杀菌/通透性增强蛋白N端cDNA的克隆和表达
作者：马越云 马文煜 于文彬 刘家云 苏明权
单位：马越云 于文彬 刘家云 苏明权(第四军医大学西京医院检验科)；马文煜(第四军医大学基础部微生物学教研室，陕西 西安 710033)
关键词：杀菌；通透性增强蛋白；克隆；基因表达
第四军医大学学报001017 摘 要：目的 克隆杀菌/通透性增强蛋白(BPI)N端cDNA，构建原核和真核表达载体，分别在大肠杆菌和CHO细胞中表达BPI蛋白. 方法 提取正常人外周血多形核粒细胞(PMN)总RNA，经套式RT-PCR法扩增出BPI N端cDNA片段，将其克隆入pGEM-T easy载体中并进行酶切鉴定和序列测定. 然后亚克隆入pGEX-4T-1质粒，转化大肠杆菌，进行诱导表达，表达产物用Western blot法鉴定. 同时将该基因片断克隆入pcDNA3质粒，通过脂质体转染CHO细胞，免疫荧光法鉴定BPI的表达. 结果 获得BPI N端长度为726 bp的基因片断. 序列分析证实该片断中有4个点突变，但均不在活性中心. 在大肠杆菌中的表达产物为相对分子质量51×103的GST-BPI融合蛋白，Western blot反应中在51×103处有显色区带. G418筛选出的阳性CHO细胞在免疫荧光反应中产生荧光反应. 结论 我们成功的在大肠杆菌和CHO细胞中表达了BPI25 蛋白，为进一步研究BPI生物学功能奠定了基础.
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中图号：R392.11 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)10-1223-04
Cloning and expression for cDNA of human bactericidal/permeability-increasing protein N-terminal fragment
MA Yue-Yun,YU Wen-Bin, LIU Jia-Yun，SU Ming-Quan
(1Department of Clinical Laboratory, Xijing Hospital)
MA Wen-Yu
(Department of Microbiology,Faculty of Preclinical Medicine,Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
, 百拇医药
Abstract: AIM To clone cDNA of N-terminal fragment of human bactericidal/permeability-increasing protein(BPI), to construct the procaryotic and eucaryotic expression vectors and to express the cDNA in E.coli and CHO cells respectively. METHODS Total RNA was extracted from human polymorphonuclear neutrophils(PMN) and then the human BPI cDNA gene was amplified by nested RT-PCR. The PCR product was cloned into pGEM-T easy plasmid and the sequence was confirmed by restriction enzyme digestion and dideoxy-mediated-chain termination. Subsequently the specific BPI N-terminal fragment was subcloned into pGEX-4T-1 plasmid and transformed into E.coli. In addition, the fragment was inserted into pcDNA3 plasmid and transformed into CHO cells with liposome transfection reagent. RESULTS A 726 bp fragment was acquired. The E.coli transformed with recombinant plasmid pGEX-BPI was induced by IPTG. A 51 ku expected protein of GST-BPI fusion protein was synthesized. The CHO cells transformed with pcDNA3-BPI were screened by G418, and the positive clone was obtained by using immunofluorescent assay. CONCLUSION N-terminal of BPI was successfully expressed in E.coli and CHO.
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Keywords:bactericidal/permeability-increasing protein(BPI); clone; gene expression
0 引言
杀菌/通透性增强蛋白(BPI)，是存在于人中性粒细胞内的一种阳离子抗菌肽，是中性粒细胞内多种抗菌成分中，唯一能够直接对革兰阴性菌发挥毒性作用，对游离的脂多糖(LPS)具有中和作用的物质[1]. 自1978年，Weiss首次分离获得天然BPI分子以后，Grang等先后从人和牛中性粒细胞中克隆出编码BPI的cDNA，并成功地得到表达[2]. 体内外研究表明，无论是完整BPI分子，还是蛋白酶水解和重组的BPI N端片段，均对革兰阴性菌及其LPS具有很高的亲和力和抑制中和作用. 为深入研究BPI分子的生物学活性，大量制备具有临床应用价值的BPI，我们从人中性粒细胞中克隆了BPI N端cDNA，表达于CHO细胞，并探讨了原核细胞表达该抗菌物质的可能性.
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1 材料和方法
1.1 材料 中性粒细胞分离液(polynarphprep,ngcomed pharma as, Norway)；RNA提取试剂Trizol和DMEM高糖培养基为Gibco公司产品；逆转录试剂盒、Taq DNA合成酶、限制性内切酶、T4连接酶、Wizard RCR DNA和Wizard Plus DNA纯化试剂盒为Promega公司产品;抗BPI mAb购自百雅克泰生物工程公司. E.coli JM109 为本室保存菌株，pGEM-T easy载体为Promega公司产品；pGEX-4T-1为Pharmacia公司产品；pcDNA3为Invitrogen公司产品.
1.2 方法 分离人外周血多形核血粒细胞，用Trizol提取总RNA，以oligo (dt)15为引物逆转录合成cDNA. 以套式PCR方法扩增BPI第25到749个碱基的cDNA片段. 第1轮PCR扩增反应液组成：10×PCR缓冲液5 μL，25 mmol*L-1 MgCl2 4 μL. 10 mmol*L-1 dNTP 2 μL,50 pmol*L-1外引物各1 μL，3U Taq酶，5 μL cDNA，加水至50 μL. 扩增条件为94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 1 min，32个循环，然后72℃延伸10 min. 第2轮PCR以第1轮扩增产物5 μL为模板，换以内引物扩增，其他反应物组成和反应条件同第1轮. (外引物：back-TTG AGG TTT TGG CAG CTC TGG, for-AAA GGG AGG TGG ATT GTG G; 内引物：back-AT GGA TCC TGG AGG ATG AGA GAG AAG ATG CT,for-AT TCT AGA CCA TAG TTA GAT TCC AGC CAC). PCR产物经PCR纯化试剂盒纯化回收后，连接到pGEM-Teasy载体，转化JM109大肠杆菌，挑取阳性克隆，用Wizard plus DNA纯化试剂盒提取重组质粒，用Bam HI 和XbaI酶切鉴定. 确认重组正确后，用T7和SP6测序引物分别从5′和3′端进行自动测序，测序反应由ABI377自动测序仪完成. 命名为pGEM-BPI.
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1.2.1 表达载体的构建 以限制性内切酶Bam HI和Sal I双酶切pGEM-BPI质粒，经10 g*L-1琼脂糖凝胶电泳，用Wizard PCR DNA 纯化试剂盒回收目的片段，插入经同样酶切的pGEX-4T-1质粒谷光甘肽转移酶(GST)基因3′端的多克隆位点，转化DH5α大肠杆菌，挑取氨苄青霉素抗性菌落，提取质粒，用BamH I和sal I双酶切鉴定. 用限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切PGEM-BPI质粒，将目的片断插入到同样酶切的pcDNA3载体中，转化JM109，挑取氨苄青霉素抗性菌落，提取质粒，用BamH I和Xba I双酶切鉴定.
1.2.2 大肠杆菌中的表达 挑取含有目的片段的菌落接种于含100 mg*L-1氨苄霉素的LB培养基中，37℃ 200 r*min-1培养至A600≈1.0, 加入IPTG 至终浓度为1 mmol*L-1，继续培养3 h，取1.5 mL菌液，5000 r*min-1离心10 min，收集菌体，悬于100 μL 2×加样缓冲液，煮沸5 min，150 g*L-1 SDS-PAGE. 表达产物作SDS-PAGE，电转移至硝酸纤维素膜，50 g*L-1脱脂奶粉封闭1～2 h 后，与抗BPI抗体4℃孵育过夜，用羊抗鼠IgG-HRP作为第二抗体，最后用ABTS显色. 取在6孔培养板，每孔加入CHO细胞2×105个，DMEM高糖完全培养基培养24 h. 取纯化后的pcDNA3-BPI重组质粒2 μg，与脂质体混合后，转染CHO细胞，72 h后，加入G418筛选. 挑取G418抗性的CHO细胞克隆，扩大培养，取20 μL细胞悬液(1×107)，与抗BPI mAb(1∶100稀释)混合，4℃孵育30 min，洗涤；加入羊抗鼠荧光标记IgG(1∶100稀释), 4℃孵育30 min，洗涤；加入100 μL固定液，制片后在荧光显微镜下观察.
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2 结果
2.1 RT-PCR扩增和克隆 PCR产物在20 g*L-1琼脂糖凝胶电泳中出现一条约726 bp的DNA区带，与设计扩增片段大小一致(Fig 1). 扩增的BPI cDNA 与pGEM-T easy质粒连接，经氨苄青霉素抗性及α-互补筛选后，用Bam HI和Xba I双酶切鉴定，阳性重组子可切出726 bp的DNA片段，说明BPI cDNA已成功克隆于载体中，命名为pGEM-BPI(Fig 2). 以重组质料pGEM-BPI为模板进行测序，得到了克隆片段的DNA序列，经计算及分析，与已知的BPI序列基本一致，其中有6个点突变，分别在第53，456，497，556碱基位，但均不在活性中心，且未形成半胱氨酸，因此不应影响其活性.
图 1 BPI N端cDNA PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析
Fig 1 Agarose gel electrophoresis of PCR products of N-terminal cDNA fragment of BPI
, 百拇医药
Lane 1: Negative control; Lane 2,3: PCR products of BPI cDNA; Lane 4: PCR maker.
图 2 重组质粒pGEM-BPI的酶切鉴定
Fig 2 Identification of recombinant pGEM-BPI plasmid with BamHⅠand XbaⅠ
Lane 1,2,3,4,5,6: Positive clonies; Lane 7: pGEM-T easy vector;Lane 8:λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ.
图 3 BPI N端cDNA克隆与表达载体的构建
Fig 3 Construction of cloning and expression vectors for N-terminal cDNA of BPI
, 百拇医药
2.2 表达载体的构建 用Bam HI和Sal I, Bam HI和Xba I分别双酶切pGEM-BPI载体插入到pGEX-4T-1和pcDNA3载体筛选出阳性克隆，命名为pGEX-BPI和pcDNA3-BPI(Fig 3). 将重组表达质粒转入DH5α大肠杆菌IPTG诱导表达获得Mr约51×103的GST-BPI的融合蛋白(Fig 4). 表达的重组蛋白GST-BPI与抗BPI mAbWestern Blot试验有较强的印迹反应，在51×103的位置有特异的显色区带，而菌体蛋白的阴性对照未见明显的显色反应. 将pcDNA3-BPI转染的CHO细胞随机挑选G418抗性克隆数个，用抗BPI mAb和羊抗鼠荧光标记IgG作用后，结果显示多株克隆均有不同程度的表达，选取的荧光强度高的细胞株传代培养，命名为CHO/BPI(Fig 5).
图 4 重组质粒pGEX-BPI表达产物的SDS-PAGE分析
, 百拇医药
Fig 4 SDS-PAGE analysis of expressed GST-BPI in E.coli
Lane 1:pGEX-4T-1; Lane 2,3:pGEX-BPI; Lane 4:Marker.
图 5 转染CHO细胞中BPI的表达
Fig 5 BPI fragment expression in transfected CHO cells
3 讨论
BPI是多形核粒细胞嗜天青颗粒中的一种阳离子蛋白，分子量55×103，由456个氨基酸残基组成，可被蛋白酶水解成两个片段，即25×103的N 端片段和30×103的C端片段[3]. 研究证实，N端片段具有完整的BPI分子的增强细菌细胞壁通透性和杀菌的功能. 其中，第二结构域(第65～99位氨基酸)的第85～99位氨基酸对鲎溶解试验的抑制活性最强，是BPI 杀菌和中和LPS的活性中心[4].
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将克隆的BPI N端726 bp cDNA片段的核苷酸序列及由此推导得到的氨基酸序列与基因库BPI序列进行比较分析，结果发现，第53，456，497，556位核苷酸有突变，其中造成3个氨基酸发生变化，分别是第17位Ala→Val，第165位Ala→Val,第185位Lys→Glu,但显而易见的是，该序列的活性中心区域，即第二结构域(第65～99位氨基酸)未发生变化，而第一结构域中(第17～45位氨基酸〕中的第17位，和第三结构域(第142～169位氨基酸)中的第165位氨基酸的变化并未改变其电势结构，同样都是中性氨基酸，且未形成半胱氨酸，应不会对其整体蛋白质结构和活性造成影响. 而第185位氨基酸的突变使由带负电荷的赖氨酸变成了带正电荷的谷氨酸，作为富有阳离子蛋白的BPI分子，该突变是否会影响其与带负电荷的LPS的结合有待进一步活性鉴定.
BPI分子由于其抗菌活性，特别是抗革兰阴性菌活性，其表达研究一直以真核表达为主[5,6]. 真核表达具有活性高的优点，但产量较低，且表达周期长，费时费力. 因此，在进行BPI真核表达研究的同时，我们将BPI N端cDNA克隆插入到带有GST融合蛋白的原核表达载体pGEX-4T-1中，期望表达成以包涵体形式存在的GST-BPI融合蛋白，该方法所得蛋白产量高，对宿主没有毒性，易于下游纯化，结果证实，原核表达产物在SDS-PAGE电泳中可明显看到51×103的蛋白区带，而CHO细胞的产物虽可用免疫荧光法检测到，但由于蛋白产量低，在SDS-PAGE中尚未有明显的蛋白区带产生.
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BPI分子的抗菌机制还不完全明了，现在一般认为是由于BPI分子与革兰阴性菌细菌细胞壁上的脂多糖类脂A成分结合，并插入到带有负电荷的磷脂层，引起LPS聚集和电势的改变，从而引起LPS失活和细胞壁通透性增强，导致细菌裂解. 近期研究发现，BPI除具有杀灭革兰阴性菌和中和内毒素的功能外，还有抗革兰阳性菌、真菌、中和肝素和抗血管生成等多种生物学活性[7,8]，其作用机制和临床应用价值有待进一步研究和开发.
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39800154)
作者简介：马越云(1968-)，男(汉族), 河北省唐山市人. 微生物专业博士生(导师马文煜)，主要研究领域感染与免疫，发表论文10余篇，获军队科技进步三等奖2项. Tel.(029)3375572 Email.mayueyun@163.net
参考文献：
, 百拇医药
[1] Weiss J, Elsbach P, Olsson I et al. Purification and characterization of a potent bactericidal/permeability-increasing protein from human polymorphonuclear leukocytes[J]. J Biol Chem, 1978; 253(8): 2664-2672.
[2] Gray PW, Flaggs G, Leong SR et al. Cloning of the cDNA of a human neutrophil bactericidal protein, Structural and functional correlations[J]. J Biol Chem, 1989; 264(16):9505-9509
[3] Weiss J, I Olsson. Cellular and subcellular localization of the bactericidal/permeability increasing protein of neutrophils[J]. Blood, 1987; 69(2): 652-659
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[4] Little RG， Kelner DN,LimE et al. Functional domains of recombinant bactericidal/permeability increasing protein[J]. J Biol Chem,1994;269(3):1865-1872
[5] Horwitz AH, Leigh SD, Abrahamson S et al. Expression and characterization of cysteine-modified forms of an amino terminal fragment of bactericidal/permeability increasing protein[J]. Protein Exp Purif 1996;8:28-40.
[6] Dahlberg PS,Acton RD,Uknis ME et al. Macrophages expressing a fusion protein derived from bactericidal/permeability-increasing protein and IgG are resistant to endotoxin[J]. Arch Surg,1996;131:1173-1177.
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[7] Abrahamson S, Wong P, Lim E et al. Mechanism of action of XMP antifungal peptides:Factors which influence activity and subcellular characterization[M]. Toronto:ICAAC, 1997:9-28,10-11.
[8] Horwitz AH, Motchnik P, Nadell R. Fungicidal peptides from bactericidal/permeability-increasing protein (BPI) act synergystically with fluconazole on a variety of Candida strains[M]. Toronto, ICAAC, 1997:9-28, 10-11.
收稿日期:2000-03-10; 修回日期:2000-06-05, 百拇医药
单位：马越云 于文彬 刘家云 苏明权(第四军医大学西京医院检验科)；马文煜(第四军医大学基础部微生物学教研室，陕西 西安 710033)
关键词：杀菌；通透性增强蛋白；克隆；基因表达
第四军医大学学报001017 摘 要：目的 克隆杀菌/通透性增强蛋白(BPI)N端cDNA，构建原核和真核表达载体，分别在大肠杆菌和CHO细胞中表达BPI蛋白. 方法 提取正常人外周血多形核粒细胞(PMN)总RNA，经套式RT-PCR法扩增出BPI N端cDNA片段，将其克隆入pGEM-T easy载体中并进行酶切鉴定和序列测定. 然后亚克隆入pGEX-4T-1质粒，转化大肠杆菌，进行诱导表达，表达产物用Western blot法鉴定. 同时将该基因片断克隆入pcDNA3质粒，通过脂质体转染CHO细胞，免疫荧光法鉴定BPI的表达. 结果 获得BPI N端长度为726 bp的基因片断. 序列分析证实该片断中有4个点突变，但均不在活性中心. 在大肠杆菌中的表达产物为相对分子质量51×103的GST-BPI融合蛋白，Western blot反应中在51×103处有显色区带. G418筛选出的阳性CHO细胞在免疫荧光反应中产生荧光反应. 结论 我们成功的在大肠杆菌和CHO细胞中表达了BPI25 蛋白，为进一步研究BPI生物学功能奠定了基础.
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中图号：R392.11 文献标识码：A
文章编号：1000-2790(2000)10-1223-04
Cloning and expression for cDNA of human bactericidal/permeability-increasing protein N-terminal fragment
MA Yue-Yun,YU Wen-Bin, LIU Jia-Yun，SU Ming-Quan
(1Department of Clinical Laboratory, Xijing Hospital)
MA Wen-Yu
(Department of Microbiology,Faculty of Preclinical Medicine,Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
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Abstract: AIM To clone cDNA of N-terminal fragment of human bactericidal/permeability-increasing protein(BPI), to construct the procaryotic and eucaryotic expression vectors and to express the cDNA in E.coli and CHO cells respectively. METHODS Total RNA was extracted from human polymorphonuclear neutrophils(PMN) and then the human BPI cDNA gene was amplified by nested RT-PCR. The PCR product was cloned into pGEM-T easy plasmid and the sequence was confirmed by restriction enzyme digestion and dideoxy-mediated-chain termination. Subsequently the specific BPI N-terminal fragment was subcloned into pGEX-4T-1 plasmid and transformed into E.coli. In addition, the fragment was inserted into pcDNA3 plasmid and transformed into CHO cells with liposome transfection reagent. RESULTS A 726 bp fragment was acquired. The E.coli transformed with recombinant plasmid pGEX-BPI was induced by IPTG. A 51 ku expected protein of GST-BPI fusion protein was synthesized. The CHO cells transformed with pcDNA3-BPI were screened by G418, and the positive clone was obtained by using immunofluorescent assay. CONCLUSION N-terminal of BPI was successfully expressed in E.coli and CHO.
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Keywords:bactericidal/permeability-increasing protein(BPI); clone; gene expression
0 引言
杀菌/通透性增强蛋白(BPI)，是存在于人中性粒细胞内的一种阳离子抗菌肽，是中性粒细胞内多种抗菌成分中，唯一能够直接对革兰阴性菌发挥毒性作用，对游离的脂多糖(LPS)具有中和作用的物质[1]. 自1978年，Weiss首次分离获得天然BPI分子以后，Grang等先后从人和牛中性粒细胞中克隆出编码BPI的cDNA，并成功地得到表达[2]. 体内外研究表明，无论是完整BPI分子，还是蛋白酶水解和重组的BPI N端片段，均对革兰阴性菌及其LPS具有很高的亲和力和抑制中和作用. 为深入研究BPI分子的生物学活性，大量制备具有临床应用价值的BPI，我们从人中性粒细胞中克隆了BPI N端cDNA，表达于CHO细胞，并探讨了原核细胞表达该抗菌物质的可能性.
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1 材料和方法
1.1 材料 中性粒细胞分离液(polynarphprep,ngcomed pharma as, Norway)；RNA提取试剂Trizol和DMEM高糖培养基为Gibco公司产品；逆转录试剂盒、Taq DNA合成酶、限制性内切酶、T4连接酶、Wizard RCR DNA和Wizard Plus DNA纯化试剂盒为Promega公司产品;抗BPI mAb购自百雅克泰生物工程公司. E.coli JM109 为本室保存菌株，pGEM-T easy载体为Promega公司产品；pGEX-4T-1为Pharmacia公司产品；pcDNA3为Invitrogen公司产品.
1.2 方法 分离人外周血多形核血粒细胞，用Trizol提取总RNA，以oligo (dt)15为引物逆转录合成cDNA. 以套式PCR方法扩增BPI第25到749个碱基的cDNA片段. 第1轮PCR扩增反应液组成：10×PCR缓冲液5 μL，25 mmol*L-1 MgCl2 4 μL. 10 mmol*L-1 dNTP 2 μL,50 pmol*L-1外引物各1 μL，3U Taq酶，5 μL cDNA，加水至50 μL. 扩增条件为94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 1 min，32个循环，然后72℃延伸10 min. 第2轮PCR以第1轮扩增产物5 μL为模板，换以内引物扩增，其他反应物组成和反应条件同第1轮. (外引物：back-TTG AGG TTT TGG CAG CTC TGG, for-AAA GGG AGG TGG ATT GTG G; 内引物：back-AT GGA TCC TGG AGG ATG AGA GAG AAG ATG CT,for-AT TCT AGA CCA TAG TTA GAT TCC AGC CAC). PCR产物经PCR纯化试剂盒纯化回收后，连接到pGEM-Teasy载体，转化JM109大肠杆菌，挑取阳性克隆，用Wizard plus DNA纯化试剂盒提取重组质粒，用Bam HI 和XbaI酶切鉴定. 确认重组正确后，用T7和SP6测序引物分别从5′和3′端进行自动测序，测序反应由ABI377自动测序仪完成. 命名为pGEM-BPI.
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1.2.1 表达载体的构建 以限制性内切酶Bam HI和Sal I双酶切pGEM-BPI质粒，经10 g*L-1琼脂糖凝胶电泳，用Wizard PCR DNA 纯化试剂盒回收目的片段，插入经同样酶切的pGEX-4T-1质粒谷光甘肽转移酶(GST)基因3′端的多克隆位点，转化DH5α大肠杆菌，挑取氨苄青霉素抗性菌落，提取质粒，用BamH I和sal I双酶切鉴定. 用限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切PGEM-BPI质粒，将目的片断插入到同样酶切的pcDNA3载体中，转化JM109，挑取氨苄青霉素抗性菌落，提取质粒，用BamH I和Xba I双酶切鉴定.
1.2.2 大肠杆菌中的表达 挑取含有目的片段的菌落接种于含100 mg*L-1氨苄霉素的LB培养基中，37℃ 200 r*min-1培养至A600≈1.0, 加入IPTG 至终浓度为1 mmol*L-1，继续培养3 h，取1.5 mL菌液，5000 r*min-1离心10 min，收集菌体，悬于100 μL 2×加样缓冲液，煮沸5 min，150 g*L-1 SDS-PAGE. 表达产物作SDS-PAGE，电转移至硝酸纤维素膜，50 g*L-1脱脂奶粉封闭1～2 h 后，与抗BPI抗体4℃孵育过夜，用羊抗鼠IgG-HRP作为第二抗体，最后用ABTS显色. 取在6孔培养板，每孔加入CHO细胞2×105个，DMEM高糖完全培养基培养24 h. 取纯化后的pcDNA3-BPI重组质粒2 μg，与脂质体混合后，转染CHO细胞，72 h后，加入G418筛选. 挑取G418抗性的CHO细胞克隆，扩大培养，取20 μL细胞悬液(1×107)，与抗BPI mAb(1∶100稀释)混合，4℃孵育30 min，洗涤；加入羊抗鼠荧光标记IgG(1∶100稀释), 4℃孵育30 min，洗涤；加入100 μL固定液，制片后在荧光显微镜下观察.
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2 结果
2.1 RT-PCR扩增和克隆 PCR产物在20 g*L-1琼脂糖凝胶电泳中出现一条约726 bp的DNA区带，与设计扩增片段大小一致(Fig 1). 扩增的BPI cDNA 与pGEM-T easy质粒连接，经氨苄青霉素抗性及α-互补筛选后，用Bam HI和Xba I双酶切鉴定，阳性重组子可切出726 bp的DNA片段，说明BPI cDNA已成功克隆于载体中，命名为pGEM-BPI(Fig 2). 以重组质料pGEM-BPI为模板进行测序，得到了克隆片段的DNA序列，经计算及分析，与已知的BPI序列基本一致，其中有6个点突变，分别在第53，456，497，556碱基位，但均不在活性中心，且未形成半胱氨酸，因此不应影响其活性.
图 1 BPI N端cDNA PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析
Fig 1 Agarose gel electrophoresis of PCR products of N-terminal cDNA fragment of BPI
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Lane 1: Negative control; Lane 2,3: PCR products of BPI cDNA; Lane 4: PCR maker.
图 2 重组质粒pGEM-BPI的酶切鉴定
Fig 2 Identification of recombinant pGEM-BPI plasmid with BamHⅠand XbaⅠ
Lane 1,2,3,4,5,6: Positive clonies; Lane 7: pGEM-T easy vector;Lane 8:λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ.
图 3 BPI N端cDNA克隆与表达载体的构建
Fig 3 Construction of cloning and expression vectors for N-terminal cDNA of BPI
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2.2 表达载体的构建 用Bam HI和Sal I, Bam HI和Xba I分别双酶切pGEM-BPI载体插入到pGEX-4T-1和pcDNA3载体筛选出阳性克隆，命名为pGEX-BPI和pcDNA3-BPI(Fig 3). 将重组表达质粒转入DH5α大肠杆菌IPTG诱导表达获得Mr约51×103的GST-BPI的融合蛋白(Fig 4). 表达的重组蛋白GST-BPI与抗BPI mAbWestern Blot试验有较强的印迹反应，在51×103的位置有特异的显色区带，而菌体蛋白的阴性对照未见明显的显色反应. 将pcDNA3-BPI转染的CHO细胞随机挑选G418抗性克隆数个，用抗BPI mAb和羊抗鼠荧光标记IgG作用后，结果显示多株克隆均有不同程度的表达，选取的荧光强度高的细胞株传代培养，命名为CHO/BPI(Fig 5).
图 4 重组质粒pGEX-BPI表达产物的SDS-PAGE分析
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Fig 4 SDS-PAGE analysis of expressed GST-BPI in E.coli
Lane 1:pGEX-4T-1; Lane 2,3:pGEX-BPI; Lane 4:Marker.
图 5 转染CHO细胞中BPI的表达
Fig 5 BPI fragment expression in transfected CHO cells
3 讨论
BPI是多形核粒细胞嗜天青颗粒中的一种阳离子蛋白，分子量55×103，由456个氨基酸残基组成，可被蛋白酶水解成两个片段，即25×103的N 端片段和30×103的C端片段[3]. 研究证实，N端片段具有完整的BPI分子的增强细菌细胞壁通透性和杀菌的功能. 其中，第二结构域(第65～99位氨基酸)的第85～99位氨基酸对鲎溶解试验的抑制活性最强，是BPI 杀菌和中和LPS的活性中心[4].
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将克隆的BPI N端726 bp cDNA片段的核苷酸序列及由此推导得到的氨基酸序列与基因库BPI序列进行比较分析，结果发现，第53，456，497，556位核苷酸有突变，其中造成3个氨基酸发生变化，分别是第17位Ala→Val，第165位Ala→Val,第185位Lys→Glu,但显而易见的是，该序列的活性中心区域，即第二结构域(第65～99位氨基酸)未发生变化，而第一结构域中(第17～45位氨基酸〕中的第17位，和第三结构域(第142～169位氨基酸)中的第165位氨基酸的变化并未改变其电势结构，同样都是中性氨基酸，且未形成半胱氨酸，应不会对其整体蛋白质结构和活性造成影响. 而第185位氨基酸的突变使由带负电荷的赖氨酸变成了带正电荷的谷氨酸，作为富有阳离子蛋白的BPI分子，该突变是否会影响其与带负电荷的LPS的结合有待进一步活性鉴定.
BPI分子由于其抗菌活性，特别是抗革兰阴性菌活性，其表达研究一直以真核表达为主[5,6]. 真核表达具有活性高的优点，但产量较低，且表达周期长，费时费力. 因此，在进行BPI真核表达研究的同时，我们将BPI N端cDNA克隆插入到带有GST融合蛋白的原核表达载体pGEX-4T-1中，期望表达成以包涵体形式存在的GST-BPI融合蛋白，该方法所得蛋白产量高，对宿主没有毒性，易于下游纯化，结果证实，原核表达产物在SDS-PAGE电泳中可明显看到51×103的蛋白区带，而CHO细胞的产物虽可用免疫荧光法检测到，但由于蛋白产量低，在SDS-PAGE中尚未有明显的蛋白区带产生.
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BPI分子的抗菌机制还不完全明了，现在一般认为是由于BPI分子与革兰阴性菌细菌细胞壁上的脂多糖类脂A成分结合，并插入到带有负电荷的磷脂层，引起LPS聚集和电势的改变，从而引起LPS失活和细胞壁通透性增强，导致细菌裂解. 近期研究发现，BPI除具有杀灭革兰阴性菌和中和内毒素的功能外，还有抗革兰阳性菌、真菌、中和肝素和抗血管生成等多种生物学活性[7,8]，其作用机制和临床应用价值有待进一步研究和开发.
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39800154)
作者简介：马越云(1968-)，男(汉族), 河北省唐山市人. 微生物专业博士生(导师马文煜)，主要研究领域感染与免疫，发表论文10余篇，获军队科技进步三等奖2项. Tel.(029)3375572 Email.mayueyun@163.net
参考文献：
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收稿日期:2000-03-10; 修回日期:2000-06-05, 百拇医药