatigue and Patients with Chronic Fatigue Syndrome. Psychosomatic Medicine, 1994, 56:512～518
2 Mawle AC, Nisenbaum R, Dobbins JG, et al. The seroepidemiology of chronic fatigue syndrome: a case-control study. Clinical Infectious Diseases, 1995, 21:1386～1389
, 百拇医药
3 Dobbins JG, Natelson BH, Brassloff I, et al. physical behavioral and psychological risk factors for chronic fatigue syndrome: A central role for stress? Journal of Chronic Fatigue Syndrome, 1995, 1:43～58
4 王天芳，陈易新，季绍良，等.慢性束缚致慢性疲劳动物模型的研制及其行为学观察.中国中医基础医学杂志，1999，5(5)：25～29
5 杜卓民.实用组织学技术.北京：人民卫生出版社，1998.22～34, 132, 320
6 冯炜权.运动生物化学原理.北京：北京体育大学出版社，1995.42～47
(收稿日期：1999-01-21), http://www.100md.com
单位：北京中医药大学中医诊断教研室 北京100029
关键词：消疲怡神口服液；慢性束缚；骨骼肌；组织化学；能量代谢；大鼠
北京中医药大学学报990408 摘要：运用组织化学染色及定量技术观察慢性束缚致大鼠疲劳模型骨骼肌中糖原、与能量代谢有关酶的变化及中药复方消疲怡神口服液的作用。实验结果表明：慢性束缚所致疲劳大鼠的糖原与琥珀酸脱氢酶(SDH)含量无显著改变，肌球蛋白三磷酸腺苷酶(M-ATPase)明显降低，乳酸脱氢酶(LDH)明显升高；而服用消疲怡神口服液与人参皂甙后可明显提高糖原与SDH含量，纠正因造模所致M-ATPase的降低及LDH的升高。比较消疲怡神口服液与人参皂甙的作用，人参皂甙在增强M-ATPase含量方面的作用较强。
Effects of XiaoPiYiShen Oral Fluid on Rat Skeletal Muscles Energy Metabolism in Fatigue State by Chronically Enchainedment
, 百拇医药
Kang Chunjie Wang Tianfang Liu Xiaolan et al.
(Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100029)
ABSTRACT: Using histochemical staining and quantitative technology, observe rat glycogen in the skeletal muscles, changes of the enzyme related with energy metabolism and effects of TCM compound prescription Xiaopiyishen oral fluid (XPYS) in the rat model. Results show that: the contents of rat glycogen and succinic dehydrogenase (SDH) were not remarkably changed, while the level of myoglobulin-adenosine triphosphatase (M-ATPase) decreased and LDH increased markedly. After the administration of XPYS and panaxoside, the content of glycogen and SDH was remarkably increased, which improved the decrease of M-ATPase and increase of LDH caused by establishing the rat model. Compared with the effect of XPYS, panaxoside was more effective on increasing the content of M-ATPase.
, 百拇医药
KEY WORDS: XiaoPiYiShen oral fluid; Chronically enchainedment; Skeletal muscles; Histochemistry; Energy metabolism; Rat
许多研究表明，以慢性疲劳为主要特征的慢性疲劳综合征(CFS)的发病与精神紧张、过度劳累等应激因素有关[1～3]，本实验通过用组织化学染色及定量技术观察慢性束缚致大鼠疲劳模型骨骼肌中糖原及与能量代谢有关酶的变化，探讨慢性疲劳的发生机理及消疲怡神口服液的抗疲劳作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物：二级Wistar雄性大鼠，体重160～180g，由中国医学科学院流行病研究所实验动物中心提供。
, 百拇医药
1.1.2 药物：消疲怡神口服液由黄芪、枳壳、人参、柴胡、陈皮等药组成，10mL/支，每mL相当于生药1g，委托北京市永定中药厂加工，批号：960928；人参皂甙片：每片0.1g，含总皂甙25mg，中美合资吉林省亚威制药有限公司产品，批号：94032019。
1.1.3 实验器材：①造模用具：用硬塑料特制的束缚筒，该筒为管状，长20cm，筒口外径6cm，内径5.3cm。筒内前端置一直径略小于筒的内径，并可以前后调节的无底圆嘴玻璃瓶，其瓶口为通气口(距离筒口5cm左右)，后端为可开关闸门。大鼠头向通气口置入后，关闭闸门，可通过调节玻璃瓶改变大鼠的活动空间。②CM-1900恒冷箱冰冻切片机(德国LEICA)。③美国NT 8502图像分析仪。
1.2 方法
1.2.1 动物分组及造模[4]：实验动物饲养于室温(20±2)℃，每5只1笼。适应性饲养2d后，将45只大鼠随机分为正常对照组(A)、模型组(B)、中药组(C)、人参皂甙组(D)。第3天开始造模(造模全过程均在动物室中进行)，造模周期为14d，造模期间每天将B、C、D组束缚1次，束缚时将大鼠轻置于束缚筒内，固定、平置在自然光、安静的环境中，持续3h后，3组同步取出，在整个束缚过程中，各组动物在同一环境中，未进食水。而于每次造模前1 h，C组给予消疲怡神口服液灌胃，5g/(kg.d)；D组予以人参皂甙片灌胃，70mg/(kg.d)；其余2组则给予同等体积的蒸馏水。
, 百拇医药
1.2.2 观察指标及测定方法：将各组大鼠经10%水合氯醛(400mg/kg)麻醉、颈动脉取血后，切断其左后肢，取腓肠肌，用黄芪胶包埋后放入液氮预冷的异戊烷内骤冷10s，放置-70℃冰箱内保存待用。测定时用恒冷箱冰冻切片机制成6μm切片，运用组织化学染色法[5]，分别进行肌糖原(PAS，过碘酸雪夫反应法)、肌球蛋白ATP酶(中性ATPase法)，乳酸脱氢酶(LDH，硝基四氮盐法)及琥珀酸脱氢酶(SDH，硝基四氮盐法)的染色显示。
1.2.3 图像分析及统计学处理：利用美国NT 8502图像分析仪进行定量分析，每张切片随机选取3个视野，检测光密度值(OD值)、绝对面积及面积百分比3个指标。实验结果均以平均值±标准差(
±s)表示，组间差异采用方差分析用Duncan's检验，以P<0.05作为差异具有显著性的标准。2 结果
, 百拇医药
2.1 大鼠骨骼肌中糖原及M-ATPase的含量变化
结果见表1。
表1 各组大鼠骨骼肌中糖原及M-ATPase含量的变化 (
±s) 组 别n
肌糖原
M-ATPase
光密度(OD值)
绝对面积/μm2
面积百分比
光密度(OD值)
, 百拇医药
绝对面积/μm2
面积百分比
正常对照组
11
19.22±15.10
209.17±69.75
0.07±0.04
41.54±19.54
5214.80±2470.45△
1.590±0.230△
模型组
, 百拇医药
11
5.32±1.16
40.34±3.23
0.02±0.01
14.31±6.91
630.00±378.12
0.255±0.186
中药组
12
10.26±9.35
1038.58±1137.15
0.40±0.44
, 百拇医药
97.82±59.01*△△
7417.75±3113.52△△
2.979±0.956
人参皂甙组
11
7.49±1.77
2027.92±1232.52**△△
0.78±0.47△△*
125.93±38.01**△△
13970.61±3991.13##
, 百拇医药
5.805±1.114△△**
注：与模型组比△P<0.05 △△P<0.01;与正常对照组比*P<0.05 **P<0.01;与中药组比##P<0.01
2.2 大鼠骨骼肌中SDH及LDH的含量变化
结果见表2。
表2 各组大鼠骨骼肌中SDH及LDH含量的变化 (
±s) 组 别n
SDH
LDH
光密度(OD值)
, http://www.100md.com
绝对面积/μm2
面积百分比
光密度(OD值)
绝对面积/μm2
面积百分比
正常对照组
11
12.13±3.01
2212.39±1677.371
0.848±0.668
54.390±25.01△
, 百拇医药
10071.83±2129.72
4.712±2.280△△
模型组
11
12.99±4.47
4406.92±3769.757
1.695±1.449
102.320±30.67
22879.50±9033.22
18.796±3.473
中药组
, http://www.100md.com
12
260.29±139.12**△△
42518.41±8850.686*△
20.321±12.936**△△
71.892±9.92
13475.59±9452.98△
10.181±2.645*△△
入参皂甙组
11
177.05±122.19*△△
, 百拇医药
1469.59±7933.032*△
15.674±3.080△△**
125.930±38.01**△△
13970.61±3991.13##
5.805±1.114△△**
注：与模型组比△P<0.05 △△P<0.01;与正常对照组比*P<0.05 **P<0.01;与中药组比##P<0.01
3 讨论
根据CFS的发病特征与临床表现，中医学对慢性疲劳的认识及现代医学的应激学说，我们提出肝脾功能失调为慢性疲劳发生的机理之一，并运用慢性束缚法研制了大鼠的慢性疲劳模型[4]。通过行为学评定，观察到该模型大鼠出现了体力、记忆力下降，情绪低落等与CFS临床表现相似的征象。通过服用消疲怡神口服液及人参皂甙后，均能显著逆转因造模所致上述变化，其中前者在改善记忆力方面的作用较明显，后者在提高运动能力方面略强。因为肌肉运动能力的强弱与骨骼肌能量代谢密切相关[6]，本实验进一步观测了模型大鼠骨骼肌糖原、与能量代谢有关酶的含量变化，以及补气理气、调理肝脾为组方原则的中药复方消疲怡神口服液对其的作用，以探讨其抗疲劳的机理。
, 百拇医药
CFS不仅有明显的疲劳主观感受，并且影响到了日常的活动能力。因此，它有可能影响到了机体骨骼肌的能量代谢。骨骼肌的能量代谢过程中以肌糖原做为肌组织的能量贮存形式，由三磷酸腺苷(ATP)做为骨骼肌运动的直接供能物质，其分解供能在ATPase的作用下进行。主要通过有氧化和糖酵解进行，SDH为线粒体的标志酶，可很敏感地反映骨骼肌中的有氧代谢情况。LDH是骨骼肌无氧代谢中一个很主要的酶，其活性可反映糖酵解的情况。实验结果表明，用慢性束缚法造模后，大鼠骨骼肌中的糖原含量较正常对照组略有下降的趋势，M-ATPase明显下降，SDH无明显变化，LDH含量显著增高。因此，该模型大鼠所出现的疲劳(运动能力下降)可能与M-ATPase含量下降，ATP的分解减弱，无氧代谢增强，乳酸堆积等有关。通过服用消疲怡神口服液及人参皂甙后可以提高糖原储备，促进有氧代谢，并在一定程度上抑制无氧代谢的亢进，增加M-ATPase含量，增加能量供给，从而纠正了能量代谢的失调，达到消除疲劳增进运动能力的作用。
*国家中医药管理局资助课题(NO.95B109)
, http://www.100md.com
作者简介：康纯洁，女，43岁，实验师
参考文献
1 Akinori Masuda. Psychobehavioral and Immunological Characteristic of Adult People with Chronic Fatigue and Patients with Chronic Fatigue Syndrome. Psychosomatic Medicine, 1994, 56:512～518
2 Mawle AC, Nisenbaum R, Dobbins JG, et al. The seroepidemiology of chronic fatigue syndrome: a case-control study. Clinical Infectious Diseases, 1995, 21:1386～1389
, 百拇医药
3 Dobbins JG, Natelson BH, Brassloff I, et al. physical behavioral and psychological risk factors for chronic fatigue syndrome: A central role for stress? Journal of Chronic Fatigue Syndrome, 1995, 1:43～58
4 王天芳，陈易新，季绍良，等.慢性束缚致慢性疲劳动物模型的研制及其行为学观察.中国中医基础医学杂志，1999，5(5)：25～29
5 杜卓民.实用组织学技术.北京：人民卫生出版社，1998.22～34, 132, 320
6 冯炜权.运动生物化学原理.北京：北京体育大学出版社，1995.42～47
(收稿日期：1999-01-21), http://www.100md.com