霍奇金病组织中的淋巴细胞是非反应性的
作者：黄高昇 闫庆国 王哲 郭英 张晓晖
单位：黄高昇(第四军医大学基础部病理学教研室，陕西 西安 710033)；闫庆国(第四军医大学基础部病理学教研室，陕西 西安 710033)；王哲(第四军医大学基础部病理学教研室，陕西 西安 710033)；郭英(第四军医大学基础部病理学教研室，陕西 西安 710033)；张晓晖(第四军医大学基础部病理学教研室，陕西 西安 710033)
关键词：关键词：霍奇金病；淋巴细胞；增生活性
第四军医大学学报000550 摘 要： 目的 淋巴细胞是霍奇金病组织的主要细胞成分，长期以来一直认为它们是反应性的. 我们测定它们的增生活性并与反应性增生淋巴结相对比，以便认识上述淋巴细胞的增生性质. 方法 应用Ki67标记指数法测定了13例霍奇金病及10例反应性增生淋巴结新鲜标本的增生活性. 结果 9例混合细胞型霍奇金病的Ki67平均标记指数为8.4%，3例结节硬化型为4.5%，反应性增生淋巴结为3.4%. 统计学分析表明，前两者的Ki67标记指数与后者相比，均有非常显著的差异(分别为χ12=215.9, P<0.001及χ22=6.92，P<0.01)，且混合细胞型显著高于结节硬化型(χ32=49.8, P<0.001). 结论 霍奇金病病变组织尤其是混合细胞型中的淋巴细胞Ki67标记指数显著升高，表明它们可能不是反应性淋巴细胞.
, http://www.100md.com
中图号：R733.1 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)05-S0098-03
Lymphoid cells are not reactive in the tissue of mixed cellularity Hodgkin's disease
HUANG Gao-Sheng, YAN Qin-Guo, WANG Zhe, GUO Ying, ZHANG Xiao-Hui
(Department of Pathology, Faculty of Preclinical Medicine, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
Abstract: AIM It was believed for a long time that the lymphoid cells, major component in the tissue of mixed cellularity Hodgkin's disease or nodular sclerosing type, are reactive. This study wants to know the nature of lymphoid cells in the tissue of Hodgkin's disease, based on estimating proliferative activity. METHODS By using Ki67 labelling index, proliferative activity of 13 cases of Hodgkin's disease including 9 cases of mixed cellularity type, 3 cases of nodular sclerosing type and one case of lymphocyte predominant type was esti-mated and 10 cases of lymphadenitis used as control group. RESULTS The mean of Ki67 labelling index of both mixed cellularity and nodular sclerosing type was significantly higher than that of reactive group, especially for the former group (P<0.001), and meanwhile there was a significant difference between the two tumor groups (P<0.001). Compared with proliferative activity of non-Hodgkin's lymphoma (NHL) determined by same method in our another paper, proliferative activity of the lymphocytes in the tissue of mixed cellularity Hodgkin's disease was very similar to that of some low grade NHL. CONCLUSION The lymphoid cells in the tissue of Hodgkin's disease especially in mixed cellularity type, were quite probably not reactive.
, 百拇医药
Keywords: Hodgkin's disease; lymphoid cell; proliferative activity
0 引言
现已明确霍奇金病(Hodgkin's disease, HD)是淋巴造血系统的恶性肿瘤性疾病，并且公认其病变组织中的RS (Reed-Sternberg)细胞、HD细胞及其变体细胞是肿瘤细胞. 因此人们一直对其起源与形成进行着研究[1,2]. 然而，十分有趣的是，RS及其变体细胞在HD病变组织中仅占2%[3]，病变组织中尚有大量淋巴细胞及数量不等的嗜酸性细胞、组织细胞及浆细胞，并认为它们均是反应性细胞[1-3]. 如此少的肿瘤细胞为何可致患者病变组织形成大的肿块？作为其中主要成分的淋巴细胞的增生活性(proliferative activity, PA)如何？我们用Ki67标记指数法(Ki67 labeling index, Ki67 LI), 主要研究了混合细胞型及结节硬化型HD病变组织的增生活性，并且发现病变组织中的淋巴细胞具有低度恶性非霍奇金淋巴瘤相近的增生活性，这对认识它们的增生本质及其在HD发生机制中的作用具有重要意义.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 HD(混合细胞性9例，结节硬化性3例，淋巴细胞为主型1例)新鲜淋巴结标本13例及用于对照的反应性增生淋巴结新鲜标本10例均取自德国Kiel大学病理研究所. 上述新鲜标本一半用于常规固定,HE染色切片进行病理诊断，另一半用恒冷切片机制成6 μm厚冰冻切片,进行Ki67 LI研究.
1.2 方法 Ki67单抗来自Kiel大学病理研究所，用常规间接免疫酶法进行染色，辣根过氧化物酶呈色，苏木精衬核. 设PBS (phosphate buffered saline)及正常鼠血清替代一抗作为阴性对照. 用目镜中放置方格测微器观察，在病变组织内随机分别计数10个高倍视野中固定方格内总数1000个Ki67阳性及阴性细胞，计算每例HD的Ki67 LI及每组病例的平均Ki67 LI，即：
Ki67 LI=(Ki67阳性细胞)/(Ki67阳性细胞+Ki67阴性细胞)×100%
, 百拇医药
统计学处理： 用χ2连续校正检验进行统计学分析.
2 结果
Ki67阳性细胞胞核呈棕黄色反应，有的细胞核仁结构染色更强. 阳性细胞绝大多数为体积小的圆形胞核，或呈均质棕黄色或在其背景上有较多大小不等的深棕色颗粒. 两种细胞均应视为阳性细胞而计入. 随机视野观察可见到的阳性大细胞机会极少，所观察的HD病例中仅有2例偶可见到RS细胞样核阳性细胞(Fig 1). 两种阴性对照均未见胞核呈阳性反应. 粒细胞可见胞质呈颗粒性非特异性染色，但核为阴性，并可见其分叶核，因此不会被认为是Ki67阳性细胞被计入. 不同亚型的HD病肿瘤组织平均Ki67 LI分别为：9例混合细胞型为8.4%, 3例结节硬化型为4.5%. 10例反应性增生淋巴结为3.4%. 经χ2连续校正检验处理，混合细胞型及结节硬化型HD病的Ki67 LI非常显著高于反应性增生淋巴结弥漫区域的标记指数(分别为χ12=215.9, P<0.001；χ22=6.92，P<0.01). 淋巴细胞为主型只有1例，未做统计学分析. 另外，混合细胞型HD的Ki67 LI也显著高于结节硬化型Ki67 LI(χ32=49.8, P<0.001).
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3 讨论
HD是人类常见的淋巴造血组织恶性肿瘤. 起初，因其病变组织中浸润细胞的多形性，如包括嗜酸细胞、中性细胞、浆细胞及组织细胞等，因而在相当长的时间内认为其为炎性病变. 然而，经过长期研究与临床观察，已经明确并公认其肿瘤性质，并公认其中的RS，HD及其变体细胞是HD肿瘤组织的肿瘤细胞[1,2]. 因其具有十分特别的细胞形态，并决定HD的诊断，所以其细胞起源与成因一直是世界范围内的研究热点之一. 然而令人十分不解的是，在HD肿瘤组织中仅占极少数的RS及其变体细胞，为何能引起淋巴结的异常肿大？这对HD的发病机制的确是个很有意义的问题.
原位测定肿瘤增生活性，在肿瘤病理生物学研究中具有重要作用，不仅可用于肿瘤分级，甚至可用于判断肿瘤良恶性与转移倾向[4]. Ki67 LI便是公认的测定肿瘤增生活性的有效方法之一. 然而，在HD病增生活性的研究中，结果不一[5,6]. Abele等[5]称RS和HD细胞是增生组分的主要细胞，但Jansen等[6]却认为只有20%的RS和HD细胞表达Ki67. 假如按照这一比例，即使RS和HD细胞占到5%(实际只有2% ，见上)，那么观察到Ki67阳性的机会也仅有1%. 可见随机观察计数时见到Ki67阳性的RS和HD细胞机会是极少的.
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图1 霍奇金病淋巴组织的Ki67免疫染色
Fig 1 Ki67 immunostaining in the lymphoid tissue of Hodgkin's disease ×600
A Ki67-positive RS cell located in the center of field and several lymphoid cells around it are also Ki67-positive. Indirect immunoperoxidase
由于HD病肿瘤组织中细胞的多型性，要特别准确研究其中淋巴细胞的增生活性是比较困难的. 但是，由于①我们用反应性增生淋巴结作为非瘤性增生的对照，其中也包括了较多组织细胞、浆细胞及不同数量的粒细胞等，但它们的Ki67 LI并不高；②如前所述，在随机视野观察计数时，所遇到的体积大或双核的阳性细胞极少，因此，观察计数所得的Ki67 LI应该能大致反映混合细胞型及结节硬化型HD病变组织中的淋巴细胞的增生活性.
, 百拇医药
本结果表明，混合细胞型及结节硬化型HD中，平均Ki67 LI与反应性增生淋巴结相比，都有非常明显的差别，且混合细胞型HD的平均Ki67 LI又比结节硬化型显著为高. 若与我们以往用相同方法对非霍奇金淋巴瘤的增生活性相比[7]，混合细胞型HD中的淋巴细胞Ki67 LI与低度恶性非霍奇金淋巴瘤具有相近的增生活性，从而提示那些传统认为是反应性的淋巴细胞可能具有肿瘤性质. 最近，有人用原位研究发现了HD组织中淋巴细胞的染色体异常[8]，为认识其肿瘤性质提供了另一方面依据. 另外，我们的研究对混合细胞型HD与结节硬化型HD组织学分型也提供了客观依据. 临床研究表明混合细胞型的预后较差，通过Ki67 LI测定其有较高增生活性也是一个客观证据. 关于淋巴细胞为主型中的淋巴细胞已经证明其具有肿瘤性质，我们所测1例Ki67 LI也较高，符合文献规律，同时也说明方法学的可信性.
总之，我们用Ki67 LI首次明确了混合细胞型与结节硬化型HD淋巴细胞具有与低度恶性非霍奇金淋巴瘤同等的增生活性，对传统认为它们是反应性淋巴细胞的概念提出了疑问，为认识HD发病机制研究开辟了新思路.
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致 谢 我校解剖学教研室原悦萍女士协助制作照片.
作者简介：黄高升曰(1945-)， 男(汉族)， 河南省偃师市人. 教授， 博士生导师. Tel. (029)3374538
参考文献：
[1] Hsu SM, Hsu PL. The nature of Reed-sternberg cells: Phenotype, genotype, and other properties [J]. Crit Rev Oncog, 1994;5(2-3):213-245.
[2] Kadin ME. Pathology of Hodgkin's disease [J]. Curr Opin Oncol， 1994;6(5):456-463.
[3] Haluska FG, Brufsky AM, Canellos GP. The cellular biology of the Reed-sternberg cell [J]. Blood, 1994;84(4):1005-1019.
, 百拇医药
[4] Van Diest P, Brugal G, Baak JPA. Proliferation markers in tumours: Interpretation and clinical value [J]. J Clin Pathol, 1998;51(10):716-724.
[5] Abele MC, Valente G, Kerim S et al. Significance of cell proliferation index in assessing histological prognostic categories in Hodgkin's disease. An immunohistochemical study with Ki67 and MIB-1 monoclonal antibodies [J]. Haematologica, 1997;82(3):281-285.
[6] Jansen MP, Machies BM, Hopman AH et al. Comparison of A and B-type lamin expression in reactive lymph nodes and nodular sclerosing Hodgkin's disease [J]. Histopathology, 1997;31(4):304-312.
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[7] Huang GS, Feller AC, Lennert K. Correlation between the number of mitotic frigures and the percentage of Ki67-positive cells in non-Hodgkin's lymphomas [J]. Chin Med Sci J, 1994;9(1):16-19.
[8] Jansen MPHM, Hopman AHN, Haesevoets AM et al. Chromosomal abnormalities in Hodgkin's disease are not restricted to Hodgkin/Reed-sternberg cells [J]. J Pathol, 1998; 185(2):145-152.
收稿日期：2000-04-11； 修回日期：2000-04-19, 百拇医药
单位：黄高昇(第四军医大学基础部病理学教研室，陕西 西安 710033)；闫庆国(第四军医大学基础部病理学教研室，陕西 西安 710033)；王哲(第四军医大学基础部病理学教研室，陕西 西安 710033)；郭英(第四军医大学基础部病理学教研室，陕西 西安 710033)；张晓晖(第四军医大学基础部病理学教研室，陕西 西安 710033)
关键词：关键词：霍奇金病；淋巴细胞；增生活性
第四军医大学学报000550 摘 要： 目的 淋巴细胞是霍奇金病组织的主要细胞成分，长期以来一直认为它们是反应性的. 我们测定它们的增生活性并与反应性增生淋巴结相对比，以便认识上述淋巴细胞的增生性质. 方法 应用Ki67标记指数法测定了13例霍奇金病及10例反应性增生淋巴结新鲜标本的增生活性. 结果 9例混合细胞型霍奇金病的Ki67平均标记指数为8.4%，3例结节硬化型为4.5%，反应性增生淋巴结为3.4%. 统计学分析表明，前两者的Ki67标记指数与后者相比，均有非常显著的差异(分别为χ12=215.9, P<0.001及χ22=6.92，P<0.01)，且混合细胞型显著高于结节硬化型(χ32=49.8, P<0.001). 结论 霍奇金病病变组织尤其是混合细胞型中的淋巴细胞Ki67标记指数显著升高，表明它们可能不是反应性淋巴细胞.
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中图号：R733.1 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)05-S0098-03
Lymphoid cells are not reactive in the tissue of mixed cellularity Hodgkin's disease
HUANG Gao-Sheng, YAN Qin-Guo, WANG Zhe, GUO Ying, ZHANG Xiao-Hui
(Department of Pathology, Faculty of Preclinical Medicine, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
Abstract: AIM It was believed for a long time that the lymphoid cells, major component in the tissue of mixed cellularity Hodgkin's disease or nodular sclerosing type, are reactive. This study wants to know the nature of lymphoid cells in the tissue of Hodgkin's disease, based on estimating proliferative activity. METHODS By using Ki67 labelling index, proliferative activity of 13 cases of Hodgkin's disease including 9 cases of mixed cellularity type, 3 cases of nodular sclerosing type and one case of lymphocyte predominant type was esti-mated and 10 cases of lymphadenitis used as control group. RESULTS The mean of Ki67 labelling index of both mixed cellularity and nodular sclerosing type was significantly higher than that of reactive group, especially for the former group (P<0.001), and meanwhile there was a significant difference between the two tumor groups (P<0.001). Compared with proliferative activity of non-Hodgkin's lymphoma (NHL) determined by same method in our another paper, proliferative activity of the lymphocytes in the tissue of mixed cellularity Hodgkin's disease was very similar to that of some low grade NHL. CONCLUSION The lymphoid cells in the tissue of Hodgkin's disease especially in mixed cellularity type, were quite probably not reactive.
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Keywords: Hodgkin's disease; lymphoid cell; proliferative activity
0 引言
现已明确霍奇金病(Hodgkin's disease, HD)是淋巴造血系统的恶性肿瘤性疾病，并且公认其病变组织中的RS (Reed-Sternberg)细胞、HD细胞及其变体细胞是肿瘤细胞. 因此人们一直对其起源与形成进行着研究[1,2]. 然而，十分有趣的是，RS及其变体细胞在HD病变组织中仅占2%[3]，病变组织中尚有大量淋巴细胞及数量不等的嗜酸性细胞、组织细胞及浆细胞，并认为它们均是反应性细胞[1-3]. 如此少的肿瘤细胞为何可致患者病变组织形成大的肿块？作为其中主要成分的淋巴细胞的增生活性(proliferative activity, PA)如何？我们用Ki67标记指数法(Ki67 labeling index, Ki67 LI), 主要研究了混合细胞型及结节硬化型HD病变组织的增生活性，并且发现病变组织中的淋巴细胞具有低度恶性非霍奇金淋巴瘤相近的增生活性，这对认识它们的增生本质及其在HD发生机制中的作用具有重要意义.
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1 材料和方法
1.1 材料 HD(混合细胞性9例，结节硬化性3例，淋巴细胞为主型1例)新鲜淋巴结标本13例及用于对照的反应性增生淋巴结新鲜标本10例均取自德国Kiel大学病理研究所. 上述新鲜标本一半用于常规固定,HE染色切片进行病理诊断，另一半用恒冷切片机制成6 μm厚冰冻切片,进行Ki67 LI研究.
1.2 方法 Ki67单抗来自Kiel大学病理研究所，用常规间接免疫酶法进行染色，辣根过氧化物酶呈色，苏木精衬核. 设PBS (phosphate buffered saline)及正常鼠血清替代一抗作为阴性对照. 用目镜中放置方格测微器观察，在病变组织内随机分别计数10个高倍视野中固定方格内总数1000个Ki67阳性及阴性细胞，计算每例HD的Ki67 LI及每组病例的平均Ki67 LI，即：
Ki67 LI=(Ki67阳性细胞)/(Ki67阳性细胞+Ki67阴性细胞)×100%
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统计学处理： 用χ2连续校正检验进行统计学分析.
2 结果
Ki67阳性细胞胞核呈棕黄色反应，有的细胞核仁结构染色更强. 阳性细胞绝大多数为体积小的圆形胞核，或呈均质棕黄色或在其背景上有较多大小不等的深棕色颗粒. 两种细胞均应视为阳性细胞而计入. 随机视野观察可见到的阳性大细胞机会极少，所观察的HD病例中仅有2例偶可见到RS细胞样核阳性细胞(Fig 1). 两种阴性对照均未见胞核呈阳性反应. 粒细胞可见胞质呈颗粒性非特异性染色，但核为阴性，并可见其分叶核，因此不会被认为是Ki67阳性细胞被计入. 不同亚型的HD病肿瘤组织平均Ki67 LI分别为：9例混合细胞型为8.4%, 3例结节硬化型为4.5%. 10例反应性增生淋巴结为3.4%. 经χ2连续校正检验处理，混合细胞型及结节硬化型HD病的Ki67 LI非常显著高于反应性增生淋巴结弥漫区域的标记指数(分别为χ12=215.9, P<0.001；χ22=6.92，P<0.01). 淋巴细胞为主型只有1例，未做统计学分析. 另外，混合细胞型HD的Ki67 LI也显著高于结节硬化型Ki67 LI(χ32=49.8, P<0.001).
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3 讨论
HD是人类常见的淋巴造血组织恶性肿瘤. 起初，因其病变组织中浸润细胞的多形性，如包括嗜酸细胞、中性细胞、浆细胞及组织细胞等，因而在相当长的时间内认为其为炎性病变. 然而，经过长期研究与临床观察，已经明确并公认其肿瘤性质，并公认其中的RS，HD及其变体细胞是HD肿瘤组织的肿瘤细胞[1,2]. 因其具有十分特别的细胞形态，并决定HD的诊断，所以其细胞起源与成因一直是世界范围内的研究热点之一. 然而令人十分不解的是，在HD肿瘤组织中仅占极少数的RS及其变体细胞，为何能引起淋巴结的异常肿大？这对HD的发病机制的确是个很有意义的问题.
原位测定肿瘤增生活性，在肿瘤病理生物学研究中具有重要作用，不仅可用于肿瘤分级，甚至可用于判断肿瘤良恶性与转移倾向[4]. Ki67 LI便是公认的测定肿瘤增生活性的有效方法之一. 然而，在HD病增生活性的研究中，结果不一[5,6]. Abele等[5]称RS和HD细胞是增生组分的主要细胞，但Jansen等[6]却认为只有20%的RS和HD细胞表达Ki67. 假如按照这一比例，即使RS和HD细胞占到5%(实际只有2% ，见上)，那么观察到Ki67阳性的机会也仅有1%. 可见随机观察计数时见到Ki67阳性的RS和HD细胞机会是极少的.
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图1 霍奇金病淋巴组织的Ki67免疫染色
Fig 1 Ki67 immunostaining in the lymphoid tissue of Hodgkin's disease ×600
A Ki67-positive RS cell located in the center of field and several lymphoid cells around it are also Ki67-positive. Indirect immunoperoxidase
由于HD病肿瘤组织中细胞的多型性，要特别准确研究其中淋巴细胞的增生活性是比较困难的. 但是，由于①我们用反应性增生淋巴结作为非瘤性增生的对照，其中也包括了较多组织细胞、浆细胞及不同数量的粒细胞等，但它们的Ki67 LI并不高；②如前所述，在随机视野观察计数时，所遇到的体积大或双核的阳性细胞极少，因此，观察计数所得的Ki67 LI应该能大致反映混合细胞型及结节硬化型HD病变组织中的淋巴细胞的增生活性.
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本结果表明，混合细胞型及结节硬化型HD中，平均Ki67 LI与反应性增生淋巴结相比，都有非常明显的差别，且混合细胞型HD的平均Ki67 LI又比结节硬化型显著为高. 若与我们以往用相同方法对非霍奇金淋巴瘤的增生活性相比[7]，混合细胞型HD中的淋巴细胞Ki67 LI与低度恶性非霍奇金淋巴瘤具有相近的增生活性，从而提示那些传统认为是反应性的淋巴细胞可能具有肿瘤性质. 最近，有人用原位研究发现了HD组织中淋巴细胞的染色体异常[8]，为认识其肿瘤性质提供了另一方面依据. 另外，我们的研究对混合细胞型HD与结节硬化型HD组织学分型也提供了客观依据. 临床研究表明混合细胞型的预后较差，通过Ki67 LI测定其有较高增生活性也是一个客观证据. 关于淋巴细胞为主型中的淋巴细胞已经证明其具有肿瘤性质，我们所测1例Ki67 LI也较高，符合文献规律，同时也说明方法学的可信性.
总之，我们用Ki67 LI首次明确了混合细胞型与结节硬化型HD淋巴细胞具有与低度恶性非霍奇金淋巴瘤同等的增生活性，对传统认为它们是反应性淋巴细胞的概念提出了疑问，为认识HD发病机制研究开辟了新思路.
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致 谢 我校解剖学教研室原悦萍女士协助制作照片.
作者简介：黄高升曰(1945-)， 男(汉族)， 河南省偃师市人. 教授， 博士生导师. Tel. (029)3374538
参考文献：
[1] Hsu SM, Hsu PL. The nature of Reed-sternberg cells: Phenotype, genotype, and other properties [J]. Crit Rev Oncog, 1994;5(2-3):213-245.
[2] Kadin ME. Pathology of Hodgkin's disease [J]. Curr Opin Oncol， 1994;6(5):456-463.
[3] Haluska FG, Brufsky AM, Canellos GP. The cellular biology of the Reed-sternberg cell [J]. Blood, 1994;84(4):1005-1019.
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[4] Van Diest P, Brugal G, Baak JPA. Proliferation markers in tumours: Interpretation and clinical value [J]. J Clin Pathol, 1998;51(10):716-724.
[5] Abele MC, Valente G, Kerim S et al. Significance of cell proliferation index in assessing histological prognostic categories in Hodgkin's disease. An immunohistochemical study with Ki67 and MIB-1 monoclonal antibodies [J]. Haematologica, 1997;82(3):281-285.
[6] Jansen MP, Machies BM, Hopman AH et al. Comparison of A and B-type lamin expression in reactive lymph nodes and nodular sclerosing Hodgkin's disease [J]. Histopathology, 1997;31(4):304-312.
, http://www.100md.com
[7] Huang GS, Feller AC, Lennert K. Correlation between the number of mitotic frigures and the percentage of Ki67-positive cells in non-Hodgkin's lymphomas [J]. Chin Med Sci J, 1994;9(1):16-19.
[8] Jansen MPHM, Hopman AHN, Haesevoets AM et al. Chromosomal abnormalities in Hodgkin's disease are not restricted to Hodgkin/Reed-sternberg cells [J]. J Pathol, 1998; 185(2):145-152.
收稿日期：2000-04-11； 修回日期：2000-04-19, 百拇医药