先天性心脏病患儿心肌缺血前后CP,ATP,ADP及AMP的变化
作者：徐学增 李彤 杨景学
单位：徐学增(第四军医大学西京医院心血管外科中心,陕西 西安 710033)；李彤(第四军医大学西京医院心血管外科中心,陕西 西安 710033)；杨景学(第四军医大学西京医院心血管外科中心,陕西 西安 710033)
关键词：高效液相色谱；未成熟心肌；三磷酸腺苷；二磷酸腺苷；磷酸肌酸
第四军医大学学报000515 摘 要: 目的 测量未成熟心肌缺血前后能量物质CP,ATP,ADP及AMP的变化. 方法 小于2岁先天性心脏病(CHD)患儿18例,分别于心肌缺血前后取右心耳心肌组织HPLC测定心肌能量物质CP,ATP,ADP及AMP. 结果 体外循环前,后右心 房心肌中能量物质比较发现，ATP,ADP在缺血后分别下降到缺血前的32%和64%，而CP,AMP值却保持较高水平; 按年龄1岁，分成2组(Ⅰ组>1岁；Ⅱ组<1岁).比较两组术后高能磷酸化合物水平，发现Ⅰ组AMP水平大于Ⅱ组(P<0.05)，但两组间ADP,CP,非扩散核苷酸(TNN)水平差异不显著; Ⅰ组ATP比Ⅱ组ATP恢复率低(P<0.05)，而AMP恢复率大于Ⅱ组，但两组间ADP,CP,TNN恢复率差异不显著. 结论 较低5′-NT活性可能有利于未成熟心肌中TNN的保存， 但未成熟心肌目前条件下能量物质丢失较为严重，尤其ATP的水平较低.磷酸肌酸在开放后恢复迅速，可能在复灌初腺嘌呤核苷酸水平低下下发挥了过渡作用，其机制尚待进一步研究证实.未成熟心肌在不同生长发育阶段，缺血后高能磷酸能量物质代谢可能有差异. Ⅱ组优于Ⅰ组.
中图号:R654.1 文献标识码:A
文章编号：1000-2790(2000)05-0568-03
ATP, ADP, AMP, CP in immature heart preischemia and postischemia
XU Xue-Zeng, LI Tong, YANG Jing-Xue
(Center of Cardiovascular Surgery, Xijing Hospital, Fourth Military Medical U niversity, Xi'an 710033, China)
Abstract: AIM To determinate the levels of ATP, ADP,AMP, CP with high-performance liquid chromatography in immature hearts which underwent cardiopulmonary bypass. METHODS Eighteen infants (10 boys and 8 girls) with congenital heart disease were examined. The mean age of (11.2±7.8) months was within the range of 19 days to 24 months,and 8 patients were less than 12 months. The mean body weight was (10.2±3.13) kg with a range of 3.0 to 13.8 kg. The high-energy phosphate bond of right cardiac atrium was measured in prebypass an d postbypass. RESULTS After reperfution, ATP, ADP were redused to 34.6%, 63.6% of baseline, while CP kept a high level. Then the patients were divided into two gr oups by age: Group I (less than 12 months, n=8); Group II (more than 12 months, n =10). The rate of recovery of ATP (31.7%) in group I was lower than in groupII (48.2%, P<0.0 5), while AMP (104.1%) was higher than group II (63.1%, P<0.01). No difference wa s observed in ADP, CP, the total nondiffusible nucleotides (TNN. except IMP) between two gr oups. CONCLUSION In spite of lower activity 5′NT, high-energy phosphate depletion in the immature heart was higher than expected. The quick retrieve of CP may be intergradient. The immature heart may have an age-related differences level of ATP, AMP postischemia. In this study, group II had a better result than group I .
Keywords: high-performance liquid chromatography; immature heart ; adenosine triphosphate; adenosine diphosphate; phosphocreatine
0 引言
心血管疾病手术中的心肌保护，是心血管外科长期努力但仍未妥善解决的课题.心脏外科手术危重,复杂病例增多的同时，更向婴幼儿发展.现在几乎所有的先心病(CHD)患儿都能得到手术纠正，然而，尽管实验研究证实未成熟心肌可能对缺氧缺血有较好的耐受性，但是临床婴幼儿心脏手术死亡率仍高于成人.与成熟心肌相比，未成熟心肌在结构,功能,能量代谢,细胞钙调节以及对缺血缺氧耐受性等方面都存在明显差异. 在手术缺血前后能量物质即高能磷酸化合物磷酸肌酸,腺嘌呤核苷三磷酸,腺嘌呤核苷二磷酸,腺嘌呤核苷一磷酸含量的变化程度，是判断手术心肌保护，术后预后情况的一个重要指标. 有必要研究人类未成熟心肌在心肌停跳条件下高能化合物耗竭情况.阐明未成熟心肌缺血再灌注后心肌功能损害的生化基础.
1 对象和方法
1.1 对象 小于2岁CHD患儿18(男10，女8)例，年龄19 d～24 mo(平均11.2±7.8) mo，12 mo内为8例，体质量(10.2±3.1) kg,范围3～13.8 kg.病种包括房间隔缺损(ASD) 8例，室间隔缺损(VSD) 10例.
1.2 方法 心内直视手术均在低温体外循环下进行，采用St ockert-Shiely人工心肺机(德国)，应用Maxchi小儿膜式氧合器和西京87鼓泡式氧合器，转流中血球压积稀释在(18±6)%，灌注流量为110～146 (132±18) mL.kg-1.min-1 ，升主动脉阻断时间9～56 (28±12) min，体外循环时间41～134(63±22) min, 降温幅度25～29 (25±3)℃.分别于建立体外前和开放前时取右心耳心肌组织约40 mg，立即送电子天秤准确称量标记后放入液氮保存(时间<1.5 min)按50 mg心肌组织加入0.42 moL.L-1高氯酸600 μL，匀浆，混匀器混匀，3000 r.min -1低温(4℃)离心5 min，取上清液200 μL加入0.1 mol.L-1 KOH，调pH为6.24，混匀器混匀，低温(4℃)离心10 min，取上清液100 μL待测. 色谱柱HYPERSIC:ODSⅡ; 柱温20℃～24℃; pH值：6.24;流速：0.8～1.0 mL.min-1; 0.1 mol.L-1磷酸钾缓冲液;紫外检测波长：254, 210 nm; 进样量10 μL，灵敏度: 0.01 μmol.L-1.
2 结果
体外循环前、后右心房心肌中能量物质比较发现，ATP，ADP在缺血后分别下降到缺血前的32%和64%，而CP,AMP值却保持较高水平(Tab 1).
表1 缺血前后ATP, ADP, AMP, CP值
Tab 1 ATP, ADP, AMP, CP levels during
preischemia and postischemia (n=18,
±s, mmol.g-1) ItemPreischemia
Postischemia
Rate/%
ATP
0.32±0.09
0.10±0.04
32
ADP
0.20±0.06
0.13±0.07
64
AMP
0.05±0.09
0.06±0.02
121
CP
0.41±0.10
0.37±0.20
90
TNN
0.57±0.13
0.29±0.09
51
按年龄1岁为界，分成2组(Ⅰ组>1岁 ；Ⅱ组<1岁).比较两组术后高能磷酸化合物水平，发现Ⅰ组AMP水平大于Ⅱ组(P<0.05)，但两组间ADP,CP,TNN水平差异不显著; Ⅰ组ATP比Ⅱ组ATP恢复率低(P<0.05)，而AMP恢复率大于Ⅱ组(P<0.05)，但两组间ADP,CP,TNN恢复率差异不显著(Tab 2).
表2 不同年龄组缺血前后ATP, ADP, AMP, CP变化和恢复率
Tab 2 Change and retrieve of ATP, ADP, AMP, CP in age-relate different heart[ JY〗(μmol.L-1, %) Item
>1 yr
<1 yr
Preischemia
Pos t ischemia
%
Prei schemia
Postischemia
%
ATP
0.27±0.07
0. 08±0.05
32
0.35±0.11
0.17±0.08
48
ADP
0.21±0.10
0.12±0.06
54
0.20±0.10
0.13±0.04
63
AMP
0.07±0.03a
0.07±0.02
104
0.02±0.01
0.01±0.01
6 3
CP
0.41±0.01
0.37±0.11
90
0.43±0.11
0.38±0.05
88
TNN
0.55±0.12
0.27±0.12
49
0.62±0.11
0.31±0.08
50
aP<0.05 vs <1 yr.
3 讨论
高能磷酸盐贮备保存在维持细胞活力方面起关键作用，决定着再灌注时收缩功能能否恢复.心肌组织在缺血后， ATP逐步分解为ADP,AMP,IMP(次黄嘌呤核苷酸)，这些前体是非扩散的，因而在心肌恢复血流时，可以再磷酸化产生ATP.但如果AMP,IMP进一步降解，就会产生核苷,腺苷,次黄嘌呤核苷等物质，这些物质是可扩散的，并可在再灌注的时候被洗脱，而不能再参与ATP的合成. Smolenski等[1]研究发现，AMP的合成和降解始终进行，当细胞ATP耗竭时，AMP的降解主要依靠细胞内核苷酸酶的催化，而细胞外核苷酸酶的催化,腺嘌呤脱氨酶脱氨基,次黄嘌呤氧化还原酶外流作用较小.因此，5-核苷酸酶(5-NT)在未成熟心肌的ATP,ADP,AMP降解方面有重大意义，特别是与膜结合的5-NT活性较强.研究认为由于未成熟心肌缺乏富含5-NT T小管结构，在缺氧条件下，高能磷酸盐代谢产物与[AMP]浓度呈指数函数(r=0.95).因此，抑制5-NT活性或减少[AMP]浓度都将有助于保存TNN..成熟心肌中通过使用5-NT抑制剂丙酮可可碱(pentoxifyline)，在缺血后，使得ATP含量得到一定的维持.在未成熟心肌中，由于其5-NT活性只是成熟心肌的68%，因此这种低活性5-NT使未成熟心肌在缺血后ATP代谢的中间产物及合成前体丢失较少.Olszarski应用丙酮可可碱于幼兔未成熟心肌保护，发现缺血末,开放初期，TNN含量显著高于对照组.但是Pridjian发现相对成熟心肌，兔未成熟心肌在使用5-NT抑制剂并未取得理想效果.心肌缺血后，TNN水平低下.本试验虽然主动脉阻断时间较短，且处于低温缺血状态，也发现人类未成熟心肌手术后其TNN.水平也处于较低水平.这种现象具体机制仍不清楚.但是，现在还没有研究证实重新合成腺嘌呤核苷酸池的反应[从核糖-5-磷酸+ATP至PRPP(磷酸核糖焦磷酸)复合物形成核苷酸]在未成熟心肌缺血后腺嘌呤核苷酸池重建中发挥明显作用.假设5-NT对AMP,IMP的降解对保护高能磷酸盐发挥巨大作用，在Pridjian等[2]试验研究的结果不一致，其可能性可能有以下几点：在Pridjian试验中其灌注方法是对未成熟心肌有影响的多次灌注.而多次灌注对于高能磷酸盐能量贮存有一定的影响. Smolenski等[1]通过对比成人与婴幼儿在手术中磷酸盐和嘌呤类代谢产物发现：第2次灌注时，冠脉中腺苷,肌苷,次黄嘌呤,磷酸盐,乳酸漏出量，儿童是成人的1.5～2.5倍；而在第3次灌注时，达到3～7倍于成人.另一方面多次灌注可以冲洗掉血管内表面的血细胞和蛋白质，增加微血管的通透性，加重心肌水肿，使血管较脆弱的未成熟心肌的血管通透增加.因此，在多次灌注冲刷后，可能导致心肌腺嘌呤核苷酸大量漏出，心肌腺嘌呤核苷酸水平下降.William等[3]以为，冷挛缩对未成熟心肌造成的损伤可能比随后缺血期间对心肌造成的损害更大，虽然，冷挛缩情况下心肌能量代谢的生物化学变化尚不清楚，但这种机械电活动对于婴幼儿心肌能量物质贮存是有害的.而在本实验中特别是在1岁以下婴幼儿在快速转流降温时，亦可能存在部分心脏出现痉挛,心肌实质僵硬现象而产生无谓机械电活动有关.另外，病理条件下也会形成心脏复灌后高能磷酸化合物恢复延迟.Smolenski等[4]通过结扎鼠主动脉诱发心肌肥厚，研究肥厚心肌缺血后高能磷酸盐能量变化，发现虽然缺血前心肌高能磷酸盐能量无明显变化，缺血后CP,ATP水平明显低于对照组[(46.3±2.8) μmol.g-1， (61.8±4.9) μmol.g-1].而且恢复冠脉血流后，CP恢复时间(2 min)明显低于对照组(4 min). Saupe等[5]认为心衰与心肌中CK-MB活性和数量降低有关，CK-MB活性和数量降低使ADP增加,ATP耗竭.此处酸中毒,儿茶酚胺类[6]药物使用也会形成心脏复灌后高能磷酸化合物恢复延迟.从结构上看，婴幼儿尚未发育成熟的线粒体功能低下，虽然婴幼儿心肌收缩力较弱，但由于心搏的增加，术后血流动力学的改变，从而未成熟心肌在开放后能量需求可能增大，也可能加重了心肌能量代谢的负担.实验表明未成熟心肌，尤其是小于1岁的患儿心肌缺血后其心肌耗氧量(MVO2)增加量占大于1岁心肌的52%[7]，所有这些都延迟未成熟心肌能量的恢复.磷酸肌酸(CP)做为心肌缺血后首选的能量物质，常温下其耗竭不超过3 min.肌酸几乎100%成离子状态，参与CP形成，CP高恢复率某种程度替代了复灌后ATP的不足，在未成熟心肌能量恢复过程中可能发挥其过渡作用，而TNN中AMP的增高也可能是未成熟心肌5-NT活性较低，从而使得较多的TNN.得以保存，但是TNN水平低下，也同时反映目前未成熟心肌保护中能量物质的保存仍不令人满意.
本结果发现，婴幼儿(Ⅰ组)缺血前后ATP恢复的水平较年长儿(Ⅱ组)较差，而AMP恢复水平比年长儿稍好，而TNN,CP,ADP水平缺血后两组间未见差异.这种高能磷酸盐量的“转移”，表明年长儿缺血后高能磷酸盐效率增高，其心肌能量状况稍佳于Ⅰ组，其具体机制尚不清楚.有实验表明未成熟心肌，尤其是小于1岁的患儿心肌缺血后其心肌耗氧量(MVO2)增加量仅占大于1岁心肌的52%[8].结果发现似乎Ⅱ组婴儿更适于目前心肌保护环境，但两者间的差异是否由于心肌发育不同阶段结构上的不同引起，有待进一步探讨.
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39500144)
作者简介：徐学增(1973-)， 男(汉族)， 山东省莱州市人. 硕士 , 医师. Tel.(029)3375311 Email. xu@fmmu.edu.cn
参考文献：
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收稿日期:2000-01-15; 修回日期:2000-02-16