反义BMP2逆转录病毒表达载体的构建及鉴定
作者：晏伟 岳文 朱峰 杨连甲
单位：晏伟(第四军医大学:基础部病理学教研室，陕西 西安 710033)；岳文(第四军医大学:秦都口腔医学院病理科，陕西 西安 710033)；杨连甲(第四军医大学:秦都口腔医学院病理科，陕西 西安 710033)；朱峰(第四军医大学:基础部生物化学教研室，陕西 西安 710033)
关键词：骨形成蛋白；逆转录病毒载体
第四军医大学学报000449 中图号：R753 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)04-S0059-01
0 引言
骨形成蛋白(Bone Morphogenetic Protein, 简称BMP)2在骨肉瘤中有较高的表达并影响骨肉瘤的生物学活性，引起骨肉瘤的预后不良. 为了进一步研究BMP2在骨肉瘤细胞中的作用机制并为探讨骨肉瘤反义核酸技术治疗的可行性，我们构建了反义BMP2的逆转录病毒表达载体.
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1 材料和方法
1.1 材料 含BMP2的PSP64质粒由美国基因研究所Dr. Wonzey 馈赠，由1.64 kb的 人BMP2 cDNA克隆至PSP64的EcoRI位点而成. PGEM-3Z(+) (2.74 kb, 含EcoRI， SmalI和SalI 位点) 和逆转录病毒表达载体PDOR(6.5 kb, 含EcoRI和SalI位点)由 本校生物化学教研室朱峰博士馈赠.
1.2 BMP2 cDNA的亚克隆 SalI和SmalI 酶切PSP64 -BMP2质粒，回收10 00 bp的片断，SalI和Sm alI酶切PGEM-3Z(+)质粒，回收线性化片断. 回收片断经T4 DNA连接酶连结，转化感受态细胞，铺板挑取菌落. 提取质粒，SalI和EcoRI酶切鉴定，回收1000 bp的片断.
1.3 BMP2 cDNA的克隆 SalI和EcoRI酶切PDOR质粒，回收线性片断，T4 DN A连接酶连接线性化的PDOR质粒和用SalI和EcoRI酶切下来的重组的PGEM-3Z(+)-BMP2上的1000 bp的片断. 回收片断经T4 DNA连接酶连结，转化DH-5α感受态细胞，铺板挑取菌落. 提取质粒，SalI和EcoRI酶切鉴定.
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2 结果
2.1 亚克隆PGEM-3Z(+)-BMP2的鉴定 PSP64-BMP2质粒经SalI和 Sma lI酶切后得到1000 bp的片断，和PGEM-3Z(+)质粒线性化片断连接后成功转化DH-5α感受 态细胞. 挑取质粒经SalI 和EcoRI酶切鉴定后得到1000 bp的片断. 证明亚克隆成 功(图 1).
2.2逆转录病毒表达载体(命名为PDOR-AB)的鉴定 回收的1000 bp的亚 克隆片断和线性化的PDOR质粒连接后，成功转化DH-5α感受态细胞. 挑取质粒经SalI 和EcoRI酶切鉴定后得到1000 bp的片断(图 1).
图 1 PDOR-AB酶切鉴定
a:PCR marker; b:EcoRI+SalI酶切PDOR-AB质粒； c:EcoRI+SalI 酶切PGEM-3Z(+)-BMP2质粒.
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3 讨论
研究表明BMP2在机体骨肉瘤细胞中有丰富的表达并影响肿瘤的生物学特性和预后：BMP(+)组术前化疗效果不佳且有83%的肿瘤发生肺转移，而BMP(-)组肺转移率为44%，5 a生存率亦较BMP(+)组高. 作者检测骨肉瘤组织中BMP表达及基因扩增与肿瘤细胞增殖细胞核抗原(PCNA)表达之间的关系，发现有BMP蛋白表达及BMP2基因扩增的肿瘤细胞的增殖活性明显高于阴性组，推测BMP2作用于肿瘤细胞引起其增殖活性的增高而影响肿瘤的生物学行为. 以上结果提示我们可以通过阻断或减弱BMP2的表达来消除其对骨肉瘤预后的不良影响. 其中一种方法就是应用反义核酸技术，构建互补于靶基因(BMP2基因)mRNA反义核酸分子(反义cDNA真核表达载体)，利用转染技术，将此反义cDNA表达载体转入肿瘤细胞，对其BMP2 mRNA进行封闭，阻断或减少BMP2的表达. PDOR是一种逆转录病毒载体，它可以整合进入宿主细胞基因组，表达外源基因，PDOR-AB的转录物可与内源性的BMP2的mRNA3′端的编码成熟肽部分的1 kb的碱基杂交，阻断BMP2的在骨肉瘤细胞中的表达. 我们成功构建BMP2的反义cDNA真核表达载体，为下一步的研究打下基础.
作者简介：晏伟(1970-)，男(汉族)，江西省峡江人. 硕士,助教. Tel. (029)3374543
收稿日期:1999-02-28; 修回日期:1999-08-12, 百拇医药
单位：晏伟(第四军医大学:基础部病理学教研室，陕西 西安 710033)；岳文(第四军医大学:秦都口腔医学院病理科，陕西 西安 710033)；杨连甲(第四军医大学:秦都口腔医学院病理科，陕西 西安 710033)；朱峰(第四军医大学:基础部生物化学教研室，陕西 西安 710033)
关键词：骨形成蛋白；逆转录病毒载体
第四军医大学学报000449 中图号：R753 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)04-S0059-01
0 引言
骨形成蛋白(Bone Morphogenetic Protein, 简称BMP)2在骨肉瘤中有较高的表达并影响骨肉瘤的生物学活性，引起骨肉瘤的预后不良. 为了进一步研究BMP2在骨肉瘤细胞中的作用机制并为探讨骨肉瘤反义核酸技术治疗的可行性，我们构建了反义BMP2的逆转录病毒表达载体.
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1 材料和方法
1.1 材料 含BMP2的PSP64质粒由美国基因研究所Dr. Wonzey 馈赠，由1.64 kb的 人BMP2 cDNA克隆至PSP64的EcoRI位点而成. PGEM-3Z(+) (2.74 kb, 含EcoRI， SmalI和SalI 位点) 和逆转录病毒表达载体PDOR(6.5 kb, 含EcoRI和SalI位点)由 本校生物化学教研室朱峰博士馈赠.
1.2 BMP2 cDNA的亚克隆 SalI和SmalI 酶切PSP64 -BMP2质粒，回收10 00 bp的片断，SalI和Sm alI酶切PGEM-3Z(+)质粒，回收线性化片断. 回收片断经T4 DNA连接酶连结，转化感受态细胞，铺板挑取菌落. 提取质粒，SalI和EcoRI酶切鉴定，回收1000 bp的片断.
1.3 BMP2 cDNA的克隆 SalI和EcoRI酶切PDOR质粒，回收线性片断，T4 DN A连接酶连接线性化的PDOR质粒和用SalI和EcoRI酶切下来的重组的PGEM-3Z(+)-BMP2上的1000 bp的片断. 回收片断经T4 DNA连接酶连结，转化DH-5α感受态细胞，铺板挑取菌落. 提取质粒，SalI和EcoRI酶切鉴定.
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2 结果
2.1 亚克隆PGEM-3Z(+)-BMP2的鉴定 PSP64-BMP2质粒经SalI和 Sma lI酶切后得到1000 bp的片断，和PGEM-3Z(+)质粒线性化片断连接后成功转化DH-5α感受 态细胞. 挑取质粒经SalI 和EcoRI酶切鉴定后得到1000 bp的片断. 证明亚克隆成 功(图 1).
2.2逆转录病毒表达载体(命名为PDOR-AB)的鉴定 回收的1000 bp的亚 克隆片断和线性化的PDOR质粒连接后，成功转化DH-5α感受态细胞. 挑取质粒经SalI 和EcoRI酶切鉴定后得到1000 bp的片断(图 1).
图 1 PDOR-AB酶切鉴定
a:PCR marker; b:EcoRI+SalI酶切PDOR-AB质粒； c:EcoRI+SalI 酶切PGEM-3Z(+)-BMP2质粒.
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3 讨论
研究表明BMP2在机体骨肉瘤细胞中有丰富的表达并影响肿瘤的生物学特性和预后：BMP(+)组术前化疗效果不佳且有83%的肿瘤发生肺转移，而BMP(-)组肺转移率为44%，5 a生存率亦较BMP(+)组高. 作者检测骨肉瘤组织中BMP表达及基因扩增与肿瘤细胞增殖细胞核抗原(PCNA)表达之间的关系，发现有BMP蛋白表达及BMP2基因扩增的肿瘤细胞的增殖活性明显高于阴性组，推测BMP2作用于肿瘤细胞引起其增殖活性的增高而影响肿瘤的生物学行为. 以上结果提示我们可以通过阻断或减弱BMP2的表达来消除其对骨肉瘤预后的不良影响. 其中一种方法就是应用反义核酸技术，构建互补于靶基因(BMP2基因)mRNA反义核酸分子(反义cDNA真核表达载体)，利用转染技术，将此反义cDNA表达载体转入肿瘤细胞，对其BMP2 mRNA进行封闭，阻断或减少BMP2的表达. PDOR是一种逆转录病毒载体，它可以整合进入宿主细胞基因组，表达外源基因，PDOR-AB的转录物可与内源性的BMP2的mRNA3′端的编码成熟肽部分的1 kb的碱基杂交，阻断BMP2的在骨肉瘤细胞中的表达. 我们成功构建BMP2的反义cDNA真核表达载体，为下一步的研究打下基础.
作者简介：晏伟(1970-)，男(汉族)，江西省峡江人. 硕士,助教. Tel. (029)3374543
收稿日期:1999-02-28; 修回日期:1999-08-12, 百拇医药