杀菌/通透性增加蛋白的细胞定位
作者：刘家云 于文彬 马越云 丁振若 苏明权 陈云春
单位：第四军医大学西京医院检验科， 陕西 西安 710033
关键词：杀菌；通透性增加蛋白；逆转录PCR；免疫荧光检测法
第四军医大学学报001019 摘 要：目的 确定人体内能产生杀菌/通透性增加蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein，BPI)的细胞群体，为研究BPI在细胞内的定位奠定基础. 方法 分离人外周血获得嗜中性多形核粒细胞(polymorphonuclear neutrophils，PMN)和单个核细胞，PMN，HL-60及单个核细胞分别进行RNA提取，逆转录PCR反应扩增BPI基因片段和免疫荧光法检测. 结果 逆转录PCR在PMN和HL-60细胞中扩增出BPI基因片段，活细胞免疫荧光染色观察到PMN和HL-60能够与抗BPI的单抗所结合而呈阳性. 结论 BPI是中性粒系细胞的特异性产物.
, http://www.100md.com
中图号：R392.11 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)10-1230-04
Cellular localization of the human bactericidal/permeability-increasing protein
LIU Jia-Yun, YU Wen-Bin, MA Yue-Yun, DING Zhen-Ruo, SU Ming-Quan, CHEN Yun-Chun
(Department of Clinical Laboratory, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
Abstract: AIM To identify the cell populations that produce bactericidal/permeability-increasing protein. METHODS Total RNA was extracted from polymorphonuclear neutrophils (PMN)， Mononuclear cells (isolated from human peripheral) blood and HL-60 cells (cultured in DMEM medium). Reverse transcription was carried out and human BPI cDNA gene was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Immunofluorescent assay was performed in PMN, HL-60 and mononuclear cells respectively. RESULTS The BPI fragment was amplified by RT-PCR and its immunofluorescent assay result was positive in both PMN and HL-60 cells. CONCLUSION BPI is a specific product of neutrophil lineage.
, 百拇医药
Keywords:bactericidal/permeability-increasing protein(BPI); RT-PCR; immunofluorescent assay
0 引言
机体在抵御微生物侵袭的过程中嗜中性多形核粒细胞(polymorphonuclear neutrophils，PMN)处于核心环节，PMN内含众多的抗微生物物质，这些物质包括蛋白质、多肽以及氧依赖的自由基，病原微生物入侵时，所有的抗菌物质协同作用，导致入侵微生物的溶解破坏及清除，20世纪80年代，人们逐步认识到阳离子多肽是吞噬细胞中非氧依赖的杀菌效应分子之一[1]. 几乎同一时期,Weiss等[2]从健康人的PMN中提取得到一种Mr55×103，等电点为pH 9.8的蛋白质，因其对数株革兰阴性菌具有杀伤作用，并且能立即增加敏感细菌细胞壁的通透性，使得正常情况下不能通过细胞壁的放线菌素D得以穿过细胞壁而进入菌体，因而称之为杀菌/通透性增加蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein, BPI). BPI是由456 个氨基酸组成的阳离子蛋白，对革兰阴性菌具有强力的杀菌作用和中和内毒素功能，与革兰阴性菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)具有较高的亲和力，同后者结合所形成的BPI-LPS复合物能抑制LPS的炎性级联信号向CD14的传导，从而阻止LPS所引发的宿主细胞免疫应答反应[3].
, http://www.100md.com
对血液中吞噬与非吞噬细胞的研究发现BPI主要存在于PMN中，除人外，还在兔、牛的PMN胞质颗粒中发现了BPI[4]. 为确定能产生BPI的细胞群体，以便更深入地研究其生物学功能奠定基础. 本实验分离人外周血获得PMN和单个核细胞，后两者和HL-60分别进行了RNA提取，逆转录PCR反应扩增BPI基因片段及免疫荧光法染色.
1 材料和方法
1.1 材料 人外周血来自健康体检者EDTA抗凝血；髓样白血病细胞系HL-60由本室保存，其培养基为DMEM完全培养基，含100 mL*L-1小牛血清，取对数增殖期细胞提取RNA. PolymorphprepTM PMN分离液购自Nycomed Pharmas 公司；Reverse Transcription System，Taq DNA polymerase购自Promega公司；RNA提取试剂Trizol Reagent，DMEM购自Gibco公司；抗BPI mAb为HBT公司产品；荧光抗体羊抗鼠IgG-FITC，PCR marker购自华美公司；小牛血清购自杭州四季清生物工程材料研究所.
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 PCR引物的设计与合成 运用计算机软件辅助分析，根据BPI 基因编码序列，设计两套引物采用套式PCR扩增目的基因，其中外引物P1，P2扩增BPI cDNA第7-840 bp，内引物P3，P4扩增BPI cDNA第25-749 bp，引物由上海生工生物工程公司合成，引物序列设计如Fig 1.
Primer 1: 5′ TTG AGG TTT TGG CAG CTC TGG 3′
Primer 2: 5′ GGT GTT AGG TGG A GGG AAA 3′
Primer 3: 5′ AT GGA TCC TGG AGG ATG AGA GAG AAC ATG G 3′
Primer 4: 5′ CAC CGA CCT TAG ATT GAT ACC AGA TCT CA 3′
, http://www.100md.com
图 1 BPI N端序列及引物的设计
Fig 1 Sequence of cDNA encoding N-terminal fragment of BPI and primers
labelled sequence: Primers; underlined sequence: Signal peptide.
1.2.2 细胞分离与提取 收集健康体检者EDTA抗凝血20 mL，取50 mL离心管加入等量PolymorphprepTM 分离液，小心地将全部抗凝血加至分离液层面上，室温下400～450 g离心40 min，离心后细胞分为3层，上层为单个核细胞(包括单核细胞和淋巴细胞)，中层为PMN，下层为红细胞，分别吸出单个核细胞和PMN，稀释于等体积的4.5 mL*L-1 NaCl溶液，细胞悬液再用生理盐水洗涤3次，每次400 g，10 min，细胞记数. 离心培养液500 g，10 min收集HL-60细胞.
, http://www.100md.com
1.2.3 细胞总RNA的提取 参照Trizol Reagent Kit中的说明书进行，具体步骤：于1.5 mL离心管中加入(5～10)×106细胞，取1 mL Trizol试剂加于管中反复吹打，待核蛋白完全溶解；室温下静置5 min，加0.2 mL三氯甲烷，用力振荡15 s，室温下静置2～3 min，4℃，11 000 g离心15 min；吸出上清，加0.5 mL异丙醇，室温下静置10 min，4℃，11 000 g离心10 min；弃上清，加1 mL 750 mL*L-1乙醇，4℃，7000 g离心10 min；弃上清，室温干燥5～10 min，加20 μL无RNase水溶解，并置55℃水浴10 min，取2 μL用于反转录.
1.2.4 cDNA合成 在20 μL反应体积中, 含有10 μg RNA, 10×Buffer 2 μL, 10 mmol*L-1 dNTP混合液2 μL, RNasin 20 U, 逆转录酶15 U, 引物P2 1 μL, 于42℃水浴反应1 h，99℃ 5 min灭活逆转录酶后置-20℃备用.
, 百拇医药
1.2.5 PCR扩增BPI cDNA片段 首先以反转录产物为模板进行第1轮PCR扩增, 所用引物为P1及P2, 反应体积为50 μL, 其中cDNA 5 μL，10×buffer 5 μL，dNTP 4 μL, 20 pmol的引物，Taq聚合酶1U，25 mmol*L-1 MgCl2 4 μL, 反应条件为: 94℃, 2 min; 94℃, 40 s, 55℃, 45 s, 72℃, 80 s，35循环; 72℃, 7 min; 共进行35个循环. 之后以第1轮PCR扩增产物为模板进行第2轮PCR扩增, 所用引物为P3及P4，反应体积同上, 反应条件为: 94℃, 2 min；94℃，40 s，60℃，40 s，72℃，80 s，5循环；94℃，40 s，65℃，40 s，72℃, 80 s，30循环；72℃, 7 min; 进行35个循环. PCR产物的分析：取PCR产物5 μL, 在20 g*L-1琼脂糖凝胶电泳(含0.5 μg*mL-1溴化乙锭)，以 DNA分子量为标准，观察照相.
, 百拇医药
1.2.6 BPI的间接免疫荧光染色 用DMEM完全培养基调整HL-60，PMN和单个核细胞为5×106～1×107 mL；取40 μL细胞悬液加入预先有BPI mAb 10 μL的5 mL离心管，再加50 μL 1∶20稀释的灭活正常兔血清，4℃孵育30 min，洗涤液洗涤2次，2 mL/次， 500 g，5 min；弃上清，加50 μL工作浓度的羊抗鼠IgG-FITC荧光二抗，充分振荡，4℃孵育30 min，洗涤液洗涤2次，2 mL*次-1，500 g，5 min；加固定液100 μL，制片后荧光显微镜下观察照相.
2 结果
2.1 RNA的完整性及纯度 从HL-60，PMN及单个核细胞中提取的总RNA经电泳，可见明显的28，18和5 s条带(Fig 2)，且28 s的亮度大约是18 s的2倍，说明所提取的总RNA基本没有降解，有较好的
, 百拇医药
图 2 总RNA琼脂糖凝胶电泳图
Fig 2 Agarose gel electrophoresis of total RNA of cells
完整性. 对RNA样品进行紫外分光光度分析得出A260/A280>1.8，表明RNA具有较高的纯度，符合反转录要求.
2.2 BPI基因的扩增 反转录产物经套式PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳可见一条约700 bp的扩增区带(Fig 3), 与预期的结果一致.
图 3 BPI基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳
Fig 3 Agarose gel electrophoresis of the PCR products of BPI gene
1: DNA PCR maker; 2: PCR products of PMN; 3: PCR products of HL-60； 4: PCR products of mononuclear cells.
, 百拇医药
2.3 BPI免疫荧光染色 活细胞免疫荧光染色观察发现，PMN 和HL-60免疫荧光染色发出较强荧光，单个核细胞内未见明显荧光，提示BPI存在于PMN 和HL-60细胞中(Fig 4).
图 4 细胞中BPI的免疫荧光染色
Fig 4 Immunofluorescent staining of BPI in cells from PMN and HL-60
PMN A: from human peripheral blood and HL-60; B: all stained brightly.
3 讨论
为确定含有BPI的血细胞，Weiss等[5]将人外周血固定制片，与兔抗-BPI结合，洗涤，再加荧光标记的猪抗兔IgG抗体，发现只有PMN细胞发出荧光，淋巴细胞、单核细胞、红细胞、血小板及嗜碱性粒细胞几乎没有荧光，而嗜酸性粒细胞发出很淡的荧光，难道说参与变态反应和寄生虫感染免疫应答反映的嗜酸性粒细胞也含有BPI？运用蛋白印迹技术，Calafat等[6]从PMN和嗜酸性粒细胞中检测出55×103的BPI，免疫电镜研究发现嗜酸性粒细胞中的成熟和不成熟特异性颗粒中均含有BPI. 放射免疫对BPI的定量测定发现外周血中PMN BPI含量为142 fg*cells-1，嗜酸性粒细胞为35.8 fg*cells-1. BPI在嗜酸性粒细胞中的检出表明这些细胞具有抗革兰阴性菌感染的作用，也可能暗示BPI具有抗寄生虫感染的作用.
, 百拇医药
用RT-PCR进行扩增是目前最常用的获取目的基因片段方法，分为一步法和二步法，我们采用二步法进行. 引物包括内外两套，外引物扩增后再用内引物进行扩增，保证反应具有较高的特异性. 实验中首先以oligo(dT)为引物，反转录合成之cDNA第一链为模板进行PCR扩增，所得产物少且有非特异产物存在，结果不甚理想. 后改用BPI引物P2合成cDNA，再采用套式PCR进行扩增，适当提高退火温度并延长延伸时间，结果获得了单一的BPI片段. 间接免疫荧光技术是免疫学研究中广泛使用的一项技术，用特异性单克隆抗体与活细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，在此基础上建立的活细胞免疫荧光技术，由于活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，在某些实验条件下, 活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的结果. HL-60是髓样白血病细胞系，为较幼稚细胞，具有向粒系或单核系分化的能力，RT-PCR扩增出了单一的BPI片段，免疫荧光检测显示荧光，表明HL-60含有BPI.
采用RT-PCR和活细胞免疫荧光检测技术，我们发现HL-60和PMN均扩增出了BPI基因片段，免疫荧光染色均呈阳性，表明BPI只存在于中性粒系细胞. BPI的产生严格限于中性粒系细胞内，这一特性既反映出这种抗菌蛋白严格的靶细胞特异性，又显示了中性粒细胞在宿主抗革兰阴性菌感染方面起着重要的作用.
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39800154)
作者简介：刘家云(1971-)，男(汉族)，云南省宜良人. 硕士生(导师于文彬). Tel.(029)3375572 Email.liujiayun@263.net
参考文献：
[1] Gudmundsson GH, Agerberth B. Neutrophil antibacterial peptides, multifunctional effector molecules in the mammalian immune system[J]. J Immunol Methods, 1999; 232 (1-2): 45-54.
[2] Weiss J, Elsbach P, Olsson I et al. Purification and characterization of a potent bactericidal/permeability-increasing protein from human polymorphonuclear leukocytes[J]. J Biol Chem， 1978; 253(8): 2664-2672.
, http://www.100md.com
[3] Tobias PS, Soldau K, Iovine NM et al. Lipopolysaccharide (LPS)-binding proteins BPI and LBP form different types of complexes with LPS[J]. J Biol Chem, 1997; 272(30): 18682-18685.
[4] Elsbach P. The bactericidal/permeability-increasing protein (BPI) in antibacterial host defense[J]. J Leukoc Biol, 1998; 64(1): 14-18.
[5] Weiss J, I Olsson. Cellular and subcellular localization of the bactericidal/permeability-increasing protein of neutrophils[J]. Blood, 1987; 69(2): 652-659.
[6] Calafat J, Janssen H, Tool A et al. The bactericidal/permeability-increasing protein (BPI) is present in specific granules of human eosinophils[J]. Blood, 1998; 91(12): 4770-4775.
收稿日期:2000-03-10; 修回日期:2000-06-05, 百拇医药
单位：第四军医大学西京医院检验科， 陕西 西安 710033
关键词：杀菌；通透性增加蛋白；逆转录PCR；免疫荧光检测法
第四军医大学学报001019 摘 要：目的 确定人体内能产生杀菌/通透性增加蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein，BPI)的细胞群体，为研究BPI在细胞内的定位奠定基础. 方法 分离人外周血获得嗜中性多形核粒细胞(polymorphonuclear neutrophils，PMN)和单个核细胞，PMN，HL-60及单个核细胞分别进行RNA提取，逆转录PCR反应扩增BPI基因片段和免疫荧光法检测. 结果 逆转录PCR在PMN和HL-60细胞中扩增出BPI基因片段，活细胞免疫荧光染色观察到PMN和HL-60能够与抗BPI的单抗所结合而呈阳性. 结论 BPI是中性粒系细胞的特异性产物.
, http://www.100md.com
中图号：R392.11 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)10-1230-04
Cellular localization of the human bactericidal/permeability-increasing protein
LIU Jia-Yun, YU Wen-Bin, MA Yue-Yun, DING Zhen-Ruo, SU Ming-Quan, CHEN Yun-Chun
(Department of Clinical Laboratory, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
Abstract: AIM To identify the cell populations that produce bactericidal/permeability-increasing protein. METHODS Total RNA was extracted from polymorphonuclear neutrophils (PMN)， Mononuclear cells (isolated from human peripheral) blood and HL-60 cells (cultured in DMEM medium). Reverse transcription was carried out and human BPI cDNA gene was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Immunofluorescent assay was performed in PMN, HL-60 and mononuclear cells respectively. RESULTS The BPI fragment was amplified by RT-PCR and its immunofluorescent assay result was positive in both PMN and HL-60 cells. CONCLUSION BPI is a specific product of neutrophil lineage.
, 百拇医药
Keywords:bactericidal/permeability-increasing protein(BPI); RT-PCR; immunofluorescent assay
0 引言
机体在抵御微生物侵袭的过程中嗜中性多形核粒细胞(polymorphonuclear neutrophils，PMN)处于核心环节，PMN内含众多的抗微生物物质，这些物质包括蛋白质、多肽以及氧依赖的自由基，病原微生物入侵时，所有的抗菌物质协同作用，导致入侵微生物的溶解破坏及清除，20世纪80年代，人们逐步认识到阳离子多肽是吞噬细胞中非氧依赖的杀菌效应分子之一[1]. 几乎同一时期,Weiss等[2]从健康人的PMN中提取得到一种Mr55×103，等电点为pH 9.8的蛋白质，因其对数株革兰阴性菌具有杀伤作用，并且能立即增加敏感细菌细胞壁的通透性，使得正常情况下不能通过细胞壁的放线菌素D得以穿过细胞壁而进入菌体，因而称之为杀菌/通透性增加蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein, BPI). BPI是由456 个氨基酸组成的阳离子蛋白，对革兰阴性菌具有强力的杀菌作用和中和内毒素功能，与革兰阴性菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)具有较高的亲和力，同后者结合所形成的BPI-LPS复合物能抑制LPS的炎性级联信号向CD14的传导，从而阻止LPS所引发的宿主细胞免疫应答反应[3].
, http://www.100md.com
对血液中吞噬与非吞噬细胞的研究发现BPI主要存在于PMN中，除人外，还在兔、牛的PMN胞质颗粒中发现了BPI[4]. 为确定能产生BPI的细胞群体，以便更深入地研究其生物学功能奠定基础. 本实验分离人外周血获得PMN和单个核细胞，后两者和HL-60分别进行了RNA提取，逆转录PCR反应扩增BPI基因片段及免疫荧光法染色.
1 材料和方法
1.1 材料 人外周血来自健康体检者EDTA抗凝血；髓样白血病细胞系HL-60由本室保存，其培养基为DMEM完全培养基，含100 mL*L-1小牛血清，取对数增殖期细胞提取RNA. PolymorphprepTM PMN分离液购自Nycomed Pharmas 公司；Reverse Transcription System，Taq DNA polymerase购自Promega公司；RNA提取试剂Trizol Reagent，DMEM购自Gibco公司；抗BPI mAb为HBT公司产品；荧光抗体羊抗鼠IgG-FITC，PCR marker购自华美公司；小牛血清购自杭州四季清生物工程材料研究所.
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 PCR引物的设计与合成 运用计算机软件辅助分析，根据BPI 基因编码序列，设计两套引物采用套式PCR扩增目的基因，其中外引物P1，P2扩增BPI cDNA第7-840 bp，内引物P3，P4扩增BPI cDNA第25-749 bp，引物由上海生工生物工程公司合成，引物序列设计如Fig 1.
Primer 1: 5′ TTG AGG TTT TGG CAG CTC TGG 3′
Primer 2: 5′ GGT GTT AGG TGG A GGG AAA 3′
Primer 3: 5′ AT GGA TCC TGG AGG ATG AGA GAG AAC ATG G 3′
Primer 4: 5′ CAC CGA CCT TAG ATT GAT ACC AGA TCT CA 3′
, http://www.100md.com
图 1 BPI N端序列及引物的设计
Fig 1 Sequence of cDNA encoding N-terminal fragment of BPI and primers
labelled sequence: Primers; underlined sequence: Signal peptide.
1.2.2 细胞分离与提取 收集健康体检者EDTA抗凝血20 mL，取50 mL离心管加入等量PolymorphprepTM 分离液，小心地将全部抗凝血加至分离液层面上，室温下400～450 g离心40 min，离心后细胞分为3层，上层为单个核细胞(包括单核细胞和淋巴细胞)，中层为PMN，下层为红细胞，分别吸出单个核细胞和PMN，稀释于等体积的4.5 mL*L-1 NaCl溶液，细胞悬液再用生理盐水洗涤3次，每次400 g，10 min，细胞记数. 离心培养液500 g，10 min收集HL-60细胞.
, http://www.100md.com
1.2.3 细胞总RNA的提取 参照Trizol Reagent Kit中的说明书进行，具体步骤：于1.5 mL离心管中加入(5～10)×106细胞，取1 mL Trizol试剂加于管中反复吹打，待核蛋白完全溶解；室温下静置5 min，加0.2 mL三氯甲烷，用力振荡15 s，室温下静置2～3 min，4℃，11 000 g离心15 min；吸出上清，加0.5 mL异丙醇，室温下静置10 min，4℃，11 000 g离心10 min；弃上清，加1 mL 750 mL*L-1乙醇，4℃，7000 g离心10 min；弃上清，室温干燥5～10 min，加20 μL无RNase水溶解，并置55℃水浴10 min，取2 μL用于反转录.
1.2.4 cDNA合成 在20 μL反应体积中, 含有10 μg RNA, 10×Buffer 2 μL, 10 mmol*L-1 dNTP混合液2 μL, RNasin 20 U, 逆转录酶15 U, 引物P2 1 μL, 于42℃水浴反应1 h，99℃ 5 min灭活逆转录酶后置-20℃备用.
, 百拇医药
1.2.5 PCR扩增BPI cDNA片段 首先以反转录产物为模板进行第1轮PCR扩增, 所用引物为P1及P2, 反应体积为50 μL, 其中cDNA 5 μL，10×buffer 5 μL，dNTP 4 μL, 20 pmol的引物，Taq聚合酶1U，25 mmol*L-1 MgCl2 4 μL, 反应条件为: 94℃, 2 min; 94℃, 40 s, 55℃, 45 s, 72℃, 80 s，35循环; 72℃, 7 min; 共进行35个循环. 之后以第1轮PCR扩增产物为模板进行第2轮PCR扩增, 所用引物为P3及P4，反应体积同上, 反应条件为: 94℃, 2 min；94℃，40 s，60℃，40 s，72℃，80 s，5循环；94℃，40 s，65℃，40 s，72℃, 80 s，30循环；72℃, 7 min; 进行35个循环. PCR产物的分析：取PCR产物5 μL, 在20 g*L-1琼脂糖凝胶电泳(含0.5 μg*mL-1溴化乙锭)，以 DNA分子量为标准，观察照相.
, 百拇医药
1.2.6 BPI的间接免疫荧光染色 用DMEM完全培养基调整HL-60，PMN和单个核细胞为5×106～1×107 mL；取40 μL细胞悬液加入预先有BPI mAb 10 μL的5 mL离心管，再加50 μL 1∶20稀释的灭活正常兔血清，4℃孵育30 min，洗涤液洗涤2次，2 mL/次， 500 g，5 min；弃上清，加50 μL工作浓度的羊抗鼠IgG-FITC荧光二抗，充分振荡，4℃孵育30 min，洗涤液洗涤2次，2 mL*次-1，500 g，5 min；加固定液100 μL，制片后荧光显微镜下观察照相.
2 结果
2.1 RNA的完整性及纯度 从HL-60，PMN及单个核细胞中提取的总RNA经电泳，可见明显的28，18和5 s条带(Fig 2)，且28 s的亮度大约是18 s的2倍，说明所提取的总RNA基本没有降解，有较好的
, 百拇医药
图 2 总RNA琼脂糖凝胶电泳图
Fig 2 Agarose gel electrophoresis of total RNA of cells
完整性. 对RNA样品进行紫外分光光度分析得出A260/A280>1.8，表明RNA具有较高的纯度，符合反转录要求.
2.2 BPI基因的扩增 反转录产物经套式PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳可见一条约700 bp的扩增区带(Fig 3), 与预期的结果一致.
图 3 BPI基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳
Fig 3 Agarose gel electrophoresis of the PCR products of BPI gene
1: DNA PCR maker; 2: PCR products of PMN; 3: PCR products of HL-60； 4: PCR products of mononuclear cells.
, 百拇医药
2.3 BPI免疫荧光染色 活细胞免疫荧光染色观察发现，PMN 和HL-60免疫荧光染色发出较强荧光，单个核细胞内未见明显荧光，提示BPI存在于PMN 和HL-60细胞中(Fig 4).
图 4 细胞中BPI的免疫荧光染色
Fig 4 Immunofluorescent staining of BPI in cells from PMN and HL-60
PMN A: from human peripheral blood and HL-60; B: all stained brightly.
3 讨论
为确定含有BPI的血细胞，Weiss等[5]将人外周血固定制片，与兔抗-BPI结合，洗涤，再加荧光标记的猪抗兔IgG抗体，发现只有PMN细胞发出荧光，淋巴细胞、单核细胞、红细胞、血小板及嗜碱性粒细胞几乎没有荧光，而嗜酸性粒细胞发出很淡的荧光，难道说参与变态反应和寄生虫感染免疫应答反映的嗜酸性粒细胞也含有BPI？运用蛋白印迹技术，Calafat等[6]从PMN和嗜酸性粒细胞中检测出55×103的BPI，免疫电镜研究发现嗜酸性粒细胞中的成熟和不成熟特异性颗粒中均含有BPI. 放射免疫对BPI的定量测定发现外周血中PMN BPI含量为142 fg*cells-1，嗜酸性粒细胞为35.8 fg*cells-1. BPI在嗜酸性粒细胞中的检出表明这些细胞具有抗革兰阴性菌感染的作用，也可能暗示BPI具有抗寄生虫感染的作用.
, 百拇医药
用RT-PCR进行扩增是目前最常用的获取目的基因片段方法，分为一步法和二步法，我们采用二步法进行. 引物包括内外两套，外引物扩增后再用内引物进行扩增，保证反应具有较高的特异性. 实验中首先以oligo(dT)为引物，反转录合成之cDNA第一链为模板进行PCR扩增，所得产物少且有非特异产物存在，结果不甚理想. 后改用BPI引物P2合成cDNA，再采用套式PCR进行扩增，适当提高退火温度并延长延伸时间，结果获得了单一的BPI片段. 间接免疫荧光技术是免疫学研究中广泛使用的一项技术，用特异性单克隆抗体与活细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，在此基础上建立的活细胞免疫荧光技术，由于活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，在某些实验条件下, 活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的结果. HL-60是髓样白血病细胞系，为较幼稚细胞，具有向粒系或单核系分化的能力，RT-PCR扩增出了单一的BPI片段，免疫荧光检测显示荧光，表明HL-60含有BPI.
采用RT-PCR和活细胞免疫荧光检测技术，我们发现HL-60和PMN均扩增出了BPI基因片段，免疫荧光染色均呈阳性，表明BPI只存在于中性粒系细胞. BPI的产生严格限于中性粒系细胞内，这一特性既反映出这种抗菌蛋白严格的靶细胞特异性，又显示了中性粒细胞在宿主抗革兰阴性菌感染方面起着重要的作用.
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39800154)
作者简介：刘家云(1971-)，男(汉族)，云南省宜良人. 硕士生(导师于文彬). Tel.(029)3375572 Email.liujiayun@263.net
参考文献：
[1] Gudmundsson GH, Agerberth B. Neutrophil antibacterial peptides, multifunctional effector molecules in the mammalian immune system[J]. J Immunol Methods, 1999; 232 (1-2): 45-54.
[2] Weiss J, Elsbach P, Olsson I et al. Purification and characterization of a potent bactericidal/permeability-increasing protein from human polymorphonuclear leukocytes[J]. J Biol Chem， 1978; 253(8): 2664-2672.
, http://www.100md.com
[3] Tobias PS, Soldau K, Iovine NM et al. Lipopolysaccharide (LPS)-binding proteins BPI and LBP form different types of complexes with LPS[J]. J Biol Chem, 1997; 272(30): 18682-18685.
[4] Elsbach P. The bactericidal/permeability-increasing protein (BPI) in antibacterial host defense[J]. J Leukoc Biol, 1998; 64(1): 14-18.
[5] Weiss J, I Olsson. Cellular and subcellular localization of the bactericidal/permeability-increasing protein of neutrophils[J]. Blood, 1987; 69(2): 652-659.
[6] Calafat J, Janssen H, Tool A et al. The bactericidal/permeability-increasing protein (BPI) is present in specific granules of human eosinophils[J]. Blood, 1998; 91(12): 4770-4775.
收稿日期:2000-03-10; 修回日期:2000-06-05, 百拇医药