人VEGF基因的克隆及卵巢癌中VEGF基因重排的检测
作者：金明 赵君庸 严瑞兰 惠宏襄 王剑波 王成济 杨安钢
单位：金明 惠宏襄 王成济 杨安钢(第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室, 陕西 西安 710033)；赵君庸(西安医科大学生物化学教研室, 陕西 西安 710061)；严瑞兰(第四军医大学西京医院妇产科)；王剑波(第四军医大学基础部病理学教研室)
关键词：卵巢癌；VEGF；DNA印迹杂交
第四军医大学学报001041 摘 要: 目的 探讨VEGF高表达的卵巢癌中VEGF基因结构有无异常. 方法 用RT-PCR方法自胎盘中克隆VEGF cDNA以作为杂交探针；收集临床卵巢癌手术切除标本，以正常卵巢组织为对照，从中提取基因组DNA并进行Southern印迹杂交. 结果 序列分析表明所获得基因正确，Southern blot分析10/19呈现出大于23 kb片段和4.3 kb片段的异常片段，而不同于正常对照组织的大于30 kb，6.5 kb和2.5 kb. 结论 VEGF高表达的卵巢癌中有该基因的重排.
, 百拇医药
中图号：R737.31 文献标识吗：A
文章编号：1000-2790(2000)10-1298-03
Cloning of human VEGF gene and detection of its rearrangement in ovary cancer
JIN Ming,HUI Hong-Xiang,WANG Cheng-Ji, YANG An-Gang
(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033,China)
ZHAO Jun-Yong
, 百拇医药
(Department of Biochemistry, Xi'an Medical University, Xi'an 710061,China)
YAN Rui-Lan
(Department of Gynecology and Obstetrics,Xijing Hospital,Xi'an 710033,China)
Wang Jian-Bo
(Department of P athology, Faculty of Preclinical Medicine Fourth Military Medical University, Xi'an 710033,China)
Abstract: AIM To study whether there is a difference in the structure of V EGF gene between the normal tissue and the ovarian cancer overexpressing VEGF. METHODS VEGF cDNA was cloned from placenta by RT-PCR. The ovarian cancer samples were collected in clinic.With the normal ovarian tissue as the control, genomic DNA from the samples was extracted was extracted and compared with the normal ovarian tissue and Southern blotting was done. RESULTS VEGF cDNA clone from placenta was proved to be correct. There are three fragments (>30 kb，6.5 kb，2.5 kb) in normal control，while 10/19 samples only had two (>23kb and 4.3 kb).CONCLUSION The rearrangement of VEGF in the ovary cancer overexpressing VEGF does exist.
, http://www.100md.com
Keywords:ovarian cancer ;VEGF ; southern blot
0 引言
血管内皮生长因子[1](vascular endothelial growth factor，VEGF)是一种特异性的与血管生长有关的生长因子. 无论在胚胎发育、创伤修复等生理情况下，还是在炎症、肿瘤生长等病理情况下，与血管的发生和生长密切联系. 生理状态下，VEGF表达的调 控主要有低氧环境和其他生物因子的诱导[1]，探讨VEGF高表达的机制对于研究肿瘤生长和开展肿瘤的治疗均有重要的意义. 目前已有许多报道从基因调控的角度阐明肿瘤中VEGF高表达的机制，如Rak[2]等发现在Ras突变的细胞系中有显著的VEGF mRNA高转录和功能性VEGF蛋白的高表达，并提示突变的Ras通过直接刺激细胞和间接高调VEGF促进血管形成而引起肿瘤的发生和发展. 但对于肿瘤细胞中VEGF基因结构有无异常的变化的研究不多. 本研究以有VEGF高表达的卵巢癌标本为研究对象，用DNA印迹杂交技术研究卵巢癌中VEGF基因的重排、扩增，以期探讨卵巢癌的发病机制，结果发现在卵巢癌中有VEGF的重排.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 标本 胎盘组织、19例卵巢癌标本、1例正常卵巢标本，取自西京医 院妇产科，均经病理切片的形态学检查确诊.
1.1.2 菌种、质粒和试剂 大肠杆菌DH5α，pUC19、真核表达载体pcDNA3为本室保存，反转录kit为Gibco公司产品，限制性内切酶及T4DNA连接酶等购自原平公司，地高辛检测kit为宝灵曼公司产品.
1.2 VEGF的克隆和测序[3]
1.2.1 RT-PCR 从胎盘组织中提取总RNA，用反转录试剂盒在42℃进行反转录合成cDNA.
PCR引物为 P1：5′-CG GAA TTC ATG AAC TTT CTG CTG TCT TGG G-3′ ; P2：5′-CG AAG CTT TCA CCG CCT CGG CTT GTC ACA TC-3′ ， VEGF的引物序列的两侧分别加有EcoRI和HindⅢ内切酶位点以便利克隆. PCR反应体积为50 μL，反应条件为94℃ 45 s，55℃ 45 s,72℃ 45 s,35个循环,最后72℃ 延伸5 min. 扩增产物在含EB的8 g*L-1琼脂糖凝胶中进行电泳.
, 百拇医药
1.2.2 克隆 PCR产物用HindⅢ和EcoRI进行酶切，定向克隆入pcDNA3载 体中，同时命名反向为pcDNA3-VEGF(-).
1.2.3 DNA测序 用双脱氧终止方法进行测序反应,并上机测序(测序引物为T7启动子测序引物).
1.3 标记探针 随机引物法用地高辛标记pcDNA3-VEGF(-)，做为探针 .
1.4 卵巢癌的基因组DNA的提取、酶切、电泳及DNA印迹杂交[3] 用SDS+Triton-X100，氯 仿、异丙醇沉淀DNA，提取基因组DNA. 取DNA 10 μg经EcoRI限制性内切酶消化10 h，1 5 g*L-1琼脂糖凝胶电泳6 h，经变性，中和处理后，将凝胶DNA转印至NC膜上，80 ℃烤膜固定2 h，然后用宝灵曼公司地高辛检测试剂盒进行杂交、显色.
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2 结果
2.1 RT-PCR克隆及测序的结果 PCR产物的大小(575 bp)与我们设计的相吻合，克隆后(命名为pcDNA3-VEGF)酶切片段大小与PCR产物大小吻合(Fig 1). DNA序列测定结果(Fig 2)与GenBank人VEGF cDNA完全相同.
图 1 15 g*L-1琼脂糖凝胶电泳鉴定
Fig 1 Identification of pcDNA3-VEGF(-) by 15 g*L-1 agarose electrophoresis
1:RT-PCR;2: Digestion of pcDNA-3VEGFwith EcoRI/HindⅢ; 3: Digestion of pcDNA-3plasmid; 4: PCR Markers;5:λ-DNA/HindⅢ Markers
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图 2 VEGF基因的反向序列分析
Fig 2 Backward sequencing of VEGF gene
2.2 DNA印迹杂交结果DNA印迹杂交结果 经EcoRI消化后的DNA与VEGF探针杂交后，10例患者中出现片段为大于23 kb和4.3 kb的两条片段，而正常卵巢中出现的为大于30 kb，6.5 kb，2.5 kb三条片段(Fig 3).
图 3 DNA印迹杂交结果
Fig 3 Sourthern blot analysis
1，3～10：Ovarian cancer; 2:Normal control; M：λ-DNA/HindⅢ Markers
3 讨论
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人VEGF基因位于染色体6 p21.3[4]，全长14 kb，由8个外显子，7个内含子组 成，编码产物为34～45 kD的同源二聚体糖蛋白[4]. 在多种肿瘤中都发现有VEGF的 高表达，我们在对卵巢癌的研究中也发现有该基因的高表达[5]. 许多科学家都在探讨引发肿瘤细胞中VEGF高表达的机制. White等[6]报道 表达产物为酪氨酸蛋白激酶活的癌基因以及突变的Ras能引发高表达VEGF 6～16倍的高表达，其VEGF稳定性提高3～5倍. Baba等[7]在对胃癌的研究中也发现有VEGF的高表达 ，并认为该表达不受突变的p53影响. 卵巢癌是妇产科常见的恶性肿瘤，有许多癌基因的激活状态和抑癌基因失活，但有关人VEGF在卵巢癌组织中VEGF的扩增和重排、缺失等未见报道. 我们的研究表明，在Southern blot分析中发现与正常 组织的杂交带完全不同的新的杂交片段，10例患者中出现片段为大于23 k和4.3 kb两条片段，而正常卵巢中出现的大于30，6.5和2.5 kb三条片段. 这说明VEGF基因在卵巢癌中有重排现象，可能是引发VEGF高表达的重要原因. 应该注意的是，19例中仅有10例有重排，说明还有其他的调节机制参与其中. 有关VEGF基因突变的检测目前正在进行之中.
, http://www.100md.com
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39700147)
作者简介：金明(1963-)，男(朝鲜族)，吉林省龙井市人，学士， 实验师. Tel.(029)3374516 Ext.14
参考文献：
[1] Tischer E，Mitchell R， Hartman T et al.The human gene for vasc ular endotheloal growth factor multiple protein forms are encoded through altern ative exon splicing[J].J Biological Chem，1991；266(18)：11947-11954.
[2] Rak J，Mitsuhashi Y，Bayko L et al.Mutant ras oncogenes upreg ulate VEGF/VPF expression；implication for induction and inhibition of tumor angiogenesis[ J]，Cancer Res，1995；55(20)：4575-4580.
, 百拇医药
[3] 金冬雁，黎孟枫 译.分子克隆实验指南[M]. 第2版. 北京：科学技术出 版社，1992；474-479.
[4] Vincenti V，Cassano C，Rocchi M et al.Assignment of the VEGF gene to human chromosome 6p21.3[J].Circulation，1996；93(8)：1493-1495.
[5] 严瑞兰,惠宏襄,辛晓燕et al，血管内皮生长因子在上皮性卵巢癌中 的表达[J].第四军医大学学报，1999；20(4)：291-293.
[6] White FC，Benehacene A，Scheele JS et al，VEGF mRNA is stabili zed by ras and tyrosine kinase oncogenes，as well as by UV radiation-evidence for divergent stabilization pathways[J].Growth Factors，1997；14(2-3) ：199-212.
[7] Baba M，Konno H，Maruo Y et al，Relationship of p53 and vascul ar endothelial growth factor expression of clinicopathological factors in human scirrhous gastric cancer[J].Eur Surg Res，1998；30(2)130-137.
收稿日期：1999-12-17; 修回日期：2000-06-13, http://www.100md.com
单位：金明 惠宏襄 王成济 杨安钢(第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室, 陕西 西安 710033)；赵君庸(西安医科大学生物化学教研室, 陕西 西安 710061)；严瑞兰(第四军医大学西京医院妇产科)；王剑波(第四军医大学基础部病理学教研室)
关键词：卵巢癌；VEGF；DNA印迹杂交
第四军医大学学报001041 摘 要: 目的 探讨VEGF高表达的卵巢癌中VEGF基因结构有无异常. 方法 用RT-PCR方法自胎盘中克隆VEGF cDNA以作为杂交探针；收集临床卵巢癌手术切除标本，以正常卵巢组织为对照，从中提取基因组DNA并进行Southern印迹杂交. 结果 序列分析表明所获得基因正确，Southern blot分析10/19呈现出大于23 kb片段和4.3 kb片段的异常片段，而不同于正常对照组织的大于30 kb，6.5 kb和2.5 kb. 结论 VEGF高表达的卵巢癌中有该基因的重排.
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中图号：R737.31 文献标识吗：A
文章编号：1000-2790(2000)10-1298-03
Cloning of human VEGF gene and detection of its rearrangement in ovary cancer
JIN Ming,HUI Hong-Xiang,WANG Cheng-Ji, YANG An-Gang
(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033,China)
ZHAO Jun-Yong
, 百拇医药
(Department of Biochemistry, Xi'an Medical University, Xi'an 710061,China)
YAN Rui-Lan
(Department of Gynecology and Obstetrics,Xijing Hospital,Xi'an 710033,China)
Wang Jian-Bo
(Department of P athology, Faculty of Preclinical Medicine Fourth Military Medical University, Xi'an 710033,China)
Abstract: AIM To study whether there is a difference in the structure of V EGF gene between the normal tissue and the ovarian cancer overexpressing VEGF. METHODS VEGF cDNA was cloned from placenta by RT-PCR. The ovarian cancer samples were collected in clinic.With the normal ovarian tissue as the control, genomic DNA from the samples was extracted was extracted and compared with the normal ovarian tissue and Southern blotting was done. RESULTS VEGF cDNA clone from placenta was proved to be correct. There are three fragments (>30 kb，6.5 kb，2.5 kb) in normal control，while 10/19 samples only had two (>23kb and 4.3 kb).CONCLUSION The rearrangement of VEGF in the ovary cancer overexpressing VEGF does exist.
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Keywords:ovarian cancer ;VEGF ; southern blot
0 引言
血管内皮生长因子[1](vascular endothelial growth factor，VEGF)是一种特异性的与血管生长有关的生长因子. 无论在胚胎发育、创伤修复等生理情况下，还是在炎症、肿瘤生长等病理情况下，与血管的发生和生长密切联系. 生理状态下，VEGF表达的调 控主要有低氧环境和其他生物因子的诱导[1]，探讨VEGF高表达的机制对于研究肿瘤生长和开展肿瘤的治疗均有重要的意义. 目前已有许多报道从基因调控的角度阐明肿瘤中VEGF高表达的机制，如Rak[2]等发现在Ras突变的细胞系中有显著的VEGF mRNA高转录和功能性VEGF蛋白的高表达，并提示突变的Ras通过直接刺激细胞和间接高调VEGF促进血管形成而引起肿瘤的发生和发展. 但对于肿瘤细胞中VEGF基因结构有无异常的变化的研究不多. 本研究以有VEGF高表达的卵巢癌标本为研究对象，用DNA印迹杂交技术研究卵巢癌中VEGF基因的重排、扩增，以期探讨卵巢癌的发病机制，结果发现在卵巢癌中有VEGF的重排.
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 标本 胎盘组织、19例卵巢癌标本、1例正常卵巢标本，取自西京医 院妇产科，均经病理切片的形态学检查确诊.
1.1.2 菌种、质粒和试剂 大肠杆菌DH5α，pUC19、真核表达载体pcDNA3为本室保存，反转录kit为Gibco公司产品，限制性内切酶及T4DNA连接酶等购自原平公司，地高辛检测kit为宝灵曼公司产品.
1.2 VEGF的克隆和测序[3]
1.2.1 RT-PCR 从胎盘组织中提取总RNA，用反转录试剂盒在42℃进行反转录合成cDNA.
PCR引物为 P1：5′-CG GAA TTC ATG AAC TTT CTG CTG TCT TGG G-3′ ; P2：5′-CG AAG CTT TCA CCG CCT CGG CTT GTC ACA TC-3′ ， VEGF的引物序列的两侧分别加有EcoRI和HindⅢ内切酶位点以便利克隆. PCR反应体积为50 μL，反应条件为94℃ 45 s，55℃ 45 s,72℃ 45 s,35个循环,最后72℃ 延伸5 min. 扩增产物在含EB的8 g*L-1琼脂糖凝胶中进行电泳.
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1.2.2 克隆 PCR产物用HindⅢ和EcoRI进行酶切，定向克隆入pcDNA3载 体中，同时命名反向为pcDNA3-VEGF(-).
1.2.3 DNA测序 用双脱氧终止方法进行测序反应,并上机测序(测序引物为T7启动子测序引物).
1.3 标记探针 随机引物法用地高辛标记pcDNA3-VEGF(-)，做为探针 .
1.4 卵巢癌的基因组DNA的提取、酶切、电泳及DNA印迹杂交[3] 用SDS+Triton-X100，氯 仿、异丙醇沉淀DNA，提取基因组DNA. 取DNA 10 μg经EcoRI限制性内切酶消化10 h，1 5 g*L-1琼脂糖凝胶电泳6 h，经变性，中和处理后，将凝胶DNA转印至NC膜上，80 ℃烤膜固定2 h，然后用宝灵曼公司地高辛检测试剂盒进行杂交、显色.
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2 结果
2.1 RT-PCR克隆及测序的结果 PCR产物的大小(575 bp)与我们设计的相吻合，克隆后(命名为pcDNA3-VEGF)酶切片段大小与PCR产物大小吻合(Fig 1). DNA序列测定结果(Fig 2)与GenBank人VEGF cDNA完全相同.
图 1 15 g*L-1琼脂糖凝胶电泳鉴定
Fig 1 Identification of pcDNA3-VEGF(-) by 15 g*L-1 agarose electrophoresis
1:RT-PCR;2: Digestion of pcDNA-3VEGFwith EcoRI/HindⅢ; 3: Digestion of pcDNA-3plasmid; 4: PCR Markers;5:λ-DNA/HindⅢ Markers
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图 2 VEGF基因的反向序列分析
Fig 2 Backward sequencing of VEGF gene
2.2 DNA印迹杂交结果DNA印迹杂交结果 经EcoRI消化后的DNA与VEGF探针杂交后，10例患者中出现片段为大于23 kb和4.3 kb的两条片段，而正常卵巢中出现的为大于30 kb，6.5 kb，2.5 kb三条片段(Fig 3).
图 3 DNA印迹杂交结果
Fig 3 Sourthern blot analysis
1，3～10：Ovarian cancer; 2:Normal control; M：λ-DNA/HindⅢ Markers
3 讨论
, 百拇医药
人VEGF基因位于染色体6 p21.3[4]，全长14 kb，由8个外显子，7个内含子组 成，编码产物为34～45 kD的同源二聚体糖蛋白[4]. 在多种肿瘤中都发现有VEGF的 高表达，我们在对卵巢癌的研究中也发现有该基因的高表达[5]. 许多科学家都在探讨引发肿瘤细胞中VEGF高表达的机制. White等[6]报道 表达产物为酪氨酸蛋白激酶活的癌基因以及突变的Ras能引发高表达VEGF 6～16倍的高表达，其VEGF稳定性提高3～5倍. Baba等[7]在对胃癌的研究中也发现有VEGF的高表达 ，并认为该表达不受突变的p53影响. 卵巢癌是妇产科常见的恶性肿瘤，有许多癌基因的激活状态和抑癌基因失活，但有关人VEGF在卵巢癌组织中VEGF的扩增和重排、缺失等未见报道. 我们的研究表明，在Southern blot分析中发现与正常 组织的杂交带完全不同的新的杂交片段，10例患者中出现片段为大于23 k和4.3 kb两条片段，而正常卵巢中出现的大于30，6.5和2.5 kb三条片段. 这说明VEGF基因在卵巢癌中有重排现象，可能是引发VEGF高表达的重要原因. 应该注意的是，19例中仅有10例有重排，说明还有其他的调节机制参与其中. 有关VEGF基因突变的检测目前正在进行之中.
, http://www.100md.com
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39700147)
作者简介：金明(1963-)，男(朝鲜族)，吉林省龙井市人，学士， 实验师. Tel.(029)3374516 Ext.14
参考文献：
[1] Tischer E，Mitchell R， Hartman T et al.The human gene for vasc ular endotheloal growth factor multiple protein forms are encoded through altern ative exon splicing[J].J Biological Chem，1991；266(18)：11947-11954.
[2] Rak J，Mitsuhashi Y，Bayko L et al.Mutant ras oncogenes upreg ulate VEGF/VPF expression；implication for induction and inhibition of tumor angiogenesis[ J]，Cancer Res，1995；55(20)：4575-4580.
, 百拇医药
[3] 金冬雁，黎孟枫 译.分子克隆实验指南[M]. 第2版. 北京：科学技术出 版社，1992；474-479.
[4] Vincenti V，Cassano C，Rocchi M et al.Assignment of the VEGF gene to human chromosome 6p21.3[J].Circulation，1996；93(8)：1493-1495.
[5] 严瑞兰,惠宏襄,辛晓燕et al，血管内皮生长因子在上皮性卵巢癌中 的表达[J].第四军医大学学报，1999；20(4)：291-293.
[6] White FC，Benehacene A，Scheele JS et al，VEGF mRNA is stabili zed by ras and tyrosine kinase oncogenes，as well as by UV radiation-evidence for divergent stabilization pathways[J].Growth Factors，1997；14(2-3) ：199-212.
[7] Baba M，Konno H，Maruo Y et al，Relationship of p53 and vascul ar endothelial growth factor expression of clinicopathological factors in human scirrhous gastric cancer[J].Eur Surg Res，1998；30(2)130-137.
收稿日期：1999-12-17; 修回日期：2000-06-13, http://www.100md.com