血小板第4因子的造血保护作用
作者：杨岚 朱柏贵 田琼 张邵章
单位：杨岚(第四军医大学西京医院血液科，陕西 西安 710032)朱柏贵(第四军医大学西京医院血液科，陕西 西安 710032)田琼(第四军医大学防原教研室)张邵章(第四军医大学防原教研室)
关键词：造血功能；血小板第4因子；造血保护
血小板第4因子的造血保护作用 摘 要：目的：了解血小板第4因子对60Co r射线照射后小鼠体内造血的作用。方法：实验鼠用PF4注射两次，间隔6 h，第2次注射后20 h给予7.5 Gy的60Co r射线一次性全身照射，第8天时检查粒-巨噬系集落形成单位(CFU-GM)及细胞周期的变化；第30天时检查小鼠的存活率。结果：PF4注射8 d后能明显增加CFU-GM及骨髓单个核细胞的数量；30 d后实验鼠的存活率及存活期亦见增加。结论：PF4能延长小鼠的生存时间，增加小鼠的存活率，加速体内CFU-GM的恢复。
, 百拇医药
分类号：R 331.2 文献标识码：A
文章编号：1007-8622(2000)01-0006-03
The hemaprotective effects of platelet factor 4
YANG Lan,ZHU Bai-gui,TIAN Qiong,et al.
(Department of Hematology,Xijing Hospital,The 4th Military Medical University，710032)
Abstract：Objective：TO study the effects of platelet factor 4(PF4) on hematopoietic progenitors in mice treated with 60Co r-ray.Methods：The mice were injected with PF4 twice at 6 h intervals,and 20 h after the second injection,they were given one irradiation of 7.5 Gy60Co r-ray.The number of CFU-GM and mononuclear cell of bone marrow and cell cycle were examined 8 days later.The survival condition during 30 days was observed.Results：Administration of PF4 resulted in a significant increase in the numbers of CFU-GM and mononuclear cell of bone marrow on day 8th when it was compared with60Co r alone,and morever,survival rate and survival days also rised 30 days later.Conclusion：PF4 could prolong the life,increase survival rate and accelerate proliferation of CFU-GM.
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Key words：Hematopoietic function; Platelet factor 4; Hemaprotection▲
血小板因子4(platelet factor 4， PF4)是造血抑制因子，属于趋化因子C-X-C亚族，能抑制增殖力强的造血细胞生长，而对分化程度高的造血细胞影响较小，并且这种抑制作用是可逆的。利用这种可逆性抑制作用，已成功地进行了保护造血干细胞抵抗化疗药物杀伤的作用。但目前尚未见PF4保护造血干细胞、减轻辐射损伤作用的研究报道。
1 材料和方法
1.1 实验动物：BALB/c小鼠70只，鼠龄10～12周，雄性，体重19～21 g,由第四军医大学实验动物中心提供。随机分为两个大组，组1将小鼠随机分照射组(A组)和PF4加照射组两个组，后者又将PF4分成三个不同剂量组；B组：20 μg.kg-1.次-1，C组：40 μg.kg-1.次-1，D组：60 μg.kg-1.次-1；组2分为照射组、空白对照组和PF4加照射组(PF4，20 μg.kg-1.次-1)三个组。
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1.2 试剂：PF4由上海贝尔公司提供。用生理盐水配制成2.40 mg.L-1稀释液备用。
1.3 照射剂量：60 Cor射线一次全身均匀照射，每只小鼠总照射剂量为7.5 Gy，剂量率1.67 Gy.min-1。
1.4 外周血血细胞计数和骨髓有核细胞计数：照射后第8天，小鼠眼静脉取外周血，采用标准方法计数外周血白细胞、红细胞和血小板数目。取小鼠两侧股骨，用RPMI1640液冲洗骨髓腔，并用淋巴细胞分离液分离单个核细胞层，洗涤两次，加入适量培养液充分混匀，制成悬液，用台盼蓝鉴定细胞活性在95%以上，计数骨髓有核细胞数。
1.5 粒-巨噬系集落形成单位(CFU-GM)测定：采用双层琼脂培养法测定CFU-GM集落形成能力。
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1.6 细胞周期测定：将骨髓单个核细胞用70%的乙醇固定，溴化丙啶染色，用流式细胞仪测定细胞周期和死亡细胞。
1.7 小鼠体重和脾脏、胸腺重量测定：照射前后分别测定小鼠体重和脾脏、胸腺重量。
2 结果
2.1 PF4对受照小鼠存活的影响：接受7.5 Gy 60Co r射线照射的小鼠30 d后，未给予PF4的小鼠(A组)全部死亡，用对数秩和检验(log rand test)可以看出，A组与B、C、D三组存活率相比有显著差异，P<0.01。B、C、D三组之间存活率相比较差异不显著，P>0.05。同时PF4还能延长照射小鼠的存活天数，见表1、图1。
表1 PF4对小鼠7.5 Gy 射线全身照射后30 d存活的影响
组别
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n
PF4剂量(μg/鼠)
存活数
存活率(%)
存活天数(
±s)
A组
10
0.0
0
0
12.2±4.2
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B组
10
0.4
5
50
25.1±3.86
C组
10
0.8
6
60
24.0±3.97
, 百拇医药
D组
10
1.2
6
60
22.6±5.36
注：*与照射对照组比较，P<0.01；
图1 60 Cor射线照射后小鼠存活折线图
, 百拇医药
2.2 PF4对受照小鼠外周血细胞计数的影响：60Co r射线照射后第8天外周血白细胞、红细胞和血小板计数给药组与照射组相比较均未见明显差异，见表2。
表2 PF4对小鼠受7.5 Gy射线全身照射后外周血细胞计数的影响
组别
n
白细胞数(×109.L-1)
红细胞数(×109.L-1)
血小板数(×109.L-1)
照射对照
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10
0.2200±0.0900
10.1860±0.6260
30.0000±9.8234
照射+PF4
10
0.2600±1.0300
10.3320±0.5226
38.8000±20.3273
空白对照
10
176.2300±0.0400
, 百拇医药
10.1520±2.2193
761.2000±149.4179
2.3 PF4对小鼠受7.5 Gy照射后骨髓有核细胞数和CFU-GM的保护作用：用7.5 Gy 60Co r射线照射后的第8天，照射小鼠骨髓有核细胞数、GM-CFU集落数均低于PF组，两组比较差异显著，P<0.01；GM-CFU集落数与正常组相比较，PF4组明显高于正常对照组，P<0.05，见图2。
图2 PF4对骨髓单个核细胞数和CFU-GM的影响
2.4 细胞周期的测定：照射组出现了明显的凋亡峰，比例达63.8%，而给药组仅为0.5%，与空白对照(0.2%)相近，S期和G2/M期则低于给药组和空白对照组。
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2.5 小鼠体重和脾脏、胸腺重量测定：给药组小鼠体重、脾脏、胸腺重量均高于照射组，脾体比和胸体比也高于给药组，但低于空白对照组。见表3。
表3 PF4对小鼠体重和脾脏、胸腺重量的影响
组别
n
小鼠体重(g)
脾脏重量(g)
脾/体
胸腺重量(g)
胸/体
照射对照
10
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31.8000±2.1000
39.8000±2.1000
1.2775±0.0961
12.0000±7.8000
0.5623±0.0946
照射+PF4
10
35.6000±3.6000
43.3000±6.7000
1.4060±0.1104
47.0000±3.9000
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1.1807±0.2730
空白对照
10
36.4000±1.3000
99.0000±21.9000
4.2599±0.5669
71.3000±22.8000
2.0444±0.3372
注：**给药组分别与空白对照组和/或照射(胸/体)组比较，P<0.01；给药组与照射对照组比较P<0.05。
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3 讨论
近10年来陆续发现PF4有调节骨髓的造血功能，主要是抑制骨髓的造血干细胞和各系造血祖细胞，对巨核系造血前体细胞的生长起着抑制增殖和成熟的作用[1]，而对成熟的造血细胞影响较小[2]，并且其抑制作用是可逆的。PF4是通过抑制造血细胞DNA的合成，阻滞细胞在S期[3]，减少5-FU、DNR、ANR等细胞毒剂的化学敏感性，提高IC50值而发挥作用的[4，5]。
本研究中PF4能提高极重度(受照剂量6～10 Gy)辐射损伤小鼠的生存时间和存活率(见表1和图1)。在20～60 μg.kg-1的给药范围内未观察到PF4与辐射防护之间的量效关系。照后第8天，受照小鼠骨髓的有核细胞数、CFU-GM均小于给药组，但外周血细胞未见明显差异，表明PF4主要作用于早期造血干细胞，保护造血前体细胞免受辐射的损伤，而对成熟的血细胞无明显作用。值得注意的是PF4还可减轻辐射对胸腺和脾脏的损伤作用，表现在照射组胸体比和脾体比明显低于给药组，尤以胸体比为甚。
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胸腺属中枢淋巴器官，是体内淋巴细胞生成非常活跃的地方，胸腺皮质部淋巴细胞的有丝分裂率较其它外周淋巴器官高5～10倍。去胸腺动物短时间内可见血和淋巴组织中淋巴细胞明显减少，并失去细胞免疫和对某些抗原的体液反应能力。同时淋巴细胞又是辐射损伤最敏感的细胞。本研究观察到给药组胸腺重量明显高于照射组，提示PF4对胸腺的保护作用 不仅对造血系统并对机体免疫系统都有着非常重要意义，它将有助于辐射损伤小鼠免疫功能的恢复。
辐射对细胞的损伤效应是多方面的，既可诱导细胞的凋亡，又可引起细胞周期阻滞[6]。G2/M期阻滞是辐射对生长着的真核细胞最具特征的效应。本研究发现照射组G2/M期细胞增多，同时伴有凋亡细胞的增多；给药组细胞周期各期与空白对照组相比无明显差异，凋亡细胞仅占0.5%，进一步证实了PF4的辐射防护效应。
近年来虽有许多学者致力于辐射防护剂的研究，但真正用于临床的有效辐射防护剂很少，造血刺激因子也主要是用于促进辐射损伤后骨髓造血细胞的恢复。关于辐射防护用药方面虽有报道，但并未取得突破性进展，大多数药物因毒副作用大而限制了其临床应用。PF4是人体固有的一种细胞因子，我们的研究发现其辐射防护作用是肯定的，它不仅能保护造血前体细胞免受辐射损伤，而且对骨髓以外的淋巴组织也有一定的保护作用，可能成为一种很有发展前景的辐射防护剂。有关PF4辐射防护的最佳给药剂量、给药方式、给药时间以及作用机理值得进一步深入研究。■
, 百拇医药
作者简介：杨 岚(1959—)，女，硕士，副教授
参考文献：
[1]Gewirtz AM,Calabretta B,Rucinski B,et al.Inhibition of human megakaryocytopoiesis in vitro by platelet factor 4(PF4)and a sythetic COOH-terminal PF4 pepitide[J].J Clin Invest,1989,83：1477-1486.
[2]Aidoudi S,Guigon M,Lebeurier I,et al.In vivo,effect of platelet factor 4(PF4) and tetrapeptide AcSDKP on haemopoiesis of mice treated with 5-fluorouracil[J].Br J Haematol,1996,94：443-448.
, 百拇医药
[3]Gupta SK,Singh JP.Inhibition of endothelial proliferation by platelet factor 4 involves a unique action on S phase progression[J].J Cell Biol,1994,127：1121.
[4]韩忠朝，蔡英林，Aidoudi S,等.血小板因子4及AcSDKP的造血保护作用研究[J].中华血液学杂志，1999，20：33-35.
[5]Han ZC,Lu M,Li J,et al.Platelet factor 4 and other CXC chemokines support the survival of normal hematopoitic cells and reduce the chemosensitivity of cell to cytoxic agents[J].Blood,1997,89(7)：2328.
[6]Yarnold J.Molecular aspects of cellular responses to radiotherapy[J].Radiother Oncol,1997,44：1-7.
收稿日期：1999-11-02, 百拇医药
单位：杨岚(第四军医大学西京医院血液科，陕西 西安 710032)朱柏贵(第四军医大学西京医院血液科，陕西 西安 710032)田琼(第四军医大学防原教研室)张邵章(第四军医大学防原教研室)
关键词：造血功能；血小板第4因子；造血保护
血小板第4因子的造血保护作用 摘 要：目的：了解血小板第4因子对60Co r射线照射后小鼠体内造血的作用。方法：实验鼠用PF4注射两次，间隔6 h，第2次注射后20 h给予7.5 Gy的60Co r射线一次性全身照射，第8天时检查粒-巨噬系集落形成单位(CFU-GM)及细胞周期的变化；第30天时检查小鼠的存活率。结果：PF4注射8 d后能明显增加CFU-GM及骨髓单个核细胞的数量；30 d后实验鼠的存活率及存活期亦见增加。结论：PF4能延长小鼠的生存时间，增加小鼠的存活率，加速体内CFU-GM的恢复。
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分类号：R 331.2 文献标识码：A
文章编号：1007-8622(2000)01-0006-03
The hemaprotective effects of platelet factor 4
YANG Lan,ZHU Bai-gui,TIAN Qiong,et al.
(Department of Hematology,Xijing Hospital,The 4th Military Medical University，710032)
Abstract：Objective：TO study the effects of platelet factor 4(PF4) on hematopoietic progenitors in mice treated with 60Co r-ray.Methods：The mice were injected with PF4 twice at 6 h intervals,and 20 h after the second injection,they were given one irradiation of 7.5 Gy60Co r-ray.The number of CFU-GM and mononuclear cell of bone marrow and cell cycle were examined 8 days later.The survival condition during 30 days was observed.Results：Administration of PF4 resulted in a significant increase in the numbers of CFU-GM and mononuclear cell of bone marrow on day 8th when it was compared with60Co r alone,and morever,survival rate and survival days also rised 30 days later.Conclusion：PF4 could prolong the life,increase survival rate and accelerate proliferation of CFU-GM.
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Key words：Hematopoietic function; Platelet factor 4; Hemaprotection▲
血小板因子4(platelet factor 4， PF4)是造血抑制因子，属于趋化因子C-X-C亚族，能抑制增殖力强的造血细胞生长，而对分化程度高的造血细胞影响较小，并且这种抑制作用是可逆的。利用这种可逆性抑制作用，已成功地进行了保护造血干细胞抵抗化疗药物杀伤的作用。但目前尚未见PF4保护造血干细胞、减轻辐射损伤作用的研究报道。
1 材料和方法
1.1 实验动物：BALB/c小鼠70只，鼠龄10～12周，雄性，体重19～21 g,由第四军医大学实验动物中心提供。随机分为两个大组，组1将小鼠随机分照射组(A组)和PF4加照射组两个组，后者又将PF4分成三个不同剂量组；B组：20 μg.kg-1.次-1，C组：40 μg.kg-1.次-1，D组：60 μg.kg-1.次-1；组2分为照射组、空白对照组和PF4加照射组(PF4，20 μg.kg-1.次-1)三个组。
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1.2 试剂：PF4由上海贝尔公司提供。用生理盐水配制成2.40 mg.L-1稀释液备用。
1.3 照射剂量：60 Cor射线一次全身均匀照射，每只小鼠总照射剂量为7.5 Gy，剂量率1.67 Gy.min-1。
1.4 外周血血细胞计数和骨髓有核细胞计数：照射后第8天，小鼠眼静脉取外周血，采用标准方法计数外周血白细胞、红细胞和血小板数目。取小鼠两侧股骨，用RPMI1640液冲洗骨髓腔，并用淋巴细胞分离液分离单个核细胞层，洗涤两次，加入适量培养液充分混匀，制成悬液，用台盼蓝鉴定细胞活性在95%以上，计数骨髓有核细胞数。
1.5 粒-巨噬系集落形成单位(CFU-GM)测定：采用双层琼脂培养法测定CFU-GM集落形成能力。
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1.6 细胞周期测定：将骨髓单个核细胞用70%的乙醇固定，溴化丙啶染色，用流式细胞仪测定细胞周期和死亡细胞。
1.7 小鼠体重和脾脏、胸腺重量测定：照射前后分别测定小鼠体重和脾脏、胸腺重量。
2 结果
2.1 PF4对受照小鼠存活的影响：接受7.5 Gy 60Co r射线照射的小鼠30 d后，未给予PF4的小鼠(A组)全部死亡，用对数秩和检验(log rand test)可以看出，A组与B、C、D三组存活率相比有显著差异，P<0.01。B、C、D三组之间存活率相比较差异不显著，P>0.05。同时PF4还能延长照射小鼠的存活天数，见表1、图1。
表1 PF4对小鼠7.5 Gy 射线全身照射后30 d存活的影响
组别
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n
PF4剂量(μg/鼠)
存活数
存活率(%)
存活天数(
±s)A组
10
0.0
0
0
12.2±4.2
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B组
10
0.4
5
50
25.1±3.86
C组
10
0.8
6
60
24.0±3.97
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D组
10
1.2
6
60
22.6±5.36
注：*与照射对照组比较，P<0.01；
图1 60 Cor射线照射后小鼠存活折线图
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2.2 PF4对受照小鼠外周血细胞计数的影响：60Co r射线照射后第8天外周血白细胞、红细胞和血小板计数给药组与照射组相比较均未见明显差异，见表2。
表2 PF4对小鼠受7.5 Gy射线全身照射后外周血细胞计数的影响
组别
n
白细胞数(×109.L-1)
红细胞数(×109.L-1)
血小板数(×109.L-1)
照射对照
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10
0.2200±0.0900
10.1860±0.6260
30.0000±9.8234
照射+PF4
10
0.2600±1.0300
10.3320±0.5226
38.8000±20.3273
空白对照
10
176.2300±0.0400
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10.1520±2.2193
761.2000±149.4179
2.3 PF4对小鼠受7.5 Gy照射后骨髓有核细胞数和CFU-GM的保护作用：用7.5 Gy 60Co r射线照射后的第8天，照射小鼠骨髓有核细胞数、GM-CFU集落数均低于PF组，两组比较差异显著，P<0.01；GM-CFU集落数与正常组相比较，PF4组明显高于正常对照组，P<0.05，见图2。
图2 PF4对骨髓单个核细胞数和CFU-GM的影响
2.4 细胞周期的测定：照射组出现了明显的凋亡峰，比例达63.8%，而给药组仅为0.5%，与空白对照(0.2%)相近，S期和G2/M期则低于给药组和空白对照组。
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2.5 小鼠体重和脾脏、胸腺重量测定：给药组小鼠体重、脾脏、胸腺重量均高于照射组，脾体比和胸体比也高于给药组，但低于空白对照组。见表3。
表3 PF4对小鼠体重和脾脏、胸腺重量的影响
组别
n
小鼠体重(g)
脾脏重量(g)
脾/体
胸腺重量(g)
胸/体
照射对照
10
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31.8000±2.1000
39.8000±2.1000
1.2775±0.0961
12.0000±7.8000
0.5623±0.0946
照射+PF4
10
35.6000±3.6000
43.3000±6.7000
1.4060±0.1104
47.0000±3.9000
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1.1807±0.2730
空白对照
10
36.4000±1.3000
99.0000±21.9000
4.2599±0.5669
71.3000±22.8000
2.0444±0.3372
注：**给药组分别与空白对照组和/或照射(胸/体)组比较，P<0.01；给药组与照射对照组比较P<0.05。
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3 讨论
近10年来陆续发现PF4有调节骨髓的造血功能，主要是抑制骨髓的造血干细胞和各系造血祖细胞，对巨核系造血前体细胞的生长起着抑制增殖和成熟的作用[1]，而对成熟的造血细胞影响较小[2]，并且其抑制作用是可逆的。PF4是通过抑制造血细胞DNA的合成，阻滞细胞在S期[3]，减少5-FU、DNR、ANR等细胞毒剂的化学敏感性，提高IC50值而发挥作用的[4，5]。
本研究中PF4能提高极重度(受照剂量6～10 Gy)辐射损伤小鼠的生存时间和存活率(见表1和图1)。在20～60 μg.kg-1的给药范围内未观察到PF4与辐射防护之间的量效关系。照后第8天，受照小鼠骨髓的有核细胞数、CFU-GM均小于给药组，但外周血细胞未见明显差异，表明PF4主要作用于早期造血干细胞，保护造血前体细胞免受辐射的损伤，而对成熟的血细胞无明显作用。值得注意的是PF4还可减轻辐射对胸腺和脾脏的损伤作用，表现在照射组胸体比和脾体比明显低于给药组，尤以胸体比为甚。
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胸腺属中枢淋巴器官，是体内淋巴细胞生成非常活跃的地方，胸腺皮质部淋巴细胞的有丝分裂率较其它外周淋巴器官高5～10倍。去胸腺动物短时间内可见血和淋巴组织中淋巴细胞明显减少，并失去细胞免疫和对某些抗原的体液反应能力。同时淋巴细胞又是辐射损伤最敏感的细胞。本研究观察到给药组胸腺重量明显高于照射组，提示PF4对胸腺的保护作用 不仅对造血系统并对机体免疫系统都有着非常重要意义，它将有助于辐射损伤小鼠免疫功能的恢复。
辐射对细胞的损伤效应是多方面的，既可诱导细胞的凋亡，又可引起细胞周期阻滞[6]。G2/M期阻滞是辐射对生长着的真核细胞最具特征的效应。本研究发现照射组G2/M期细胞增多，同时伴有凋亡细胞的增多；给药组细胞周期各期与空白对照组相比无明显差异，凋亡细胞仅占0.5%，进一步证实了PF4的辐射防护效应。
近年来虽有许多学者致力于辐射防护剂的研究，但真正用于临床的有效辐射防护剂很少，造血刺激因子也主要是用于促进辐射损伤后骨髓造血细胞的恢复。关于辐射防护用药方面虽有报道，但并未取得突破性进展，大多数药物因毒副作用大而限制了其临床应用。PF4是人体固有的一种细胞因子，我们的研究发现其辐射防护作用是肯定的，它不仅能保护造血前体细胞免受辐射损伤，而且对骨髓以外的淋巴组织也有一定的保护作用，可能成为一种很有发展前景的辐射防护剂。有关PF4辐射防护的最佳给药剂量、给药方式、给药时间以及作用机理值得进一步深入研究。■
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作者简介：杨 岚(1959—)，女，硕士，副教授
参考文献：
[1]Gewirtz AM,Calabretta B,Rucinski B,et al.Inhibition of human megakaryocytopoiesis in vitro by platelet factor 4(PF4)and a sythetic COOH-terminal PF4 pepitide[J].J Clin Invest,1989,83：1477-1486.
[2]Aidoudi S,Guigon M,Lebeurier I,et al.In vivo,effect of platelet factor 4(PF4) and tetrapeptide AcSDKP on haemopoiesis of mice treated with 5-fluorouracil[J].Br J Haematol,1996,94：443-448.
, 百拇医药
[3]Gupta SK,Singh JP.Inhibition of endothelial proliferation by platelet factor 4 involves a unique action on S phase progression[J].J Cell Biol,1994,127：1121.
[4]韩忠朝，蔡英林，Aidoudi S,等.血小板因子4及AcSDKP的造血保护作用研究[J].中华血液学杂志，1999，20：33-35.
[5]Han ZC,Lu M,Li J,et al.Platelet factor 4 and other CXC chemokines support the survival of normal hematopoitic cells and reduce the chemosensitivity of cell to cytoxic agents[J].Blood,1997,89(7)：2328.
[6]Yarnold J.Molecular aspects of cellular responses to radiotherapy[J].Radiother Oncol,1997,44：1-7.
收稿日期：1999-11-02, 百拇医药