兰州地区供血员、静脉毒瘾者和肝炎患者血清输血传播病毒检测及致病性研究
作者：焦建中 刘旺国 李爱月 焦建新 邱瑛锋
单位：焦建中(解放军第一医院，甘肃 兰州 730030)；刘旺国(解放军第一医院，甘肃 兰州 730030)；李爱月(解放军第一医院，甘肃 兰州 730030)；焦建新(解放军第一医院，甘肃 兰州 730030)；邱瑛锋(解放军第一医院，甘肃 兰州 730030)
关键词：实验室诊断；输血传播病毒(TTV)；血清
西北国防医学杂志000307 摘要：目的：研究兰州地区供血员、静脉毒瘾者和肝病患者中输血传播病毒(TTV)的感染状况及致病性。方法：采用套式PCR技术检测120例供血员、56例静脉毒瘾者和74例肝病患者血清中TTV-DNA。结果：TTV-DNA检出率供血员为7.5%(9/120)，静脉毒瘾者为26.8%(15/56)，肝病患者为13.4%(10/74)。10例TTV-DNA阳性的肝病患者中，6例为单一TTV感染，1例与甲型肝炎病毒重叠感染，2例与乙型肝炎病毒重叠感染，1例为乙、庚型肝炎病毒和TTV重叠感染。10例TTV感染者中4例ALT增高，3例呈急性肝炎的临床症状。结论：TTV感染可经血液和胃肠道传播，多呈病毒携带状态，也可单独引起急性肝炎，但致病性较弱。
, 百拇医药
中图分类号：R 446 文献标识码：A 文章编号：1007-8622(2000)03-0181-03
Study on transfusion transmitted virus infection and its pathogenicity in blood donors,intravenous drug-abusers and patients with liver diseases in Lanzhou area
JIAO Jian-zhong,LIU Wang-guo,LI Ai-yue,et al
(The First Hospital,PLA,730030
Abstract:Objective:To study the infection rate and pathogenicity of transfusion transmitted virus(TTV) among blood donors,intravenous drug-abusers and patients with liver diseases in Lanzhou area.Methods:TTV-DNA was detected from sera of 120 blood donors,56 intravenous drug-abusers and 74 patients of liver diseases by nested-PCR technique.Results:TTV-DNA was detected in 9/120(7.5%) blood donors,15/56(26.8%) intravenous drug-abusers and 10/74(13.4%) patients with liver diseases.Among 10 TTV infected patients,there were 6 with simple TTV infection,1 with HAV and TTV co-infection,2 with HBV and TTV co-infection,1 with HBV,HGV and TTV co-infection.Also among these 10 patients,3 were associated with elevated aminotransferase,3 presented clinical symptoms of acute hepatitis.Conclusion:TTV infection can be transmitted through blood or gastrointestinal way,but its pathogenicity is mild.Futher studies should be done to explor its etiology,epidermiology and clinical significance.
, 百拇医药
Key words:Laboratory diagnosis； Transfusion transmitted virus(TTV)； Serum
自1995年美国学者报道了庚型肝炎病毒(HGV/GBV-C)之后[1，2]，大量的临床资料及流行病学研究表明存在着甲-庚型肝炎以外的致病因子[3，4]。1997年10月日本学者Nishizawa等利用代表性差异分析方法(RDA)[5]从一名非甲-戊和庚型输血后患者血清中克隆到一个500 bp的片段(N22)，为一种新的非甲-戊和庚型肝炎病毒且与ALT异常相关，称之为输血传播病毒(transfrsion transmittde virus,TTV)。我们曾报道了兰州地区献血员及静脉毒瘾者血清中TTV感染状况[6]，并首次报道兰州地区存在TTV感染。为了进一步研究兰州地区供血员、静脉毒瘾者和肝病患者中TTV的感染状况及致病性，我们采用nPCR技术对120例供血员、56例静脉毒瘾者和74例肝病患者进行了检测，并对其致病性进行了分析研究，现将结果报告如下。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 标本来源：采自兰州地区供血员120例，静脉毒瘾者56例，1998-12～1999-09住院的肝病患者74例。肝病患者中男54例，女20例，年龄28±22岁，临床诊断为甲型肝炎19例，慢性乙型肝炎27例，肝炎肝硬化12例。诊断符合1995年全国第五次传染病寄生虫病学术会议制定的诊断标准[7]。有输血史者仅1例。上述对象采静脉血2 ml，立即分离血清，分装置-20℃备用，统一检测。
1.2 肝功能与各型肝炎病毒标志物检测：肝功能由本院检验科采用BT-2000型全自动生化分析仪检测。肝炎病毒标志物HBV-M、抗HAV-IgM、抗HCV、抗HDV、抗HEV及抗HGV均由我科实验室检测，采用ELISA法，试剂盒购自天津普生科技有限公司。
1.3 输血传播病毒核酸(TTV-DNA)检测
, 百拇医药
1.3.1 TTV-DNA抽提：取新鲜被检血清100 μl(每份血清均留2管备检)，采用蛋白酶K法提取病毒DNA，室温干燥后以20 μl灭菌注射用水溶解之，煮沸10 min后迅速置冰浴内备用。
1.3.2 套式PCR引物序列为：正义链1，5′—GCAGCAGCATATGGATATGT—3′；反义链1，5′—TGACTGTGCTGCTAAAGCCTCTA—3′；正义链2，5′—CATACATGAATGCCAGGC—3′；反义链2，5′—GTACTTCTTGCTGGTGAAAT—3′。
1.3.3 TTV-DNA检测程序：nPCR检测TTV-DNA，第一轮PCR 50 μl反应体系中含模板DNA 20 μl，一对外引物(正义链1，反义链1)，各20 pmol.L-1，2 mmol.L-1dNTPs 5 μl，Taq酶2 U，10×Taq酶5 μl.L-1，循环参数为94℃30 s，55℃30 s，72℃45 s，共35个循环，最后延伸7 min；其扩增产物长度为270 bp。第二轮PCR 50 μl取第一轮PCR产物作模板，一对内引物(正义链2，反义链2)各20 pmol.L-1，余同第一轮PCR，共25个循环，最后延伸7 min，扩增产物长度为197 bp。
, 百拇医药
1.3.4 重复试验：为保证实验的可靠性，每份待检血清均采用两管重复检测。
1.3.5 PCR产物鉴定：取第二轮PCR扩增产物10 μl，经琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，在50 V电压下电泳，置于紫外线检测仪下观察特定的荧光条带，并与小分子量的DNA Marker作对照分析。
1.4 统计学处理：采用χ2检验。
2 结果
2.1 TTV-DNA阳性率：在120例供血员中为9例(7.5%)，55例静脉毒瘾者中为15例(26.8%)，74例肝病患者中为10例(13.4%)。
供血员、静脉毒瘾者与肝病患者TTV-DNA阳性率比较均P>0.05，显示供血员和静脉毒瘾者与肝病患者的感染无明显差异。
, 百拇医药
2.2 74例肝病患者中有10例TTV-DNA阳性：6例为单一TTV DNA感染，1例与甲肝重叠感染，2例与乙肝重叠感染，1例为乙肝、庚肝和TTV重叠感染。此10例中4例ALT升高，6例为非甲-非庚型肝炎。3例呈急性甲肝的临床表现，3例出现一过性黄疸。4例慢性肝炎肝功正常。TTV感染者中无重症肝炎。
2.3 各型肝病中TTV阳性者的分布情况见表1。
表1 各型肝病中TTV阳性的分布情况 临床分型
例数
TTV DNA
P值
阳性数
%
, 百拇医药 AH
22
3
13.6
CH
29
4
13.8
>0.05
HLC
23
3
13.0
>0.05
, http://www.100md.com
3 讨论
自1997年Nishizawa等报道发现TTV病毒，1998年Gen Bank释放第一个TTV全基因以来，许多国家和地区开展了TTV的研究。有关TTV的特征、传播途径及致病性等问题尚未完全阐明[8]。由于目前无法将TTV分离纯化、培养，亦没有看到病毒形态，其病毒的发现及存在状态完全依靠基因扩增检测特异的病毒核酸。目前，已有学者对TTV的致病性提出了质疑[9]，因此TTV的致病研究是目前的焦点及急待解决的问题。对不同地区、不同人群TTV感染的流行病学调研将有助于TTV致病性的研究。我们利用套式PCR技术对兰州地区献血员、静脉毒瘾者及肝病患者进行了TTV-DNA检测，并首次报道了兰州地区存在有TTV感染。检测结果显示静脉毒瘾者的感染率26.8%(15/56)，明显高于供血员的7.5%(9/12)(χ2+10.48，P<0.01)，肝病患者的感染率与供血员和静脉毒瘾者相比无显著性差异(P>0.05)。在TTV-DNA阳性患者中仅1例有输血史。表明TTV DNA的感染广泛存在，除血液传播外还存在有其它途径的传播。
, 百拇医药
在10例TTV-DNA阳性患者中，重叠感染为40%(4/10)，非甲-非庚型肝炎60%(6/10)。其中30%(3/10)呈急性肝炎的临床表现，30%(3/10)为一过性黄疸，40%(4/10)有ALT异常增高。在120例供血员、56例静脉毒瘾者中检查ALT、AST、TBil均正常。单一TTV感染可引起急性肝炎，其临床表现、酶谱改变与甲肝相似。10例TTV-DNA阳性中无1例重症肝炎，在4例重叠感染者中也无因TTV感染而加重肝脏损害的依据。结果表明虽然TTV-DNA广泛存在，但致病性较弱，多呈病毒携带状态。因此，在抗体检测试验尚未发展到可以确诊既往感染和免疫反应以前，TTV仍被认为是一种自然感染过程[9]。目前，TTV-DNA是否为致病因子，其致病性如何，已引起了关注。Naoumov等报道在各型肝炎中血清阳性率为25%(18/72)与对照血清的检出率(10%)比较无明显差异，多数TTV阳性病例无明显的肝炎生化和组织学证据[10]。虽然有较高感染率但无明显的肝功改变，说明TTV与HGV相似，很可能是一种与人类疾病无明显联系的病毒。
, http://www.100md.com
我们的调查分析，认为在兰州地区TTV-DNA的感染是广泛存在的，除血液传播途径外尚有其它途径的传播可能。TTV的感染多呈病毒携带状态，致病性较弱。有关TTV的特性和致病性尚待进一步深入研究，提示TTV的发现将会引起人们对其他“新”的与人类肝炎有关的病毒或致病因子的重视和深入研究。
作者简介：焦建中(1954—)，女，副主任医师
参考文献：
[1]Linner J,Wanges J Jr,Zhang KZ,et al.Molecular coloning and diseases association lf hepatitis G virus:A transfusion transmissible agent[J].Science,1996,271:505-508.
[2]Leary TP,Muerhoff SA,Simons JN, et al.Sequence and genomic organization of GBVC:A novel member of the flaviviridae associcated with human non A-E hepatitis[J].J Med Virol,1996,48:60-68.
, 百拇医药
[3]Miyakawa Y,Mayumi M.Hepatitis G virus-A true hepatitis virus or an accidental touist[J].N Engl J Med,1997,336:795-796.
[4]聂青和.乙型、庚型及其它新型肝炎病毒研究概况[J].国外医学流行病学传染病学分册，1997，24：19-23.
[5]Nishizawa T,Okamoto H,Konishi K,et al.A novel DNA(TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknon etiology [J].Biochem Biophy Res Commun,1997，241:92-97.
[6]刘旺国，聂青和，李爱月，等.兰州地区献血员及静脉毒瘾者血清中TT病毒核酸检测及意义[J].实用肝脏病杂志，1999，4：141-142.
, http://www.100md.com
[7]病毒性肝炎防治方案(试行)[J].中华传染病杂志，1995，13：241-247.
[8]聂青和.TT病毒的发现及研究概况[J].实用肝脏病杂志，1998，3：180-181.
[9]焦建中，周永兴.TT病毒的研究进展[J].西北国防医学杂志，2000，21(2)：144-145.
[10]Naurmov NV,Petrova ED,Thomas MG,et al.Presence of a newly described human DNA virus(TTV)in patients with liver disease[J].Lancet,1998,352:195-197.
收稿日期：1999-12-18, 百拇医药
单位：焦建中(解放军第一医院，甘肃 兰州 730030)；刘旺国(解放军第一医院，甘肃 兰州 730030)；李爱月(解放军第一医院，甘肃 兰州 730030)；焦建新(解放军第一医院，甘肃 兰州 730030)；邱瑛锋(解放军第一医院，甘肃 兰州 730030)
关键词：实验室诊断；输血传播病毒(TTV)；血清
西北国防医学杂志000307 摘要：目的：研究兰州地区供血员、静脉毒瘾者和肝病患者中输血传播病毒(TTV)的感染状况及致病性。方法：采用套式PCR技术检测120例供血员、56例静脉毒瘾者和74例肝病患者血清中TTV-DNA。结果：TTV-DNA检出率供血员为7.5%(9/120)，静脉毒瘾者为26.8%(15/56)，肝病患者为13.4%(10/74)。10例TTV-DNA阳性的肝病患者中，6例为单一TTV感染，1例与甲型肝炎病毒重叠感染，2例与乙型肝炎病毒重叠感染，1例为乙、庚型肝炎病毒和TTV重叠感染。10例TTV感染者中4例ALT增高，3例呈急性肝炎的临床症状。结论：TTV感染可经血液和胃肠道传播，多呈病毒携带状态，也可单独引起急性肝炎，但致病性较弱。
, 百拇医药
中图分类号：R 446 文献标识码：A 文章编号：1007-8622(2000)03-0181-03
Study on transfusion transmitted virus infection and its pathogenicity in blood donors,intravenous drug-abusers and patients with liver diseases in Lanzhou area
JIAO Jian-zhong,LIU Wang-guo,LI Ai-yue,et al
(The First Hospital,PLA,730030
Abstract:Objective:To study the infection rate and pathogenicity of transfusion transmitted virus(TTV) among blood donors,intravenous drug-abusers and patients with liver diseases in Lanzhou area.Methods:TTV-DNA was detected from sera of 120 blood donors,56 intravenous drug-abusers and 74 patients of liver diseases by nested-PCR technique.Results:TTV-DNA was detected in 9/120(7.5%) blood donors,15/56(26.8%) intravenous drug-abusers and 10/74(13.4%) patients with liver diseases.Among 10 TTV infected patients,there were 6 with simple TTV infection,1 with HAV and TTV co-infection,2 with HBV and TTV co-infection,1 with HBV,HGV and TTV co-infection.Also among these 10 patients,3 were associated with elevated aminotransferase,3 presented clinical symptoms of acute hepatitis.Conclusion:TTV infection can be transmitted through blood or gastrointestinal way,but its pathogenicity is mild.Futher studies should be done to explor its etiology,epidermiology and clinical significance.
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Key words:Laboratory diagnosis； Transfusion transmitted virus(TTV)； Serum
自1995年美国学者报道了庚型肝炎病毒(HGV/GBV-C)之后[1，2]，大量的临床资料及流行病学研究表明存在着甲-庚型肝炎以外的致病因子[3，4]。1997年10月日本学者Nishizawa等利用代表性差异分析方法(RDA)[5]从一名非甲-戊和庚型输血后患者血清中克隆到一个500 bp的片段(N22)，为一种新的非甲-戊和庚型肝炎病毒且与ALT异常相关，称之为输血传播病毒(transfrsion transmittde virus,TTV)。我们曾报道了兰州地区献血员及静脉毒瘾者血清中TTV感染状况[6]，并首次报道兰州地区存在TTV感染。为了进一步研究兰州地区供血员、静脉毒瘾者和肝病患者中TTV的感染状况及致病性，我们采用nPCR技术对120例供血员、56例静脉毒瘾者和74例肝病患者进行了检测，并对其致病性进行了分析研究，现将结果报告如下。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 标本来源：采自兰州地区供血员120例，静脉毒瘾者56例，1998-12～1999-09住院的肝病患者74例。肝病患者中男54例，女20例，年龄28±22岁，临床诊断为甲型肝炎19例，慢性乙型肝炎27例，肝炎肝硬化12例。诊断符合1995年全国第五次传染病寄生虫病学术会议制定的诊断标准[7]。有输血史者仅1例。上述对象采静脉血2 ml，立即分离血清，分装置-20℃备用，统一检测。
1.2 肝功能与各型肝炎病毒标志物检测：肝功能由本院检验科采用BT-2000型全自动生化分析仪检测。肝炎病毒标志物HBV-M、抗HAV-IgM、抗HCV、抗HDV、抗HEV及抗HGV均由我科实验室检测，采用ELISA法，试剂盒购自天津普生科技有限公司。
1.3 输血传播病毒核酸(TTV-DNA)检测
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1.3.1 TTV-DNA抽提：取新鲜被检血清100 μl(每份血清均留2管备检)，采用蛋白酶K法提取病毒DNA，室温干燥后以20 μl灭菌注射用水溶解之，煮沸10 min后迅速置冰浴内备用。
1.3.2 套式PCR引物序列为：正义链1，5′—GCAGCAGCATATGGATATGT—3′；反义链1，5′—TGACTGTGCTGCTAAAGCCTCTA—3′；正义链2，5′—CATACATGAATGCCAGGC—3′；反义链2，5′—GTACTTCTTGCTGGTGAAAT—3′。
1.3.3 TTV-DNA检测程序：nPCR检测TTV-DNA，第一轮PCR 50 μl反应体系中含模板DNA 20 μl，一对外引物(正义链1，反义链1)，各20 pmol.L-1，2 mmol.L-1dNTPs 5 μl，Taq酶2 U，10×Taq酶5 μl.L-1，循环参数为94℃30 s，55℃30 s，72℃45 s，共35个循环，最后延伸7 min；其扩增产物长度为270 bp。第二轮PCR 50 μl取第一轮PCR产物作模板，一对内引物(正义链2，反义链2)各20 pmol.L-1，余同第一轮PCR，共25个循环，最后延伸7 min，扩增产物长度为197 bp。
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1.3.4 重复试验：为保证实验的可靠性，每份待检血清均采用两管重复检测。
1.3.5 PCR产物鉴定：取第二轮PCR扩增产物10 μl，经琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，在50 V电压下电泳，置于紫外线检测仪下观察特定的荧光条带，并与小分子量的DNA Marker作对照分析。
1.4 统计学处理：采用χ2检验。
2 结果
2.1 TTV-DNA阳性率：在120例供血员中为9例(7.5%)，55例静脉毒瘾者中为15例(26.8%)，74例肝病患者中为10例(13.4%)。
供血员、静脉毒瘾者与肝病患者TTV-DNA阳性率比较均P>0.05，显示供血员和静脉毒瘾者与肝病患者的感染无明显差异。
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2.2 74例肝病患者中有10例TTV-DNA阳性：6例为单一TTV DNA感染，1例与甲肝重叠感染，2例与乙肝重叠感染，1例为乙肝、庚肝和TTV重叠感染。此10例中4例ALT升高，6例为非甲-非庚型肝炎。3例呈急性甲肝的临床表现，3例出现一过性黄疸。4例慢性肝炎肝功正常。TTV感染者中无重症肝炎。
2.3 各型肝病中TTV阳性者的分布情况见表1。
表1 各型肝病中TTV阳性的分布情况 临床分型
例数
TTV DNA
P值
阳性数
%
, 百拇医药 AH
22
3
13.6
CH
29
4
13.8
>0.05
HLC
23
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13.0
>0.05
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3 讨论
自1997年Nishizawa等报道发现TTV病毒，1998年Gen Bank释放第一个TTV全基因以来，许多国家和地区开展了TTV的研究。有关TTV的特征、传播途径及致病性等问题尚未完全阐明[8]。由于目前无法将TTV分离纯化、培养，亦没有看到病毒形态，其病毒的发现及存在状态完全依靠基因扩增检测特异的病毒核酸。目前，已有学者对TTV的致病性提出了质疑[9]，因此TTV的致病研究是目前的焦点及急待解决的问题。对不同地区、不同人群TTV感染的流行病学调研将有助于TTV致病性的研究。我们利用套式PCR技术对兰州地区献血员、静脉毒瘾者及肝病患者进行了TTV-DNA检测，并首次报道了兰州地区存在有TTV感染。检测结果显示静脉毒瘾者的感染率26.8%(15/56)，明显高于供血员的7.5%(9/12)(χ2+10.48，P<0.01)，肝病患者的感染率与供血员和静脉毒瘾者相比无显著性差异(P>0.05)。在TTV-DNA阳性患者中仅1例有输血史。表明TTV DNA的感染广泛存在，除血液传播外还存在有其它途径的传播。
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在10例TTV-DNA阳性患者中，重叠感染为40%(4/10)，非甲-非庚型肝炎60%(6/10)。其中30%(3/10)呈急性肝炎的临床表现，30%(3/10)为一过性黄疸，40%(4/10)有ALT异常增高。在120例供血员、56例静脉毒瘾者中检查ALT、AST、TBil均正常。单一TTV感染可引起急性肝炎，其临床表现、酶谱改变与甲肝相似。10例TTV-DNA阳性中无1例重症肝炎，在4例重叠感染者中也无因TTV感染而加重肝脏损害的依据。结果表明虽然TTV-DNA广泛存在，但致病性较弱，多呈病毒携带状态。因此，在抗体检测试验尚未发展到可以确诊既往感染和免疫反应以前，TTV仍被认为是一种自然感染过程[9]。目前，TTV-DNA是否为致病因子，其致病性如何，已引起了关注。Naoumov等报道在各型肝炎中血清阳性率为25%(18/72)与对照血清的检出率(10%)比较无明显差异，多数TTV阳性病例无明显的肝炎生化和组织学证据[10]。虽然有较高感染率但无明显的肝功改变，说明TTV与HGV相似，很可能是一种与人类疾病无明显联系的病毒。
, http://www.100md.com
我们的调查分析，认为在兰州地区TTV-DNA的感染是广泛存在的，除血液传播途径外尚有其它途径的传播可能。TTV的感染多呈病毒携带状态，致病性较弱。有关TTV的特性和致病性尚待进一步深入研究，提示TTV的发现将会引起人们对其他“新”的与人类肝炎有关的病毒或致病因子的重视和深入研究。
作者简介：焦建中(1954—)，女，副主任医师
参考文献：
[1]Linner J,Wanges J Jr,Zhang KZ,et al.Molecular coloning and diseases association lf hepatitis G virus:A transfusion transmissible agent[J].Science,1996,271:505-508.
[2]Leary TP,Muerhoff SA,Simons JN, et al.Sequence and genomic organization of GBVC:A novel member of the flaviviridae associcated with human non A-E hepatitis[J].J Med Virol,1996,48:60-68.
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[3]Miyakawa Y,Mayumi M.Hepatitis G virus-A true hepatitis virus or an accidental touist[J].N Engl J Med,1997,336:795-796.
[4]聂青和.乙型、庚型及其它新型肝炎病毒研究概况[J].国外医学流行病学传染病学分册，1997，24：19-23.
[5]Nishizawa T,Okamoto H,Konishi K,et al.A novel DNA(TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknon etiology [J].Biochem Biophy Res Commun,1997，241:92-97.
[6]刘旺国，聂青和，李爱月，等.兰州地区献血员及静脉毒瘾者血清中TT病毒核酸检测及意义[J].实用肝脏病杂志，1999，4：141-142.
, http://www.100md.com
[7]病毒性肝炎防治方案(试行)[J].中华传染病杂志，1995，13：241-247.
[8]聂青和.TT病毒的发现及研究概况[J].实用肝脏病杂志，1998，3：180-181.
[9]焦建中，周永兴.TT病毒的研究进展[J].西北国防医学杂志，2000，21(2)：144-145.
[10]Naurmov NV,Petrova ED,Thomas MG,et al.Presence of a newly described human DNA virus(TTV)in patients with liver disease[J].Lancet,1998,352:195-197.
收稿日期：1999-12-18, 百拇医药