犬细小病毒弱毒株的分离及疫苗应用
作者：李六金 金昌德 李秦 押宗保 施新猷 张海 张志培
单位：李六金(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；金昌德(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；李秦(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；押宗保(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；施新猷(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；张海(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；张志培(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)
关键词：犬细小病毒；病毒；分离；疫苗
第四军医大学学报000626 摘要: 目的 从犬四联弱毒样品中分离获得一株细小病毒(CPV)弱毒株，用于疫苗制备. 方法 根据犬副流感的血球吸附特性、细胞培养特性以及异种病毒抗血清阻断法分离病毒. 该病毒简称为CPV-XN1株. 并对犬细小病毒疫苗的免疫性和动物安全性进行了研究. 结果 病毒分离后其血凝效价(HA)值为1∶1024～1∶4096或107.0 TCID50；在电镜下可见较典型的犬细小病毒形态结构特征；免疫电镜下见到抗体分子已被吸附在病毒颗粒表面；病毒接种到健康幼犬后15 d内未发现仔犬死亡；实验组犬均未出现临床症状；疫苗保存6 mo，其效价只降低一个滴度. 结论 该毒株可作为犬多联病毒弱毒疫苗的候选毒株.
, 百拇医药
中图号:S852.653 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)06-0728-03
Isolation of canine parvovirus attenuated vaccinal strand and its vaccine application
LI Liu-Jin JIN Chang-De LI Qin YA Zong-Bao SHI Xin-You ZHANG Hai ZHANG Zhi-Pei
(Laboratory Animal Research Center， Fourth Military Medical University, Xi' an 710033, China)
Abstract:AIM To produce a polyvalent vaccine by isolating a strain of canine parvovirus (CPV) attenuated strain from quadrivalent attenuated sample. METHODS Using erythrocyte absorption experiment, cell culture and hererovirus anti-serum blocking assaying,CPV was isolated. The obtained virus was named CPV-XN1. Its immunological character and animal security were analyzed in vitro. RESULTS The HA titer of CPV-XN1 was 1∶1024～1∶4096 or TCID50 10-7.0. CPV-XN1 had a typical CPV morphological character under electron microscope, antibody molecules could be observed to absorb on the surface of virus particles. After inoculating CPV vaccine against healthy infant dogs, we found on death in 15 days. The vaccine validity only fell one titer in 6 moths. CONCLUSION This virus strain can serve as a candidate for strain of canine polyvalent attenuated vaccine.
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Keyword:canine parvovirus; virus; isolation; vaccine
0 引言
犬细小病毒(CPV)是犬的一种新病原体. 它所引起的流行性肠炎，是对当今世界犬业威胁和危害最严重的急性、接触性传染病. CPV为细小病毒科、细小病毒亚科、细小病毒属成员. 该病毒能引起急性、接触性传染病. 临床常出现出血性、坏死性肠炎症状. 该病已传遍世界各类犬群，野生和家养犬群中均有CPV广泛蔓延，故彻底消除该病已成为一大难题[1-5]. 因此，防治犬细小病毒性肠炎已成为长期而艰巨的任务，研制安全有效的疫苗就显得十分重要.
1 材料和方法
1.1 病毒 犬四联弱毒样品由西北农林大学预防兽医学院李健强教授馈赠，强毒株 CPV-XN931株系本实验室从我国西安某地患本病犬群的病犬粪样中分离、鉴定而获得的强毒株.
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1.2 免疫血清 本中心实验室制备兔抗犬细小病毒血清.
1.3 传代细胞 F81和MDCK，由本校动物保健品研制中心提供.
1.4 实验动物 本实验选用7窝非疫区并且未曾注射过任何疫苗的43只2 mo龄健康断奶犬.
1.5 分离病毒 取4支犬四联弱毒样品，每支用1 mL灭菌三蒸水溶解，冻融一次之后静置4～8℃ 5 h，使其分层，然后取中间层0.5 mL. 按50 mL的剂量加入先锋霉素，再按1/5量加入兔抗犬瘟热和兔抗犬副流感高免血清， 37℃作用30 min后用微型滤器 (滤膜孔径为0.22 mm)过滤，然后用猪红细胞吸附浓缩滤液， 使疫苗中的病毒颗粒吸附到红细胞膜上，以1000 r.min-1离心10 min,取沉淀物，用Hank’s液稀释后置-20℃冻存备用. 将上述处理好的样品冻融两次后，按营养液的1/10量接种在不同代次F81和MDCK细胞单层，次日换液，观察3～5 d，待出现CPE以后收毒，在-20℃冻存备用. 1.6 电镜观察 收集接毒后7 d的Vero细胞培养液10 mL作为负染样品，按常规方法负染色.
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1.7 免疫电镜观察 取5.0 mL病毒细胞培养物，加0.1 mL兔抗CPV高免血清，混匀，置37℃温室作用60 min,以4000 r.min-1离心20 min,弃上清液，用一滴蒸馏水使沉淀物悬浮，按常规法负染后作电镜观察.
1.8 测定病毒TCID50 按10-1～10-8量将CPV-XN1株接种在F81细胞单层上，于37℃培养，逐日观察细胞CPE，以50%以上细胞病变作为阳性判定标准[6].
1.9 血凝与血凝抑制(HA-HI)试验 按HA-HI常规操作方法进行[6].
1.10 中和试验 按稀释血清-固定病毒方法进行. 按固定病毒-稀释血清法进行. 即连续2倍稀释兔抗细小病毒血清，稀释到1024. 每个稀释度以0.25 mL标准血清与CPV-XN1混合感作1h，在室温条件下取0.25 mL混合液加到F81细胞单层上，34～37℃静置培养4～10 d，逐日观察CPE. 测定中和抗体效价.
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1.11 复制弱毒株(疫苗)
1.11.1 生产制苗毒液 按照Zhang[7]筛选的细小病毒最佳培养条件，同步接毒感染F81株猫肾细胞，以无血清克氏瓶静置或大立瓶旋转培养法生产CPV弱毒液. 制苗用种毒，是HA为1∶1024或TCID5010-7.0.mL-1的CPV-XN1株，种毒代次限制在细胞培养物上5代以内.
1.11.2 疫苗配制 HA为1∶1024或TCID5010-7.0.mL-1以上的CPV-XN1株细胞培养液，按一定比例加入保护剂和抗生素，在意大利冻干机内以特定条件冻干制成疫苗，即CPV弱毒冻干疫苗. -20℃冻存备用.
1.11.3 无菌检验 按常规方法检查有无杂菌污染.
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1.11.4 安全试验 对3只犬分别接种CPV弱毒疫苗0.4,0.8,2.0 mL，疫苗效价为≥1∶1024或TCID5010-6.0.mL-1. 2只对照犬不注苗，但与注苗犬同居. 注苗15 d内逐日观察临床表现(包括精神、饮水、食欲、被毛、体况、粪便等)，并观察局部变化，同时用HA-HI试验逐日检测犬粪便中是否有CPV疫苗毒排出.
1.11.5 效力试验 ①免疫产生期和适宜免疫剂量试验:16只犬随机分为4组，每组4只. 其中，1,2,3组均选3只注射疫苗，其HA效价分别为1∶4096,1∶1024和1∶256或TCID50为10-5.7,10-5.0 和10-4.5.mL-1的CPV弱毒疫苗0.2 mL，留一只犬不注苗，以作同居对照. 4组4只犬不注苗，作为正常对照. 注苗后逐日观察临床表现和注射局部反应，并于0,5,10和15 d分别采血分离血清，测定HI和SN效价. 15 d时14只犬均口服接种HA效价为1∶4096的CPV强毒液10.0 mL进行攻击，15 d内逐日观察临床表现，并检测粪便HA效价. ②免疫期和保护期试验:12只犬分3组. A组接种-20℃保存1 mo HA效价仍为1∶1024的CPV弱毒疫苗各0.2 mL. B组接种-20℃保存6 mo HA效价由1∶1024降至1∶512的CPV各0.2 mL. C组4只犬不注苗，作为对照. 注苗后0,1,3和6 mo分别采血测定血清HI和SN抗体效价，并观察临床表现. 6 mo时12只犬均口服接种HA效价为≥1∶1024的CPV强毒液10.0 mL，攻毒后15 d内逐日观察临床表现，并采粪样测定HA效价，以确定是否排出CPV强毒.
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2 结果
2.1 细胞筛选 F81细胞比MDCK细胞对CPV弱毒株敏感.
2.2 电镜观察 在病毒细胞培养物中，观察到了直径约为22 nm的病毒粒子. 粒子的形态为圆形或六角形，衣壳呈十二面对称，衣壳的内部是核酸. 镜下所见多数粒子内部是充实的，通常称为实心或完全粒子. 该粒子呈白色外观，这是由于PTA浸入，呈带有白色轮廓的暗色粒子，通常称为空心或不完全粒子.
图 1 犬细小病毒(CPV)粒子免疫复合物
Fig 1 CPV particle immunlogic complex
2.3 免疫电镜样品观察 将病毒细胞培养物与兔抗CPV高免血清按一定比例混合后，观察抗原-抗体复合物. 镜下发现由直径为22 nm、圆形粒子构成的大块复合体. 免疫复合体主要由实心粒子构成，不过其中也有相当数量的空心粒子. 在粒子之间可以看到抗体桥联结构(Fig 1).
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2.4 血凝与血凝抑制(HA-HI)试验与病毒TCID50 血凝效价为1∶1024～1∶4096，TCID50为10-7.0.mL-1.
2.5 中和试验 1∶128～1∶1024的不同梯度免疫血清与CPV-XN1作用后，其复合物在F81细胞均未出现CPE.
2.6 动物安全试验 注苗15 d内实验组和对照组的5只犬均未出现任何不良反应和肠炎症状.
2.7 效力试验
2.7.1 适宜免疫剂量和免疫产生期试验 HA为1∶4096和1∶1024或TCID50为10-7.6～10-7.0.mL-1的CPV弱毒疫苗接种犬后，其HI抗体水平基本相同；HA为1∶256或TCID50为10-6.5.mL-1的CPV弱毒疫苗接种犬，HI水平略低. 但3个不同滴度疫苗及其同居犬对照均产生抗体应答，并能抵抗CPV强毒攻击，既不出现肠炎症状也不经粪便排出CPV强毒. 4只正常对照犬不产生抗体应答，攻毒后均出现腹泻症状，且从粪便中排出CPV强毒. 其中一只犬于攻毒后第9日因衰竭而死亡. 根据这些试验结果，确定HA为1∶1024或TCID50为10-7.0.mL-1的弱毒疫苗0.2 mL为适宜免疫剂量，15 d内产生坚强免疫力.
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2.7.2 免疫期和保存期试验 保存期1 mo和6 mo的CPV弱毒疫苗的HA分别是1∶1024和1∶512或TCID50为10-7.0.mL-1和10-6.7.mL-1，接种犬后1～6 mo的血清HI抗体效价分别为1∶512～1∶2048. 对照犬不注苗，抗体滴度为阴性. 5 mo时12只犬均经胃投管接种HA为1∶4096或TCID50为10-8.6.mL-1，攻击15 d内，8只免疫犬表现正常，无肠炎症状，亦未排毒. 而4只对照犬出现急性肠炎症状，粪便中排出有CPV强毒，其中1只衰竭死亡. 从以上结果可知，疫苗的免疫期和保存期均不低于6 mo.
3 讨论
将弱毒样品经F81猫肾细胞培养增殖，筛选血凝效价(HA)为1∶1024～1∶2048，TCID50为 10-5.0.mL-1的毒株作为制苗用种毒. 负染和免疫电镜观察结果，有大量细小病毒粒子存在；可被我国现有CPV强毒免疫血清抑制. 免疫动物可以获得坚强免疫力. 本实验室所制疫苗相当安全，适用于扩大区域试验，所分毒种为制作犬的多联苗提供了优良毒株. 用该毒株所制的疫苗免疫犬只后5～180 d，其血清HI抗体效价分别可达1∶64～1∶2048，其相应的中和指数为3.5-4.3，且能抵抗我国现有的CPV强毒. 实验表明，该疫苗以0.2 mL注射8 wk龄以上的血清抗体阴性犬，在15 d内产生坚强免疫力，免疫期不低于6 mo；将该制品置-20℃保存，其保质期不低于6 mo，保护率为98.65%. 近500只野外新生犬在生后6,8和14 wk龄时分别im CPV弱毒疫苗(HA 1∶1024，TCID50为10-7.0.mL-1)，在第3次免疫后的第14日，其血清HI抗体达1∶256～1∶1024，0.5 a观察期内未发生病毒性肠炎，而在陕西关中疫区未注苗的犬仍流行本病，注苗犬群1，2 a内未发生犬肠炎流行. 由此可见CPV-XN1毒株为适合我国犬群的疫苗候选毒株.
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基金项目：国家火炬计划[火炬发(1997)109号]
作者简介：李六金(1951-)，男(汉族)，陕西省合阳县人. 硕士，副教授. Tel.(029)2513031 Email.liujin@fmmu.edu.cn
参考文献:
[1] Pollook RV, Coyne MJ. Canine Parvoviurs[J]. Vet Clin North [Am Small Anim Pract], 1993;23(3):555-568.
[2] Parrish CR，Aguadro CF，Strasshein ML et al. Rapidantigenic-type replacement and DNA sequence evolution of canine parvovirus[J]. J Virol，1991；65(2)：6544.
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[3] Burtonboy S，Charlier P，Hertoghs J et al. Performance of high titer attenuated canine parvovirus vaccine in pups with maternally derived antibody[J]. Vet Rec， 1991；128(7)：337-381.
[4] Buonavoglia C，Tollis M，Buonavglia D et al. Response of pups with maternal derived antibody to modified—live canine parvovirus vaccine[J]. Comp Immunol Microbiol Infect Dis，1992；15(4)：281-283.
[5] Lopez de Turiso JA，Cortes E，Martinez C et al. Recombinant vaccine for canine parvovirus in dogs[J]. J Virol，1992；66(5)：2748-2753.
[6] 殷 震，刘景华. 动物病毒学[M]. 第2版. 北京：科学出版社， 1997：204-437.
[7] Zhang DL. Studies on preparation of inactivated vaccines from cell cultures of mink enteritis Virus(MEV)and their immunity[J]. Series B，1991；(8)：847-962.
收稿日期：1999-12-01
修回日期：2000-01-10, 百拇医药
单位：李六金(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；金昌德(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；李秦(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；押宗保(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；施新猷(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；张海(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)；张志培(第四军医大学实验动物研究中心，陕西 西安 710033)
关键词：犬细小病毒；病毒；分离；疫苗
第四军医大学学报000626 摘要: 目的 从犬四联弱毒样品中分离获得一株细小病毒(CPV)弱毒株，用于疫苗制备. 方法 根据犬副流感的血球吸附特性、细胞培养特性以及异种病毒抗血清阻断法分离病毒. 该病毒简称为CPV-XN1株. 并对犬细小病毒疫苗的免疫性和动物安全性进行了研究. 结果 病毒分离后其血凝效价(HA)值为1∶1024～1∶4096或107.0 TCID50；在电镜下可见较典型的犬细小病毒形态结构特征；免疫电镜下见到抗体分子已被吸附在病毒颗粒表面；病毒接种到健康幼犬后15 d内未发现仔犬死亡；实验组犬均未出现临床症状；疫苗保存6 mo，其效价只降低一个滴度. 结论 该毒株可作为犬多联病毒弱毒疫苗的候选毒株.
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中图号:S852.653 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)06-0728-03
Isolation of canine parvovirus attenuated vaccinal strand and its vaccine application
LI Liu-Jin JIN Chang-De LI Qin YA Zong-Bao SHI Xin-You ZHANG Hai ZHANG Zhi-Pei
(Laboratory Animal Research Center， Fourth Military Medical University, Xi' an 710033, China)
Abstract:AIM To produce a polyvalent vaccine by isolating a strain of canine parvovirus (CPV) attenuated strain from quadrivalent attenuated sample. METHODS Using erythrocyte absorption experiment, cell culture and hererovirus anti-serum blocking assaying,CPV was isolated. The obtained virus was named CPV-XN1. Its immunological character and animal security were analyzed in vitro. RESULTS The HA titer of CPV-XN1 was 1∶1024～1∶4096 or TCID50 10-7.0. CPV-XN1 had a typical CPV morphological character under electron microscope, antibody molecules could be observed to absorb on the surface of virus particles. After inoculating CPV vaccine against healthy infant dogs, we found on death in 15 days. The vaccine validity only fell one titer in 6 moths. CONCLUSION This virus strain can serve as a candidate for strain of canine polyvalent attenuated vaccine.
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0 引言
犬细小病毒(CPV)是犬的一种新病原体. 它所引起的流行性肠炎，是对当今世界犬业威胁和危害最严重的急性、接触性传染病. CPV为细小病毒科、细小病毒亚科、细小病毒属成员. 该病毒能引起急性、接触性传染病. 临床常出现出血性、坏死性肠炎症状. 该病已传遍世界各类犬群，野生和家养犬群中均有CPV广泛蔓延，故彻底消除该病已成为一大难题[1-5]. 因此，防治犬细小病毒性肠炎已成为长期而艰巨的任务，研制安全有效的疫苗就显得十分重要.
1 材料和方法
1.1 病毒 犬四联弱毒样品由西北农林大学预防兽医学院李健强教授馈赠，强毒株 CPV-XN931株系本实验室从我国西安某地患本病犬群的病犬粪样中分离、鉴定而获得的强毒株.
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1.2 免疫血清 本中心实验室制备兔抗犬细小病毒血清.
1.3 传代细胞 F81和MDCK，由本校动物保健品研制中心提供.
1.4 实验动物 本实验选用7窝非疫区并且未曾注射过任何疫苗的43只2 mo龄健康断奶犬.
1.5 分离病毒 取4支犬四联弱毒样品，每支用1 mL灭菌三蒸水溶解，冻融一次之后静置4～8℃ 5 h，使其分层，然后取中间层0.5 mL. 按50 mL的剂量加入先锋霉素，再按1/5量加入兔抗犬瘟热和兔抗犬副流感高免血清， 37℃作用30 min后用微型滤器 (滤膜孔径为0.22 mm)过滤，然后用猪红细胞吸附浓缩滤液， 使疫苗中的病毒颗粒吸附到红细胞膜上，以1000 r.min-1离心10 min,取沉淀物，用Hank’s液稀释后置-20℃冻存备用. 将上述处理好的样品冻融两次后，按营养液的1/10量接种在不同代次F81和MDCK细胞单层，次日换液，观察3～5 d，待出现CPE以后收毒，在-20℃冻存备用. 1.6 电镜观察 收集接毒后7 d的Vero细胞培养液10 mL作为负染样品，按常规方法负染色.
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1.7 免疫电镜观察 取5.0 mL病毒细胞培养物，加0.1 mL兔抗CPV高免血清，混匀，置37℃温室作用60 min,以4000 r.min-1离心20 min,弃上清液，用一滴蒸馏水使沉淀物悬浮，按常规法负染后作电镜观察.
1.8 测定病毒TCID50 按10-1～10-8量将CPV-XN1株接种在F81细胞单层上，于37℃培养，逐日观察细胞CPE，以50%以上细胞病变作为阳性判定标准[6].
1.9 血凝与血凝抑制(HA-HI)试验 按HA-HI常规操作方法进行[6].
1.10 中和试验 按稀释血清-固定病毒方法进行. 按固定病毒-稀释血清法进行. 即连续2倍稀释兔抗细小病毒血清，稀释到1024. 每个稀释度以0.25 mL标准血清与CPV-XN1混合感作1h，在室温条件下取0.25 mL混合液加到F81细胞单层上，34～37℃静置培养4～10 d，逐日观察CPE. 测定中和抗体效价.
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1.11 复制弱毒株(疫苗)
1.11.1 生产制苗毒液 按照Zhang[7]筛选的细小病毒最佳培养条件，同步接毒感染F81株猫肾细胞，以无血清克氏瓶静置或大立瓶旋转培养法生产CPV弱毒液. 制苗用种毒，是HA为1∶1024或TCID5010-7.0.mL-1的CPV-XN1株，种毒代次限制在细胞培养物上5代以内.
1.11.2 疫苗配制 HA为1∶1024或TCID5010-7.0.mL-1以上的CPV-XN1株细胞培养液，按一定比例加入保护剂和抗生素，在意大利冻干机内以特定条件冻干制成疫苗，即CPV弱毒冻干疫苗. -20℃冻存备用.
1.11.3 无菌检验 按常规方法检查有无杂菌污染.
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1.11.4 安全试验 对3只犬分别接种CPV弱毒疫苗0.4,0.8,2.0 mL，疫苗效价为≥1∶1024或TCID5010-6.0.mL-1. 2只对照犬不注苗，但与注苗犬同居. 注苗15 d内逐日观察临床表现(包括精神、饮水、食欲、被毛、体况、粪便等)，并观察局部变化，同时用HA-HI试验逐日检测犬粪便中是否有CPV疫苗毒排出.
1.11.5 效力试验 ①免疫产生期和适宜免疫剂量试验:16只犬随机分为4组，每组4只. 其中，1,2,3组均选3只注射疫苗，其HA效价分别为1∶4096,1∶1024和1∶256或TCID50为10-5.7,10-5.0 和10-4.5.mL-1的CPV弱毒疫苗0.2 mL，留一只犬不注苗，以作同居对照. 4组4只犬不注苗，作为正常对照. 注苗后逐日观察临床表现和注射局部反应，并于0,5,10和15 d分别采血分离血清，测定HI和SN效价. 15 d时14只犬均口服接种HA效价为1∶4096的CPV强毒液10.0 mL进行攻击，15 d内逐日观察临床表现，并检测粪便HA效价. ②免疫期和保护期试验:12只犬分3组. A组接种-20℃保存1 mo HA效价仍为1∶1024的CPV弱毒疫苗各0.2 mL. B组接种-20℃保存6 mo HA效价由1∶1024降至1∶512的CPV各0.2 mL. C组4只犬不注苗，作为对照. 注苗后0,1,3和6 mo分别采血测定血清HI和SN抗体效价，并观察临床表现. 6 mo时12只犬均口服接种HA效价为≥1∶1024的CPV强毒液10.0 mL，攻毒后15 d内逐日观察临床表现，并采粪样测定HA效价，以确定是否排出CPV强毒.
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2 结果
2.1 细胞筛选 F81细胞比MDCK细胞对CPV弱毒株敏感.
2.2 电镜观察 在病毒细胞培养物中，观察到了直径约为22 nm的病毒粒子. 粒子的形态为圆形或六角形，衣壳呈十二面对称，衣壳的内部是核酸. 镜下所见多数粒子内部是充实的，通常称为实心或完全粒子. 该粒子呈白色外观，这是由于PTA浸入，呈带有白色轮廓的暗色粒子，通常称为空心或不完全粒子.
图 1 犬细小病毒(CPV)粒子免疫复合物
Fig 1 CPV particle immunlogic complex
2.3 免疫电镜样品观察 将病毒细胞培养物与兔抗CPV高免血清按一定比例混合后，观察抗原-抗体复合物. 镜下发现由直径为22 nm、圆形粒子构成的大块复合体. 免疫复合体主要由实心粒子构成，不过其中也有相当数量的空心粒子. 在粒子之间可以看到抗体桥联结构(Fig 1).
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2.4 血凝与血凝抑制(HA-HI)试验与病毒TCID50 血凝效价为1∶1024～1∶4096，TCID50为10-7.0.mL-1.
2.5 中和试验 1∶128～1∶1024的不同梯度免疫血清与CPV-XN1作用后，其复合物在F81细胞均未出现CPE.
2.6 动物安全试验 注苗15 d内实验组和对照组的5只犬均未出现任何不良反应和肠炎症状.
2.7 效力试验
2.7.1 适宜免疫剂量和免疫产生期试验 HA为1∶4096和1∶1024或TCID50为10-7.6～10-7.0.mL-1的CPV弱毒疫苗接种犬后，其HI抗体水平基本相同；HA为1∶256或TCID50为10-6.5.mL-1的CPV弱毒疫苗接种犬，HI水平略低. 但3个不同滴度疫苗及其同居犬对照均产生抗体应答，并能抵抗CPV强毒攻击，既不出现肠炎症状也不经粪便排出CPV强毒. 4只正常对照犬不产生抗体应答，攻毒后均出现腹泻症状，且从粪便中排出CPV强毒. 其中一只犬于攻毒后第9日因衰竭而死亡. 根据这些试验结果，确定HA为1∶1024或TCID50为10-7.0.mL-1的弱毒疫苗0.2 mL为适宜免疫剂量，15 d内产生坚强免疫力.
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2.7.2 免疫期和保存期试验 保存期1 mo和6 mo的CPV弱毒疫苗的HA分别是1∶1024和1∶512或TCID50为10-7.0.mL-1和10-6.7.mL-1，接种犬后1～6 mo的血清HI抗体效价分别为1∶512～1∶2048. 对照犬不注苗，抗体滴度为阴性. 5 mo时12只犬均经胃投管接种HA为1∶4096或TCID50为10-8.6.mL-1，攻击15 d内，8只免疫犬表现正常，无肠炎症状，亦未排毒. 而4只对照犬出现急性肠炎症状，粪便中排出有CPV强毒，其中1只衰竭死亡. 从以上结果可知，疫苗的免疫期和保存期均不低于6 mo.
3 讨论
将弱毒样品经F81猫肾细胞培养增殖，筛选血凝效价(HA)为1∶1024～1∶2048，TCID50为 10-5.0.mL-1的毒株作为制苗用种毒. 负染和免疫电镜观察结果，有大量细小病毒粒子存在；可被我国现有CPV强毒免疫血清抑制. 免疫动物可以获得坚强免疫力. 本实验室所制疫苗相当安全，适用于扩大区域试验，所分毒种为制作犬的多联苗提供了优良毒株. 用该毒株所制的疫苗免疫犬只后5～180 d，其血清HI抗体效价分别可达1∶64～1∶2048，其相应的中和指数为3.5-4.3，且能抵抗我国现有的CPV强毒. 实验表明，该疫苗以0.2 mL注射8 wk龄以上的血清抗体阴性犬，在15 d内产生坚强免疫力，免疫期不低于6 mo；将该制品置-20℃保存，其保质期不低于6 mo，保护率为98.65%. 近500只野外新生犬在生后6,8和14 wk龄时分别im CPV弱毒疫苗(HA 1∶1024，TCID50为10-7.0.mL-1)，在第3次免疫后的第14日，其血清HI抗体达1∶256～1∶1024，0.5 a观察期内未发生病毒性肠炎，而在陕西关中疫区未注苗的犬仍流行本病，注苗犬群1，2 a内未发生犬肠炎流行. 由此可见CPV-XN1毒株为适合我国犬群的疫苗候选毒株.
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基金项目：国家火炬计划[火炬发(1997)109号]
作者简介：李六金(1951-)，男(汉族)，陕西省合阳县人. 硕士，副教授. Tel.(029)2513031 Email.liujin@fmmu.edu.cn
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收稿日期：1999-12-01
修回日期：2000-01-10, 百拇医药