猫创伤性ALI和ARDS中CD59和CD46的表达和意义
作者：杨康 刘维永
单位：杨康(第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西 西安 710033)；刘维永(第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西 西安 710033)
关键词：CD59；CD46；急性肺损伤；急性呼吸窘迫综合征
第四军医大学学报000533 摘 要： 目的 观察补体调节蛋白CD59和CD46在创伤性急性肺损伤(ALI)和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)动物肺组织中的表达变化，并探讨其在ALI和ARDS发病机制中的意义. 方法 采用右胸撞击建立创伤性ALI和ARDS模型. 用免疫组化和原位杂交技术检查ALI和ARDS家猫肺组织中CD59，CD46的表达情况. 结果 伤后12 h ALI动物肺组织中CD59，CD46表达上调, 24 h最为明显，48～72 h减弱. ARDS动物肺组织中CD59，CD46表达明显下调. 结论 伤后早期，CD59，CD46表达上调，加强了组织细胞对补体攻击的自我保护机制；ARDS时，CD59，CD46表达下调可能是炎性损伤加重的原因之一.
, http://www.100md.com
中图号：R392.12 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)05-0624-03
CD59 and CD46 expression in lungs of cats with traumatic ALI or ARDS
YANG Kang, LIU Wei-Yong
(Center of Cardiovascular Surgery, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
Abstract： AIM To investigate the expression of CD59 and CD46 in the lungs of the cats with acute lung injury (ALI) or acute respiratory distress syndrome (ARDS) induced by blunt thoracic trauma. METHODS The animal model for ALI or ARDS was induced by impact on right chest wall of cats. The expression of CD59 and CD46 was determined by immunohistochemical staining and in situ hybridization. RESULTS The results showed the increased expression of CD59 and CD46 in the lungs of ALI cats during the period from 12 to 48 hours posttrauma and the decreased expression of CD59 and CD46 in the lungs of ARDS cats. CONCLUSION Inflammation in ALI may induce up-regulation of CD59 and CD46 expression which protect the positive cells from attack of complement, and as inflammation develops into ARDS stage, down-regulation of CD59 and CD46 expression may contribute to cells injury.
, 百拇医药
Keywords: CD59; CD46; acute lung injury; acute respiratory distress syndrome
0 引言
CD59和CD46是重要的补体调节蛋白，前者在终末阶段抑制攻膜复合物(MAC)的组装，后者抑制C3转化酶形成并加速其降解. 生理情况下，CD59和CD46在补体级联反应中的不同阶段抑制补体活化，保护自身组织免受补体攻击. 但在特定的病理过程中其表达和意义尚未明了. 我们在建立创伤性急性肺损伤(ALI)的基础上，应用免疫组化和分子杂交技术，对创伤性ALI和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)中CD59，CD46在肺组织中的表达情况进行检查，初步了解补体调节蛋白在创伤性ALI和ARDS中变化趋势，探讨补体介导组织损伤的机制.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 健康家猫18只，雌雄不拘，体质量1.5～2.0 kg，戊巴比妥钠30 mg.kg-1 ip麻醉，分别经颈动、静脉插管，用于血压监测和输液取样. 动物置于XJ多功能气动式撞击机上，于吸气末单次准静态撞击右胸侧壁，撞击参数：速度为15 m.s-1，胸廓压缩为20%，撞击面积为5 cm×6 cm. 伤后ALI诊断标准：①呼吸频率持续增加2倍以上；②动脉血PaO2降低；③X光片示伤侧肺密度普遍增高；④病理检查示伤侧肺和非伤侧肺均充血、水肿、白细胞浸润. ARDS诊断参照实验动物ARDS诊断标准[1]. 18只动物中，有8只分别于伤后6，12，24和48 h放血活杀；余下10只中有4只分别于伤后43，46，52和60 h发生ARDS，其余6只符合ALI诊断标准，均于伤后72 h放血活杀. 动物活杀后立即以40 mL.L-1多聚甲醛灌注固定，取肺组织于4℃下40 mL.L-1多聚甲醛固定12 h，石蜡包埋备用. CD59，CD46 mAb由第三军医大学免疫教研室提供.
, 百拇医药
1.2 方法 ①石蜡切片脱蜡至水，经体积分数为30 mL.L-1 H2O2封闭内源性过气化物酶后，用体积分数为50 mL.L-1的正常羊血清封闭30 min，分别滴加CD59，CD46 mAb反应30 min，PBS冲洗后加生物素化羊抗鼠二抗37℃反应30 min；加ABC复合物37℃孵育30 min，DAB显色后，二甲苯透明、封片. ②CD59，CD46 cDNA片段由第三军医大学免疫教研室提供. 参照地高辛标记检测试剂盒(Boehringer Mannhein公司)说明书，采用随机引物法标记. 石蜡切片脱蜡至DEPC水，分别用0.2 mol.L-1 HCl和20 mg.L-1的蛋白酶K处理，梯度乙醇脱水后室温干燥. 用地高辛标记的CD59，CD46探针于42℃杂交后，依(Fig 1A, 2A, 3A, 4A)次用2×SSC，1×SSC，0.5×SSC，buffer 1，buffer 2充分洗涤，用体积分数为20 mL.L-1正常羊血清封闭30 min后，滴加抗地高辛碱性磷酸酶抗体2 h；buffl 1，buffl 3洗涤，加新配制好显色液(NBT/BCIP显色系统) 20 μL，暗处显色. 中止显色后，梯度乙醇脱水，二甲苯透明封片.
, 百拇医药
2 结果
正常肺组织中支气管粘膜上皮、肺泡隔毛细血管网和肺泡上皮细胞CD59，CD46的免疫组化染色和分子杂交呈阳性表达，两个分子蛋白质水平和mRNA水平表达的细胞定位基本一致，其mRNA表达以胞质为主(Fig 1A, 2A, 3A,4A). ALI 动物伤后12 h肺组织中CD59，CD46表达开始上调, 24 h最为明显(Fig 1B, 2B, 3B,4B)， 48～72 h减弱. ARDS动物肺组织中CD59，CD46表达明显下调(Fig 1C, 2C, 3C, 4C).
图1 CD59免疫组化染色
Fig 1 Immunohistochemical staining for CD59 ×250
, 百拇医药
A: Positive in normal lung tissue； B: Increased expression in lungs of ALI cats at 24 h posttrauma； C: Decreased expression in lungs of ARDS.
图2 CD46免疫组化染色
Fig 2 Immunohistochemical staining for CD46 ×250
A, B, C: The same as Fig 1A, 1B, 1C.
, 百拇医药 图3 CD59原位杂交染色
Fig 3 In situ hybridization for CD59 ×250
A, B, C: The same as Fig 1A, 1B, 1C.
图4 CD46原位杂交染色
Fig 4 In situ hybridization for CD46 ×250
A, B, C: The same as Fig 1A, 1B, 1C.
3 讨论
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创伤后补体激活成分升高，并与ALI和ARDS密切相关，说明补体系统参与了创伤后机体的炎症反应[2-5]. CD59，CD46作为重要的补体同源限制因子，广泛分布于红细胞、白细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞等. 这种分布的广泛性反映了机体普遍存在的自我保护机制. 但是，CD59和CD46在创伤性ALI和ARDS中有何意义至今未见报道. 我们用免疫组化和原位杂交技术，初步观察了创伤性ALI和ARDS中CD59和CD46的表达情况. 发现伤后ALI动物内脏组织中CD59，CD46的表达明显上调，提示创伤性ALI中补体系统具有双向作用，一方面补体成分激活，介导炎性损伤，另一方面补体调节蛋白表达上调，降低组织细胞对补体的敏感性，加强了自我保护机制. 本研究还发现，ARDS动物肺组织中CD59，CD46表达均一致下调，这一变化是组织损伤的原因还是结果目前尚不清楚. 推测有两种可能：①ALI和ARDS是全身炎症反应综合征(SIRS)在肺部表现的不同阶段，ARDS是ALI的严重结局. 伤后早期，即ALI阶段，除炎性介质引起SIRS外，尚有内源性抗炎因子和介质释放引起和代偿性抗炎反应综合征(compensatory anti-inflammatory response syndrome, CARS)[6]，此时SIRS和CARS可能处于抗衡状态. 肺组织中补体调节蛋白表达上调，降低组织细胞对补体敏感性，加强了自我保护机制. 如CARS占优势，SIRS得以控制；肺部表现为 ALI减轻，CD59和CD46表达可下调. 如炎症反应继续发展，SIRS占优势，炎症反应失控，肺部表现为ALI加重，最终发展为ARDS，通过尚未明了的机制使补体调节蛋白表达CD59和CD46下调，自身保护作用减弱或丧失，组织细胞遭受补体攻击. 此时，CD59，CD46等补体调节蛋白表达下调是组织损伤的原因之一. ②CD59，CD46表达下调可能是ARDS时细胞损伤的结果，ARDS时，组织细胞损伤严重. 本组在电镜观察中发现，ARDS动物的肺组织中细胞极度肿胀、细胞器减少或消失、核变稀疏. 而CD59，CD46为细胞膜上的锚固蛋白，细胞损伤后释放的磷脂酶水解分子上的GPI链，使CD59，CD46脱落，细胞膜上分子数减少.
, 百拇医药
作者简介：杨 康(1964-)， 男(汉族)， 云南省昆明市人. 博士.Tel.(029)3375311 Email. Jinzx@fmmu.edu.cn
参考文献：
[1] Hu S, Sheng ZY, Tian HM. A clinically relevant model of multiple system organ failure in the rabbit [J]. Circ Shock, 1991;34(1):70-74.
[2] Donnelly TJ, Meade P, Jagels M et al. Cytodine, complement, and endotoxin profiles associated with the development of the adult respriatory distress syndrome after severe injury [J]. Crit Care Med, 1994;22(5):768-776.
, http://www.100md.com
[3] Rormen RHM, Rekl H, Schlag G et al. Inflammatory mediators in relation to the development of multiple organ failure in patients after severe blunt trauma [J]. Crit Care Med, 1995;23(3):474-480.
[4] Zlow G, Sturm Jam, Rother U et al. Complement activation and the prognostic value of C3a in patients at risk of adult respiratory distress syndrome [J]. Clin Exp Immunol, 1990;79(1):151-157.
[5] Nuytinck JK, Sm Goris RJA, Tdkl H et al.Posttraumatic complications and inflammatory mediators [J]. Arch Surg, 1986;121(6):886-890.
[6] Bone RC. Sir isaac Newton, sepsis, SIRS, and CARS [J]. Crit Care Med, 1996;24(7):1125-1128.
收稿日期：1999-02-05； 修回日期：1999-04-20, 百拇医药
单位：杨康(第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西 西安 710033)；刘维永(第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西 西安 710033)
关键词：CD59；CD46；急性肺损伤；急性呼吸窘迫综合征
第四军医大学学报000533 摘 要： 目的 观察补体调节蛋白CD59和CD46在创伤性急性肺损伤(ALI)和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)动物肺组织中的表达变化，并探讨其在ALI和ARDS发病机制中的意义. 方法 采用右胸撞击建立创伤性ALI和ARDS模型. 用免疫组化和原位杂交技术检查ALI和ARDS家猫肺组织中CD59，CD46的表达情况. 结果 伤后12 h ALI动物肺组织中CD59，CD46表达上调, 24 h最为明显，48～72 h减弱. ARDS动物肺组织中CD59，CD46表达明显下调. 结论 伤后早期，CD59，CD46表达上调，加强了组织细胞对补体攻击的自我保护机制；ARDS时，CD59，CD46表达下调可能是炎性损伤加重的原因之一.
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中图号：R392.12 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)05-0624-03
CD59 and CD46 expression in lungs of cats with traumatic ALI or ARDS
YANG Kang, LIU Wei-Yong
(Center of Cardiovascular Surgery, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
Abstract： AIM To investigate the expression of CD59 and CD46 in the lungs of the cats with acute lung injury (ALI) or acute respiratory distress syndrome (ARDS) induced by blunt thoracic trauma. METHODS The animal model for ALI or ARDS was induced by impact on right chest wall of cats. The expression of CD59 and CD46 was determined by immunohistochemical staining and in situ hybridization. RESULTS The results showed the increased expression of CD59 and CD46 in the lungs of ALI cats during the period from 12 to 48 hours posttrauma and the decreased expression of CD59 and CD46 in the lungs of ARDS cats. CONCLUSION Inflammation in ALI may induce up-regulation of CD59 and CD46 expression which protect the positive cells from attack of complement, and as inflammation develops into ARDS stage, down-regulation of CD59 and CD46 expression may contribute to cells injury.
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Keywords: CD59; CD46; acute lung injury; acute respiratory distress syndrome
0 引言
CD59和CD46是重要的补体调节蛋白，前者在终末阶段抑制攻膜复合物(MAC)的组装，后者抑制C3转化酶形成并加速其降解. 生理情况下，CD59和CD46在补体级联反应中的不同阶段抑制补体活化，保护自身组织免受补体攻击. 但在特定的病理过程中其表达和意义尚未明了. 我们在建立创伤性急性肺损伤(ALI)的基础上，应用免疫组化和分子杂交技术，对创伤性ALI和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)中CD59，CD46在肺组织中的表达情况进行检查，初步了解补体调节蛋白在创伤性ALI和ARDS中变化趋势，探讨补体介导组织损伤的机制.
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1 材料和方法
1.1 材料 健康家猫18只，雌雄不拘，体质量1.5～2.0 kg，戊巴比妥钠30 mg.kg-1 ip麻醉，分别经颈动、静脉插管，用于血压监测和输液取样. 动物置于XJ多功能气动式撞击机上，于吸气末单次准静态撞击右胸侧壁，撞击参数：速度为15 m.s-1，胸廓压缩为20%，撞击面积为5 cm×6 cm. 伤后ALI诊断标准：①呼吸频率持续增加2倍以上；②动脉血PaO2降低；③X光片示伤侧肺密度普遍增高；④病理检查示伤侧肺和非伤侧肺均充血、水肿、白细胞浸润. ARDS诊断参照实验动物ARDS诊断标准[1]. 18只动物中，有8只分别于伤后6，12，24和48 h放血活杀；余下10只中有4只分别于伤后43，46，52和60 h发生ARDS，其余6只符合ALI诊断标准，均于伤后72 h放血活杀. 动物活杀后立即以40 mL.L-1多聚甲醛灌注固定，取肺组织于4℃下40 mL.L-1多聚甲醛固定12 h，石蜡包埋备用. CD59，CD46 mAb由第三军医大学免疫教研室提供.
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1.2 方法 ①石蜡切片脱蜡至水，经体积分数为30 mL.L-1 H2O2封闭内源性过气化物酶后，用体积分数为50 mL.L-1的正常羊血清封闭30 min，分别滴加CD59，CD46 mAb反应30 min，PBS冲洗后加生物素化羊抗鼠二抗37℃反应30 min；加ABC复合物37℃孵育30 min，DAB显色后，二甲苯透明、封片. ②CD59，CD46 cDNA片段由第三军医大学免疫教研室提供. 参照地高辛标记检测试剂盒(Boehringer Mannhein公司)说明书，采用随机引物法标记. 石蜡切片脱蜡至DEPC水，分别用0.2 mol.L-1 HCl和20 mg.L-1的蛋白酶K处理，梯度乙醇脱水后室温干燥. 用地高辛标记的CD59，CD46探针于42℃杂交后，依(Fig 1A, 2A, 3A, 4A)次用2×SSC，1×SSC，0.5×SSC，buffer 1，buffer 2充分洗涤，用体积分数为20 mL.L-1正常羊血清封闭30 min后，滴加抗地高辛碱性磷酸酶抗体2 h；buffl 1，buffl 3洗涤，加新配制好显色液(NBT/BCIP显色系统) 20 μL，暗处显色. 中止显色后，梯度乙醇脱水，二甲苯透明封片.
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2 结果
正常肺组织中支气管粘膜上皮、肺泡隔毛细血管网和肺泡上皮细胞CD59，CD46的免疫组化染色和分子杂交呈阳性表达，两个分子蛋白质水平和mRNA水平表达的细胞定位基本一致，其mRNA表达以胞质为主(Fig 1A, 2A, 3A,4A). ALI 动物伤后12 h肺组织中CD59，CD46表达开始上调, 24 h最为明显(Fig 1B, 2B, 3B,4B)， 48～72 h减弱. ARDS动物肺组织中CD59，CD46表达明显下调(Fig 1C, 2C, 3C, 4C).
图1 CD59免疫组化染色
Fig 1 Immunohistochemical staining for CD59 ×250
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A: Positive in normal lung tissue； B: Increased expression in lungs of ALI cats at 24 h posttrauma； C: Decreased expression in lungs of ARDS.
图2 CD46免疫组化染色
Fig 2 Immunohistochemical staining for CD46 ×250
A, B, C: The same as Fig 1A, 1B, 1C.
, 百拇医药 图3 CD59原位杂交染色
Fig 3 In situ hybridization for CD59 ×250
A, B, C: The same as Fig 1A, 1B, 1C.
图4 CD46原位杂交染色
Fig 4 In situ hybridization for CD46 ×250
A, B, C: The same as Fig 1A, 1B, 1C.
3 讨论
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创伤后补体激活成分升高，并与ALI和ARDS密切相关，说明补体系统参与了创伤后机体的炎症反应[2-5]. CD59，CD46作为重要的补体同源限制因子，广泛分布于红细胞、白细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞等. 这种分布的广泛性反映了机体普遍存在的自我保护机制. 但是，CD59和CD46在创伤性ALI和ARDS中有何意义至今未见报道. 我们用免疫组化和原位杂交技术，初步观察了创伤性ALI和ARDS中CD59和CD46的表达情况. 发现伤后ALI动物内脏组织中CD59，CD46的表达明显上调，提示创伤性ALI中补体系统具有双向作用，一方面补体成分激活，介导炎性损伤，另一方面补体调节蛋白表达上调，降低组织细胞对补体的敏感性，加强了自我保护机制. 本研究还发现，ARDS动物肺组织中CD59，CD46表达均一致下调，这一变化是组织损伤的原因还是结果目前尚不清楚. 推测有两种可能：①ALI和ARDS是全身炎症反应综合征(SIRS)在肺部表现的不同阶段，ARDS是ALI的严重结局. 伤后早期，即ALI阶段，除炎性介质引起SIRS外，尚有内源性抗炎因子和介质释放引起和代偿性抗炎反应综合征(compensatory anti-inflammatory response syndrome, CARS)[6]，此时SIRS和CARS可能处于抗衡状态. 肺组织中补体调节蛋白表达上调，降低组织细胞对补体敏感性，加强了自我保护机制. 如CARS占优势，SIRS得以控制；肺部表现为 ALI减轻，CD59和CD46表达可下调. 如炎症反应继续发展，SIRS占优势，炎症反应失控，肺部表现为ALI加重，最终发展为ARDS，通过尚未明了的机制使补体调节蛋白表达CD59和CD46下调，自身保护作用减弱或丧失，组织细胞遭受补体攻击. 此时，CD59，CD46等补体调节蛋白表达下调是组织损伤的原因之一. ②CD59，CD46表达下调可能是ARDS时细胞损伤的结果，ARDS时，组织细胞损伤严重. 本组在电镜观察中发现，ARDS动物的肺组织中细胞极度肿胀、细胞器减少或消失、核变稀疏. 而CD59，CD46为细胞膜上的锚固蛋白，细胞损伤后释放的磷脂酶水解分子上的GPI链，使CD59，CD46脱落，细胞膜上分子数减少.
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作者简介：杨 康(1964-)， 男(汉族)， 云南省昆明市人. 博士.Tel.(029)3375311 Email. Jinzx@fmmu.edu.cn
参考文献：
[1] Hu S, Sheng ZY, Tian HM. A clinically relevant model of multiple system organ failure in the rabbit [J]. Circ Shock, 1991;34(1):70-74.
[2] Donnelly TJ, Meade P, Jagels M et al. Cytodine, complement, and endotoxin profiles associated with the development of the adult respriatory distress syndrome after severe injury [J]. Crit Care Med, 1994;22(5):768-776.
, http://www.100md.com
[3] Rormen RHM, Rekl H, Schlag G et al. Inflammatory mediators in relation to the development of multiple organ failure in patients after severe blunt trauma [J]. Crit Care Med, 1995;23(3):474-480.
[4] Zlow G, Sturm Jam, Rother U et al. Complement activation and the prognostic value of C3a in patients at risk of adult respiratory distress syndrome [J]. Clin Exp Immunol, 1990;79(1):151-157.
[5] Nuytinck JK, Sm Goris RJA, Tdkl H et al.Posttraumatic complications and inflammatory mediators [J]. Arch Surg, 1986;121(6):886-890.
[6] Bone RC. Sir isaac Newton, sepsis, SIRS, and CARS [J]. Crit Care Med, 1996;24(7):1125-1128.
收稿日期：1999-02-05； 修回日期：1999-04-20, 百拇医药