猪去细胞主动脉瓣组织学及生物力学特征
作者：金振晓 刘维永
单位：金振晓(第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西 西安 710033)；刘维永(第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西 西安 710033)
关键词：生物瓣；异种；组织学
第四军医大学学报000523 摘 要: 目的 观察猪主动脉瓣叶去细胞后的组织学和理化性能变化，探讨其作为未来“杂种”瓣膜支架的可能性. 方法 新鲜采集的猪主动脉瓣叶经表面活性剂、核酸酶、渗透压变化作用，去除瓣叶组织的细胞成分，在光镜、电镜下观察组织学变化，测定瓣叶组织的含水量、可溶性蛋白含量、热皱缩温度、瓣叶厚度、描计了应力应变曲线. 结果 成功地去除了猪主动脉瓣组织中的细胞成分；瓣叶去细胞后组织含水量明显增高[φ(94.6±0.3)% vs (91.2±2.0)%，P<0.01]，可溶性蛋白含量明显降低[ω(0.041±0.008)% vs (0.056±0.006)%，P<0.05]；热皱缩温度[(72.0±0.7)℃ vs (71.2±0.8)℃，P>0.05]，瓣叶厚度[(0.8±0.3) mm vs (0.7±0.3) mm，P>0.05]，断裂强度[(646±133) g.mm-2 vs (650±105) g.mm-2， P>0.05]和断裂伸长率[(57±14)% vs (65±18)%，P>0.05]均无明显差别. 结论 采用表面活性剂、核酸酶结合渗透压变化的方法，能够成功地去除猪主动脉瓣组织的细胞成分，且不影响组织的理化性能，有可能作为纤维支架，用于构建“杂种”生物瓣膜.
, 百拇医药
中图号：R64.2 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)05-0592-03
Histology and physicochemical properties of porcine valve tissue with cells extracted
JIN Zhen-Xiao， LIU Wei-Yong
(Center of Cardiovascular Surgery, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
Abstract: AIM To observe the heart valve tissue with cells extracted and to explore its possibility to serve as a scaffold in constructing a "hybrid" heart valve prosthesis. METHODS The fresh porcine aortic heart valves were treated with triton X-100, RNAase and DNAase solution combined with alterations of osmosis to remove all the cellular components. Light and electron microscopy was used to investigate the histological changes. The soluble protein content, water content, shrinkage temperature, tension and strain at fracture of fresh and acellular valve tissue were evaluated. RESULTS Light and electron microscopy confirmed that all the cellular constituents were removed without ultrastructural damage to fibrous components. Compared with the fresh sample, the water content of acellular tissue increased significantly [φ(94.6±0.3)% vs (91.2±2.0)%, P<0.01]; the soluble protein content decreased markedly [ω(0.041±0.008)% vs (0.056±0.006)%, P<0.05]. As to other indexes evaluated, no significant difference was found between acellular and fresh valve tissues: Shrinkage temperature [(72.0±0.7)℃ vs (71.2±0.8)℃, P>0.05]; thickness [(0.8±0.3) mm vs (0.7±0.3) mm, P>0.05]; tension at fracture [(646±133) g/mm2 vs (650±105) g/mm2, P>0.05]; strain at fracture [(57±14)% vs (65±18)%, P>0.05]. CONCLUSION The cellular component of fresh porcine aortic heart valves can completely be removed without impairing the mechanical property of the tissue. This kind of acellular tissue, therefore, could possibly be used to develop tissue engineering for heart valve substitute.
, http://www.100md.com
Keywords: heart valve bioprostheses； xenograft； histology
0 引言
大量研究表明，异种生物瓣钙化与瓣膜中的细胞成分关系密切.我们将瓣膜组织中细胞成分去除，研究了其组织学变化，测定了力学强度，探讨其能否作为组织工程瓣膜的异种纤维支架，取得了初步的实验结果.
1 材料和方法
1.1 材料 ①新鲜猪主动脉瓣与4℃ Hanks液中带回实验室，洗尽血液，轻轻擦去内皮，作为新鲜瓣(F组, n=25). ②去细胞瓣叶的制备[1,2]：瓣叶于10 mL.L-1 Triton X-100 0.01 mol.L-1 Tris缓冲液中(20 mL+PMSF 100 μL/片)，4℃下持续振荡24 h；转入10 mL.L-1 Triton X-100 1.5 mol.L-1 KCl溶液，同样作用24 h；0.01 mol.L-1 Tris Cl溶液充分洗涤(20 mL/片，振荡洗涤10 min×6次)；转入100 mL DNA酶、RNA酶工作液中，加DNA酶2 mL，RNA酶100 μL ，37℃水浴过夜；转入低渗Triton X-100液中，4℃振荡24 h，充分洗涤.为去细胞瓣(aF组 n=25) .
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1.2 方法 新鲜瓣叶去细胞前后分别测定瓣叶可溶性蛋白含量、含水量、热皱缩温度、断裂强度、断裂伸长率.标本经固定后常规制作电镜、光镜标本，观察组织结构.
统计学分析：结果以
±s表示，采用t检验对所有数据进行统计学分析.
2 结果
瓣叶去细胞后组织含水量明显增高[φ(94.6±0.3)% vs (91.2±2.0)%，P<0.01]，可溶性蛋白含量明显降低[ω(0.041±0.008)% vs (0.056±0.006)%，P<0.05]；热皱缩温度[(72.0±0.7)℃ vs (71.2±0.8)℃，P>0.05]，瓣叶厚度[(0.8±0.3) mm vs (0.7±0.3) mm，P>0.05]，断裂强度[(646±133) g.mm-2 vs (650±104) g.mm-2，P>0.05]和断裂伸长率[(57±14)% vs (65±18)%，P>0.05]均无明显差别.
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新鲜瓣(F组)瓣叶组织常规病理切片，HE染色，光镜下观察，见瓣叶表面内皮细胞绝大部分已被擦去，纤维层、松质层、室层三层结构完整，纤维细胞无自溶现象，纤维结构无损伤(Fig 1a).扫描电镜下，见表面无细胞成分残留，暴露出粗大的纤维，比较紊乱，深层纤维仍呈波浪状结构(Fig 2a).去细胞(aF组)瓣叶经常规切片染色，光镜下观察，见瓣叶组织中细胞成分完全消失，纤维层、松质层、室层三层结构在失去细胞后，单凭纤维网架亦可清晰辩认，纤维网之间的空白区，应该是原先纤维细胞占据的位置(Fig 1b)；扫描电镜下见表面没有任何细胞成分残留，波浪状结构保存完好，排列规则，连极细小的纤维都能保存(Fig 2b)；透射电镜下见交错排列的胶原纤维的纵剖面和横断面，纤维横纹清晰，结构无破坏(Fig 3a,3b).
图1 瓣叶组织光学显微镜观察
Fig 1 The valve tissue under light microscope HE×20
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a: Fresh valve; b: Acellular valve.
图2 瓣叶组织扫描电镜观察
Fig 2 The valve surface under scanning electronscope ×1000
a: Fresh valve; b: Acellular valve.
图3 去细胞瓣叶组织透射电镜观察
Fig 3 The acellular valve tissue under transmission electronscope
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a: Vertical section ×500; b: Transverse section ×2500.
3 讨论
我们采用了表面活性剂、渗透压改变结合核酸酶消化的方法,完全去除了猪主动脉瓣组织中的细胞成分,获得了完整无细胞的纤维网状支架. 此无细胞纤维支架与新鲜瓣叶相比在力学强度和稳定性上没有明显差别.经去细胞处理后，与新鲜瓣叶相比，组织含水量增加，可溶性蛋白含量下降，说明此去细胞过程，不但有效地去除了新鲜瓣叶组织中的细胞成分，也去除了大量的可溶性物质. 组织含水量的增加，说明瓣叶组织中疏水性的脂质也得到了去除，胶原纤维、弹力纤维构成的网架结构及附着在网状结构上的糖蛋白得到了保留，这些亲水性的物质，使水分在网状结构中聚集，从而引起含水量的明显增加[1].Courtman等[1]报道采用此方法去除牛心包组织中的细胞成分后，使组织厚度增加20%之多，他认为系含水量增加，组织肿胀所致.我们采用猪主动脉瓣组织，未发现有厚度增加的现象，可能与猪主动脉瓣和牛心包组织结构不完全相同有关.
, 百拇医药
猪主动脉瓣中含有大约55%的胶原，主要成分为Ⅰ，Ⅲ型胶原，13%的弹力纤维，剩下的为富含粘多糖的基质[2]，而牛心包组织中胶原的含量达90%，主要是Ⅰ型胶原，Ⅲ型胶原含量很少，弹力纤维的含量少于1%[3]. 猪主动脉瓣组织在复杂高压血流冲击下长成，其胶原、弹力纤维网状结构可能编织得更致密，更合理，特别是高含量的弹力纤维在猪主动脉瓣中呈蜂窝状结构，使胶原束在其网孔中穿过，有助于保持胶原纤维的形态. 疏水性的弹力纤维[1]可能使水分不易在瓣叶组织中大量蓄积，厚度不致显著增加.
热皱缩温度(shrinkage temperature, ST)一直被视为反映胶原材料交联度的良好指标，热皱缩温度高，说明交联度高，热稳定性好. 新鲜瓣叶去细胞前后，ST值无明显差别，说明此细胞提取过程不影响瓣叶组织纤维网的结构.新鲜瓣叶去细胞前后，抗张力强度没有明显改变.
本方法去除猪主动脉瓣的细胞成分，不损伤其生物力学性能，从而有可能增强其抗钙化能力，大大降低宿主对瓣膜组织的免疫反应[4]，可延长其寿命. 同时，去除细胞成分的猪主动脉瓣组织是一种良好的纤维框架，也可以用于构建组织工程瓣膜[5].
, 百拇医药
作者简介：金振晓(1970-)， 男(汉族)， 山西省晋城市人. 博士, 助教.
Tel. (029)3373135 Email. jinzx@fmmu.edu.cn
参考文献：
[1] Courtman DW, Pereira CA, Kashef V et al. Development of a pericardial acellular matrix biomaterial: Biochemical and mechanical effects of cell extraction [J]. J Biomed Mater Res, 1994; 28(6): 655-666.
[2] Wilson GJ, Yeger H, Klement P et al. Acellular matrix allograft small caliber vascular prostheses [J]. ASAIO Trans, 1990; 36(1): M240-243.
, 百拇医药
[3] Scott M, Vesely I. Aortic valve cusp microstructure: The role of elastin [J]. Ann Thorac Surg, 1995; 60(Suppl 2): s391-s394.
[4] Goldstain S, Black K, Clarke D et al. Inflammatory responses to uncross-linked xenogeneic heart valve matrix [abstr] [A]. In: Goldstain S et al eds. World Symposium on Heart Valve Disease [M]. London: publisher unknown, 1999: 205.
[5] Gerosa G. The V.E.S.A.L.I.O project, the "autograft" homograft valve [abstr]. In: Gerosa G et al eds. Tissue engineering for heart valve bioprostheses [M]. London: publisher unknown, 1999: 22-23.
收稿日期：1999-10-19； 修回日期：1999-12-23, 百拇医药
单位：金振晓(第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西 西安 710033)；刘维永(第四军医大学西京医院心血管外科中心，陕西 西安 710033)
关键词：生物瓣；异种；组织学
第四军医大学学报000523 摘 要: 目的 观察猪主动脉瓣叶去细胞后的组织学和理化性能变化，探讨其作为未来“杂种”瓣膜支架的可能性. 方法 新鲜采集的猪主动脉瓣叶经表面活性剂、核酸酶、渗透压变化作用，去除瓣叶组织的细胞成分，在光镜、电镜下观察组织学变化，测定瓣叶组织的含水量、可溶性蛋白含量、热皱缩温度、瓣叶厚度、描计了应力应变曲线. 结果 成功地去除了猪主动脉瓣组织中的细胞成分；瓣叶去细胞后组织含水量明显增高[φ(94.6±0.3)% vs (91.2±2.0)%，P<0.01]，可溶性蛋白含量明显降低[ω(0.041±0.008)% vs (0.056±0.006)%，P<0.05]；热皱缩温度[(72.0±0.7)℃ vs (71.2±0.8)℃，P>0.05]，瓣叶厚度[(0.8±0.3) mm vs (0.7±0.3) mm，P>0.05]，断裂强度[(646±133) g.mm-2 vs (650±105) g.mm-2， P>0.05]和断裂伸长率[(57±14)% vs (65±18)%，P>0.05]均无明显差别. 结论 采用表面活性剂、核酸酶结合渗透压变化的方法，能够成功地去除猪主动脉瓣组织的细胞成分，且不影响组织的理化性能，有可能作为纤维支架，用于构建“杂种”生物瓣膜.
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中图号：R64.2 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)05-0592-03
Histology and physicochemical properties of porcine valve tissue with cells extracted
JIN Zhen-Xiao， LIU Wei-Yong
(Center of Cardiovascular Surgery, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
Abstract: AIM To observe the heart valve tissue with cells extracted and to explore its possibility to serve as a scaffold in constructing a "hybrid" heart valve prosthesis. METHODS The fresh porcine aortic heart valves were treated with triton X-100, RNAase and DNAase solution combined with alterations of osmosis to remove all the cellular components. Light and electron microscopy was used to investigate the histological changes. The soluble protein content, water content, shrinkage temperature, tension and strain at fracture of fresh and acellular valve tissue were evaluated. RESULTS Light and electron microscopy confirmed that all the cellular constituents were removed without ultrastructural damage to fibrous components. Compared with the fresh sample, the water content of acellular tissue increased significantly [φ(94.6±0.3)% vs (91.2±2.0)%, P<0.01]; the soluble protein content decreased markedly [ω(0.041±0.008)% vs (0.056±0.006)%, P<0.05]. As to other indexes evaluated, no significant difference was found between acellular and fresh valve tissues: Shrinkage temperature [(72.0±0.7)℃ vs (71.2±0.8)℃, P>0.05]; thickness [(0.8±0.3) mm vs (0.7±0.3) mm, P>0.05]; tension at fracture [(646±133) g/mm2 vs (650±105) g/mm2, P>0.05]; strain at fracture [(57±14)% vs (65±18)%, P>0.05]. CONCLUSION The cellular component of fresh porcine aortic heart valves can completely be removed without impairing the mechanical property of the tissue. This kind of acellular tissue, therefore, could possibly be used to develop tissue engineering for heart valve substitute.
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Keywords: heart valve bioprostheses； xenograft； histology
0 引言
大量研究表明，异种生物瓣钙化与瓣膜中的细胞成分关系密切.我们将瓣膜组织中细胞成分去除，研究了其组织学变化，测定了力学强度，探讨其能否作为组织工程瓣膜的异种纤维支架，取得了初步的实验结果.
1 材料和方法
1.1 材料 ①新鲜猪主动脉瓣与4℃ Hanks液中带回实验室，洗尽血液，轻轻擦去内皮，作为新鲜瓣(F组, n=25). ②去细胞瓣叶的制备[1,2]：瓣叶于10 mL.L-1 Triton X-100 0.01 mol.L-1 Tris缓冲液中(20 mL+PMSF 100 μL/片)，4℃下持续振荡24 h；转入10 mL.L-1 Triton X-100 1.5 mol.L-1 KCl溶液，同样作用24 h；0.01 mol.L-1 Tris Cl溶液充分洗涤(20 mL/片，振荡洗涤10 min×6次)；转入100 mL DNA酶、RNA酶工作液中，加DNA酶2 mL，RNA酶100 μL ，37℃水浴过夜；转入低渗Triton X-100液中，4℃振荡24 h，充分洗涤.为去细胞瓣(aF组 n=25) .
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1.2 方法 新鲜瓣叶去细胞前后分别测定瓣叶可溶性蛋白含量、含水量、热皱缩温度、断裂强度、断裂伸长率.标本经固定后常规制作电镜、光镜标本，观察组织结构.
统计学分析：结果以
±s表示，采用t检验对所有数据进行统计学分析.2 结果
瓣叶去细胞后组织含水量明显增高[φ(94.6±0.3)% vs (91.2±2.0)%，P<0.01]，可溶性蛋白含量明显降低[ω(0.041±0.008)% vs (0.056±0.006)%，P<0.05]；热皱缩温度[(72.0±0.7)℃ vs (71.2±0.8)℃，P>0.05]，瓣叶厚度[(0.8±0.3) mm vs (0.7±0.3) mm，P>0.05]，断裂强度[(646±133) g.mm-2 vs (650±104) g.mm-2，P>0.05]和断裂伸长率[(57±14)% vs (65±18)%，P>0.05]均无明显差别.
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新鲜瓣(F组)瓣叶组织常规病理切片，HE染色，光镜下观察，见瓣叶表面内皮细胞绝大部分已被擦去，纤维层、松质层、室层三层结构完整，纤维细胞无自溶现象，纤维结构无损伤(Fig 1a).扫描电镜下，见表面无细胞成分残留，暴露出粗大的纤维，比较紊乱，深层纤维仍呈波浪状结构(Fig 2a).去细胞(aF组)瓣叶经常规切片染色，光镜下观察，见瓣叶组织中细胞成分完全消失，纤维层、松质层、室层三层结构在失去细胞后，单凭纤维网架亦可清晰辩认，纤维网之间的空白区，应该是原先纤维细胞占据的位置(Fig 1b)；扫描电镜下见表面没有任何细胞成分残留，波浪状结构保存完好，排列规则，连极细小的纤维都能保存(Fig 2b)；透射电镜下见交错排列的胶原纤维的纵剖面和横断面，纤维横纹清晰，结构无破坏(Fig 3a,3b).
图1 瓣叶组织光学显微镜观察
Fig 1 The valve tissue under light microscope HE×20
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a: Fresh valve; b: Acellular valve.
图2 瓣叶组织扫描电镜观察
Fig 2 The valve surface under scanning electronscope ×1000
a: Fresh valve; b: Acellular valve.
图3 去细胞瓣叶组织透射电镜观察
Fig 3 The acellular valve tissue under transmission electronscope
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a: Vertical section ×500; b: Transverse section ×2500.
3 讨论
我们采用了表面活性剂、渗透压改变结合核酸酶消化的方法,完全去除了猪主动脉瓣组织中的细胞成分,获得了完整无细胞的纤维网状支架. 此无细胞纤维支架与新鲜瓣叶相比在力学强度和稳定性上没有明显差别.经去细胞处理后，与新鲜瓣叶相比，组织含水量增加，可溶性蛋白含量下降，说明此去细胞过程，不但有效地去除了新鲜瓣叶组织中的细胞成分，也去除了大量的可溶性物质. 组织含水量的增加，说明瓣叶组织中疏水性的脂质也得到了去除，胶原纤维、弹力纤维构成的网架结构及附着在网状结构上的糖蛋白得到了保留，这些亲水性的物质，使水分在网状结构中聚集，从而引起含水量的明显增加[1].Courtman等[1]报道采用此方法去除牛心包组织中的细胞成分后，使组织厚度增加20%之多，他认为系含水量增加，组织肿胀所致.我们采用猪主动脉瓣组织，未发现有厚度增加的现象，可能与猪主动脉瓣和牛心包组织结构不完全相同有关.
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猪主动脉瓣中含有大约55%的胶原，主要成分为Ⅰ，Ⅲ型胶原，13%的弹力纤维，剩下的为富含粘多糖的基质[2]，而牛心包组织中胶原的含量达90%，主要是Ⅰ型胶原，Ⅲ型胶原含量很少，弹力纤维的含量少于1%[3]. 猪主动脉瓣组织在复杂高压血流冲击下长成，其胶原、弹力纤维网状结构可能编织得更致密，更合理，特别是高含量的弹力纤维在猪主动脉瓣中呈蜂窝状结构，使胶原束在其网孔中穿过，有助于保持胶原纤维的形态. 疏水性的弹力纤维[1]可能使水分不易在瓣叶组织中大量蓄积，厚度不致显著增加.
热皱缩温度(shrinkage temperature, ST)一直被视为反映胶原材料交联度的良好指标，热皱缩温度高，说明交联度高，热稳定性好. 新鲜瓣叶去细胞前后，ST值无明显差别，说明此细胞提取过程不影响瓣叶组织纤维网的结构.新鲜瓣叶去细胞前后，抗张力强度没有明显改变.
本方法去除猪主动脉瓣的细胞成分，不损伤其生物力学性能，从而有可能增强其抗钙化能力，大大降低宿主对瓣膜组织的免疫反应[4]，可延长其寿命. 同时，去除细胞成分的猪主动脉瓣组织是一种良好的纤维框架，也可以用于构建组织工程瓣膜[5].
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作者简介：金振晓(1970-)， 男(汉族)， 山西省晋城市人. 博士, 助教.
Tel. (029)3373135 Email. jinzx@fmmu.edu.cn
参考文献：
[1] Courtman DW, Pereira CA, Kashef V et al. Development of a pericardial acellular matrix biomaterial: Biochemical and mechanical effects of cell extraction [J]. J Biomed Mater Res, 1994; 28(6): 655-666.
[2] Wilson GJ, Yeger H, Klement P et al. Acellular matrix allograft small caliber vascular prostheses [J]. ASAIO Trans, 1990; 36(1): M240-243.
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[3] Scott M, Vesely I. Aortic valve cusp microstructure: The role of elastin [J]. Ann Thorac Surg, 1995; 60(Suppl 2): s391-s394.
[4] Goldstain S, Black K, Clarke D et al. Inflammatory responses to uncross-linked xenogeneic heart valve matrix [abstr] [A]. In: Goldstain S et al eds. World Symposium on Heart Valve Disease [M]. London: publisher unknown, 1999: 205.
[5] Gerosa G. The V.E.S.A.L.I.O project, the "autograft" homograft valve [abstr]. In: Gerosa G et al eds. Tissue engineering for heart valve bioprostheses [M]. London: publisher unknown, 1999: 22-23.
收稿日期：1999-10-19； 修回日期：1999-12-23, 百拇医药