重组肌腱蛋白-R不同功能片段的表达、纯化和生物学功能
作者：肖华胜 杨浩 金卫林 黄文晋 段小莉 陈镔复 鞠躬
单位：第四军医大学全军神经科学研究所, 陕西 西安 710033
关键词：肌腱蛋白-R；细胞外基质；表达；纯化；功能
第四军医大学学报001004 摘 要：目的 将肌腱蛋白-R不同功能片段在原核中表达、纯化，并研究其初步的生物学功能. 方法 将编码肌腱蛋白-R不同功能片段的表达质粒pGEX-EGFL, pGEX-EGFS, pGEX-FN1-2, pGEX-FN6-8, pGEX-FG及空载pGEX-KG转化入E.Coli JM109中. 用IPTG诱导表达，以谷胱甘肽琼脂糖为填充料进行亲合层析,纯化所表达的融合蛋白. 以纯化的融合蛋白作为培养液成分, GST为对照，观察纯化的肌腱蛋白-R各功能片段对体外培养脊髓细胞活性及突起生长的影响. 结果 肌腱蛋白R的5个片段在大肠杆菌中都有表达,通过谷胱甘肽琼脂糖亲合层析，都得到了初步纯化. 通过对培养细胞进行MTT染色，NSE染色后图像分析，结果表明，EGFL，FN1-2促进神经元的存活，EGFL，EGFS和FN6-8对突起的生长有明显的促进作用. 结论 肌腱蛋白-R的不同功能片段可以通过大肠杆菌表达， 经纯化获得蛋白，肌腱蛋白-R不同的片段对体外培养的脊髓细胞有不同的作用.
, 百拇医药
中图号：Q513.2
文章编号：1000-2790(2000)10-1182-03
Expression and purification of recombinant tenascin-R domains and their functions
XIAO Hua-Sheng, YANG Hao, JIN Wei-Ling, HUANG Wen-Jin, DUAN Xiao-Li, CHENG Bin-Fu, JU Gong
(Institute of Neurosciences of Chinese PLA, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
Abstract:AIM To express and to purify recombinant tenascin-R domains and to study their functions. METHODS The pGEX-KG derived expression vectors which contained the DNA sequence encoding 5 domains of tenascin-R were transformed into E.coli JM109. The E.coli was then induced by isopropyl-β-thiogalactoside(IPTG). The expressed protein was purified with glutathione agarose beads. In order to study the effect of the purified proteins on survival and neurite growth of the spinal cord cells in vitro, the purified proteins were added in soluble form to the culture medium, using GST as a control. RESULTS Five tenascin-R domains were expressed in E.coli and purified by glutathione agarose beads. The results showed that EGFL, FN1-2 promoted the survival of the cell and EGFL, EGFS, FN6-8 promoted the growth of neurite. CONCLUSION Recombinant tenascin-R domains may express in E.coli and get the recombinant protein. The tenascin-R domains have different effects on the spinal cord cell in vitro.
, 百拇医药
Keywords:Tenascin-R; extracellular matrix; Expression; purification; function
0 引言
肌腱蛋白R(Tenascin-R, TN-R)是一种重要的细胞外基质[1],分布于中枢神经系统[2]. 具有多种生物学功能，如粘附、抗粘附、转移、生长、分化、诱导神经元形态的极性化，并和髓鞘形成有关. 对于神经系统的发育，再生具有重要意义[3～6]. 肌腱蛋白-R结构复杂，整个分子由4,5个类似表皮生长因子重复片段， 9个类似于Ⅲ型纤连蛋白重复片段和1个类似(血)纤维蛋白原片段组成[7]. 为了研究肌腱蛋白-R结构和功能的对应关系，我们在构建肌腱蛋白-R不同功能片段表达质粒的基础上，将肌腱蛋白-R不同功能段在E.coli中表达、纯化，并研究了生物学功能.
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1 材料和方法
1.1 材料 质粒pEGX-EGFL, pGEX-EGFS, pGEX-FN1-2, pGEX-FN6-8和pGEX-FG的构建见文献[4]. 菌种E.coli JM109购自Promega公司. 主要试剂:氯化钙、还原型谷胱甘肽、谷胱甘肽琼脂糖、胱胺、蛋白胨、酵母浸出物， 完全培养基，MTT，NSE购自Sigma公司, IPTG和蛋白质标准购自Promega公司. 其他试剂均为国产分析纯.
1.2 方法 E.coli JM109感受态的制备参照文献[8]. 质粒转化参照文献[9]进行. 融合蛋白的表达:挑取单菌落于LB液体培养基中, 37℃振荡培养过夜, 再按10%的接种量转接1次, 37℃振荡培养2 h后, 加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导(终浓度0.5 mmol*L-1), 再继续振荡培养5 h. 融合蛋白的纯化: 诱导表达后的菌液离心(5000 r*min-1, 4℃, 10 min), 收集菌体, 用10 mL PBS悬浮, 超声波破细胞15 min, 离心(10 000 g, 4℃, 15 min), 如融合蛋白在上清中可直接进行纯化, 如融合蛋白在包涵体中, 则需进行包涵体的变性、复性. 融合蛋白的纯化采用亲和层析法进行, 取0.2 g谷胱甘肽琼脂糖, 经浸泡, 装柱, PBS平衡后, 上述处理样品过柱, PBS充分洗涤后, 用50 mmol*L-1还原型谷胱甘肽, 250 mmol*L-1 Tris.Cl(pH 8.0)的洗脱缓冲液洗脱, 收集洗脱峰组份. 包涵体的变性和复性: 沉淀用变性缓冲液(尿素8 mol*L-1, Tris*Cl 0.1 mol*L-1, EDTA 2 mmol*L-1, DTE 0.3 mol*L-1)溶解, 室温放置0.5 h, 用复性缓冲液(L-精氨酸 0.2 mol*L-1, 胱胺0.01 mol*L-1, Tris*Cl 0.1 mol*L-1, EDTA 2 mmol*L-1, pH 8.0)透析至少2次, 然后用PBS透析2次, 样品在4℃ 25 000 g离心15 min, 上清液可上柱纯化. 聚丙烯酰胺凝胶电泳见文献[8]. 脊髓细胞的培养参照:Ransom等[10]的方法加以改良，在无菌条件下取12～14 d昆明种小鼠胚胎脊髓和脊神经节，制成单细胞悬液，用完全培养基调整浓度为2×108*L-1和1×108*L-1，接种于涂有鼠尾胶的24孔和96孔培养板内. 培养24 h后，加阿糖胞苷(终浓度10 μmol*L-1)，48 h后更换培养液，加入重组肌腱蛋白-R不同功能片段及对照GST，浓度为100,50,25,12.5 mg*L-1, 每3 d换1次液，每组重复3次. MTT比色微量分析参照文献[11]. NSE免疫细胞化学染色参照文献[12]. 图像处理:将NSE染色的标本随机选择10个视野的阳性细胞在Quentmet 570图像分析仪测定突起的长度.
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统计学处理: 按Student t test进行.
2 结果
2.1 肌腱蛋白-R不同功能片段的表达 将编码肌腱蛋白-R 5个不同功能片段的表达质粒(pGEX-EGFL, pGEX-EGFS, pGEX-FN1-2, pGEX-FN6-8, pGEX-FG)转化入E.coli JM109中, 用IPTG诱导, 100 g*L-1 SDS-聚丙烯酰胺电泳结果表明, 5个表达质粒在E.coli JM109中都有表达, 分子质量大小同预期的一致(Fig 1). 用激光光密度计扫描测定各片段的表达量分别为: 56.1%, 36.4%, 43.2%, 42.8%, 26.1%和63.8%.
图 1 肌腱蛋白-R不同功能片段的表达图谱
Fig 1 Expression of tenascin-R domains in E.coli
, 百拇医药
1：M；2：FG；3：FN1-2;4:FN6-8;5:EGFS;6:EGFL;7:GST.
2.2 肌腱蛋白-R不同功能片段的纯化
2.2.1 EGFL, EGFS的纯化 在大肠杆菌E.coil JM109中表达的EGFL, EGFS超声波破细胞后在可溶性上清中, 直接进行亲合层析纯化, SDS-PAGE结果表明, EGFL呈现单一的谱带, EGFS除了一条主带外还有少量杂带(Fig 2).
图 2 肌腱蛋白-R不同功能片段的纯化图谱
Fig 2 Purification of tenascin-R domains
2.2.2 FN1-2, FN6-8和FG的纯化 FN1-2, FN6-8和FG经超声波破细胞后存在于沉淀中的包涵体中, 包涵体用8 mol*L-1尿素变性缓冲液溶解, 用精氨酸复性系统或氧化型—还原型谷胱甘肽系统进行复性, 将离心后的上清液进行亲合层析, 从Fig 2可知, FN1-2, FN6-8, FG 除有一条主要的蛋白谱带外, 还有少量的杂带, 但杂带的分子质量都比主带的分子质量小.
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2.3 肌腱蛋白-R不同功能片段对脊髓细胞生长的影响
2.3.1 肌腱蛋白-R不同功能片段对脊髓细胞活性的影响 MTT比色微量分析表明,EGFL在100,50 mg*L-1的浓度下对细胞的活性有明显的促进作用. FN1-2在50 mg*L-1的浓度下，促进细胞的存活. EGFS,FN6-8,FG同对照组没有明显差异(Tab 1).
表 1 重组肌腱蛋白-R不同功能片段对脊髓细胞活性的影响
Tab 1 Effect of recombinant tenascin-R domains on survival of spinal cord cells
(n=3,
±s,A570 nm)
, http://www.100md.com
ρ/(mg*L-1)
Fragment
100
50
25
12.5
EGFL
1.100±0.141b
1.220±0.080b
1.170±0.083
1.122±0.205
, http://www.100md.com
EGFS
1.015±0.151
1.055±0.221
1.058±0.132
0.817±0.040
FN1-2
0.138±0.018
1.232±0.011a
1.090±0.425
0.418±0.068
FN6-8
, http://www.100md.com
0.005±0.000
0.005±0.010
0.004±0.001
0
FG
1.117±0.113
1.000±0.049
1.312±0.095
0.165±0.012
Control
0.105±0.070
0.591±0.014
, 百拇医药
0.580±0.158
0.477±0.045
aP<0.05,bP<0.01 vs control.
2.3.2 肌腱蛋白-R不同功能片段对脊髓细胞突起生长的影响 EGFL对突起的生长有明显的促进作用，EGFS,FN6-8可促进突起的生长(Tab 2)，FN1-2和FG对突起的生长无明显的作用.
表 2 重组肌腱蛋白-R不同功能片段对脊髓细胞突起的影响
Tab 2 Effect of recombinant tenascin-R domains on neurite outgrowth of spinal cord cells
, http://www.100md.com (n=10,±s) EGFL
EGFS
FN1-2
FN6-8
FG
Control
138±65b
98±87a
100±81
117±71a
, 百拇医药 72±51
71±33
aP<0.05,bP<0.01 vs control.
3 讨论
肌腱蛋白-R不同功能片段的表达质粒, 包含了肌腱蛋白-R连续而不重叠的基因序列, 连接在谷胱甘肽转移酶(GST)基因后面, 在大肠杆菌中表达量高且便于纯化, 可利用谷胱甘肽琼脂糖作为填充料, 靠融合蛋白的GST部分结合到谷胱甘肽上, 达到分离的目的, 特异性较强, 分离效果较好, 从Fig 2可以看出, EGFL, EGFS的纯度较高, FN1-2, FN6-8和FG除了主带外, 还有一些分子质量比融合蛋白小的谱带, 根据文献[4]报道, 这可能是融合蛋白降解的结果.
对于包涵体的变性和复性是一个非常棘手的问题, 其原因有二, 一是包涵体形成的机制不清楚, 二是不同蛋白形成的包涵体有不同的性质, 其变性和复性的条件不同, 没有统一的原则和方法可参考. 肌腱蛋白-R的3个片段的融合蛋白以包涵体的形式存在, 对于FN1-2, FN6-8根据文献[13]介绍的方法, 可以进行包涵体的变性和复性, 而对于FG的变性和复性较困难. 在实验中, 参考了文献介绍的多种方法, 效果都不理想, 后我们作了一些改进, 用8 mol*L-1尿素变性缓冲液溶解, 延长变性时间, 让包涵体彻底变性溶解, 再用复性缓冲液进行瞬时放大, 稀释,且勿搅动,4℃静置7～10 d后, 用亲和层析法进行纯化, 得到了较为满意的结果.
, 百拇医药
有文献报道，用融合蛋白作为培养液成分，要去除GST部分，我们在实验中考虑到用thrombin消化后，残留的thrombin对细胞的活性有抑制作用，没有切去GST，而是以GST作为对照.
肌腱蛋白-R不同的片段对脊髓细胞的存活和突起的生长有不同的作用. 这同肌腱蛋白-R结构的复杂性密切相关，这也提示，肌腱蛋白-R具有多个受体，它和不同的受体相互作用，产生不同的生物效应. 目前有关受体的研究工作还在进行之中.
作者简介:肖华胜(1968-),男(汉族)，重庆市垫江县人. 博士，讲师. Tel.(029)3374565
参考文献:
[1] Kruse J, Keilhauer G, Faissner A et al. The J1 glycoprotein a novel nervous system cell adhesion molecule of the L2/HNK-1family[J]. Nature,1985;316(6024):146-148.
, 百拇医药
[2] Wintergerst ES, Fuss B, Bartsch U et al. Localization of Janusin mRNA in the central nervous system of the developing and adult mouse[J]. Eur J Neurosci,1993;5(4):299-310.
[3] Pesheva P，Probstmeier R, Skubitz AP et al. Tenascin-R(J1 160/180)inhibits fibronectin-mediated cell adhesion functional relatedness to tenascin-C[J]. J Cell Sci,1994;107:2323-2333.
[4] Xiao ZC, Taylor J, Montag M et al. Distinct effects of recombinant tenascin-R domains in neuronal cell functions identification of domain interacting with the neuronal recognition molecular F3/F11[J]. Eur J Neurosci,1996;8(4): 766-782.
, http://www.100md.com
[5] Pesheva P,Gennarini G,Goridis C et al. The F3/11 cell adhesion molecule mediates the repulsion of neurons by the extracellular matrix glycoprotein J1-160/180[J]. Neuron,1993;10(1):69-82.
[6] 肖华胜, 陈镔复. 肌腱蛋白R(Tenascin-R)研究进展[J]. 生物化学与生物物理进展,1998;25(1): 45-48.
[7] Schachner M, Taylor J, Bantsch U et al. The perplexing multifunctionality of Janusin, a tenascin-related molecule[J]. Perspect Dev Neurobiol,1994;2(1):33-41.
, 百拇医药
[8] 金冬雁, 黎孟枫编译. 分子克隆实验指南[M]. 第2版. 北京: 科学出版社, 1992:55-56,880-885.
[9] 肖华胜, 程希平, 张 萍et al 快速高效质粒转化方法的研制[J]. 第四军医大学学报, 1998;19(4): 474-475.
[10] Ransom BR,Neale E,Henkant B. Mouse spinal cord in cell culture: I.Morphology and intrinsic neuronal electrophysiological properties[J]. J Neurophysiol,1997; 40(5):1132-1150.
[11] Mosmann T. Rapid colormetric assay for cellular growth and suryval application to proliferation and cytotoxic in mouse serum[J]. J Immunol Methods, 1983;12(4):28.
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[13] Cleland JL, Builder SE, Swartz JR et al. Polyethylene glycol enhanced protein refolding[J]. Biol Technol, 1992;10(9):1013-1019.
收稿日期：1999-12-09； 修回日期：2000-02-20, 百拇医药
单位：第四军医大学全军神经科学研究所, 陕西 西安 710033
关键词：肌腱蛋白-R；细胞外基质；表达；纯化；功能
第四军医大学学报001004 摘 要：目的 将肌腱蛋白-R不同功能片段在原核中表达、纯化，并研究其初步的生物学功能. 方法 将编码肌腱蛋白-R不同功能片段的表达质粒pGEX-EGFL, pGEX-EGFS, pGEX-FN1-2, pGEX-FN6-8, pGEX-FG及空载pGEX-KG转化入E.Coli JM109中. 用IPTG诱导表达，以谷胱甘肽琼脂糖为填充料进行亲合层析,纯化所表达的融合蛋白. 以纯化的融合蛋白作为培养液成分, GST为对照，观察纯化的肌腱蛋白-R各功能片段对体外培养脊髓细胞活性及突起生长的影响. 结果 肌腱蛋白R的5个片段在大肠杆菌中都有表达,通过谷胱甘肽琼脂糖亲合层析，都得到了初步纯化. 通过对培养细胞进行MTT染色，NSE染色后图像分析，结果表明，EGFL，FN1-2促进神经元的存活，EGFL，EGFS和FN6-8对突起的生长有明显的促进作用. 结论 肌腱蛋白-R的不同功能片段可以通过大肠杆菌表达， 经纯化获得蛋白，肌腱蛋白-R不同的片段对体外培养的脊髓细胞有不同的作用.
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中图号：Q513.2
文章编号：1000-2790(2000)10-1182-03
Expression and purification of recombinant tenascin-R domains and their functions
XIAO Hua-Sheng, YANG Hao, JIN Wei-Ling, HUANG Wen-Jin, DUAN Xiao-Li, CHENG Bin-Fu, JU Gong
(Institute of Neurosciences of Chinese PLA, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, China)
Abstract:AIM To express and to purify recombinant tenascin-R domains and to study their functions. METHODS The pGEX-KG derived expression vectors which contained the DNA sequence encoding 5 domains of tenascin-R were transformed into E.coli JM109. The E.coli was then induced by isopropyl-β-thiogalactoside(IPTG). The expressed protein was purified with glutathione agarose beads. In order to study the effect of the purified proteins on survival and neurite growth of the spinal cord cells in vitro, the purified proteins were added in soluble form to the culture medium, using GST as a control. RESULTS Five tenascin-R domains were expressed in E.coli and purified by glutathione agarose beads. The results showed that EGFL, FN1-2 promoted the survival of the cell and EGFL, EGFS, FN6-8 promoted the growth of neurite. CONCLUSION Recombinant tenascin-R domains may express in E.coli and get the recombinant protein. The tenascin-R domains have different effects on the spinal cord cell in vitro.
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Keywords:Tenascin-R; extracellular matrix; Expression; purification; function
0 引言
肌腱蛋白R(Tenascin-R, TN-R)是一种重要的细胞外基质[1],分布于中枢神经系统[2]. 具有多种生物学功能，如粘附、抗粘附、转移、生长、分化、诱导神经元形态的极性化，并和髓鞘形成有关. 对于神经系统的发育，再生具有重要意义[3～6]. 肌腱蛋白-R结构复杂，整个分子由4,5个类似表皮生长因子重复片段， 9个类似于Ⅲ型纤连蛋白重复片段和1个类似(血)纤维蛋白原片段组成[7]. 为了研究肌腱蛋白-R结构和功能的对应关系，我们在构建肌腱蛋白-R不同功能片段表达质粒的基础上，将肌腱蛋白-R不同功能段在E.coli中表达、纯化，并研究了生物学功能.
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1 材料和方法
1.1 材料 质粒pEGX-EGFL, pGEX-EGFS, pGEX-FN1-2, pGEX-FN6-8和pGEX-FG的构建见文献[4]. 菌种E.coli JM109购自Promega公司. 主要试剂:氯化钙、还原型谷胱甘肽、谷胱甘肽琼脂糖、胱胺、蛋白胨、酵母浸出物， 完全培养基，MTT，NSE购自Sigma公司, IPTG和蛋白质标准购自Promega公司. 其他试剂均为国产分析纯.
1.2 方法 E.coli JM109感受态的制备参照文献[8]. 质粒转化参照文献[9]进行. 融合蛋白的表达:挑取单菌落于LB液体培养基中, 37℃振荡培养过夜, 再按10%的接种量转接1次, 37℃振荡培养2 h后, 加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导(终浓度0.5 mmol*L-1), 再继续振荡培养5 h. 融合蛋白的纯化: 诱导表达后的菌液离心(5000 r*min-1, 4℃, 10 min), 收集菌体, 用10 mL PBS悬浮, 超声波破细胞15 min, 离心(10 000 g, 4℃, 15 min), 如融合蛋白在上清中可直接进行纯化, 如融合蛋白在包涵体中, 则需进行包涵体的变性、复性. 融合蛋白的纯化采用亲和层析法进行, 取0.2 g谷胱甘肽琼脂糖, 经浸泡, 装柱, PBS平衡后, 上述处理样品过柱, PBS充分洗涤后, 用50 mmol*L-1还原型谷胱甘肽, 250 mmol*L-1 Tris.Cl(pH 8.0)的洗脱缓冲液洗脱, 收集洗脱峰组份. 包涵体的变性和复性: 沉淀用变性缓冲液(尿素8 mol*L-1, Tris*Cl 0.1 mol*L-1, EDTA 2 mmol*L-1, DTE 0.3 mol*L-1)溶解, 室温放置0.5 h, 用复性缓冲液(L-精氨酸 0.2 mol*L-1, 胱胺0.01 mol*L-1, Tris*Cl 0.1 mol*L-1, EDTA 2 mmol*L-1, pH 8.0)透析至少2次, 然后用PBS透析2次, 样品在4℃ 25 000 g离心15 min, 上清液可上柱纯化. 聚丙烯酰胺凝胶电泳见文献[8]. 脊髓细胞的培养参照:Ransom等[10]的方法加以改良，在无菌条件下取12～14 d昆明种小鼠胚胎脊髓和脊神经节，制成单细胞悬液，用完全培养基调整浓度为2×108*L-1和1×108*L-1，接种于涂有鼠尾胶的24孔和96孔培养板内. 培养24 h后，加阿糖胞苷(终浓度10 μmol*L-1)，48 h后更换培养液，加入重组肌腱蛋白-R不同功能片段及对照GST，浓度为100,50,25,12.5 mg*L-1, 每3 d换1次液，每组重复3次. MTT比色微量分析参照文献[11]. NSE免疫细胞化学染色参照文献[12]. 图像处理:将NSE染色的标本随机选择10个视野的阳性细胞在Quentmet 570图像分析仪测定突起的长度.
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统计学处理: 按Student t test进行.
2 结果
2.1 肌腱蛋白-R不同功能片段的表达 将编码肌腱蛋白-R 5个不同功能片段的表达质粒(pGEX-EGFL, pGEX-EGFS, pGEX-FN1-2, pGEX-FN6-8, pGEX-FG)转化入E.coli JM109中, 用IPTG诱导, 100 g*L-1 SDS-聚丙烯酰胺电泳结果表明, 5个表达质粒在E.coli JM109中都有表达, 分子质量大小同预期的一致(Fig 1). 用激光光密度计扫描测定各片段的表达量分别为: 56.1%, 36.4%, 43.2%, 42.8%, 26.1%和63.8%.
图 1 肌腱蛋白-R不同功能片段的表达图谱
Fig 1 Expression of tenascin-R domains in E.coli
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1：M；2：FG；3：FN1-2;4:FN6-8;5:EGFS;6:EGFL;7:GST.
2.2 肌腱蛋白-R不同功能片段的纯化
2.2.1 EGFL, EGFS的纯化 在大肠杆菌E.coil JM109中表达的EGFL, EGFS超声波破细胞后在可溶性上清中, 直接进行亲合层析纯化, SDS-PAGE结果表明, EGFL呈现单一的谱带, EGFS除了一条主带外还有少量杂带(Fig 2).
图 2 肌腱蛋白-R不同功能片段的纯化图谱
Fig 2 Purification of tenascin-R domains
2.2.2 FN1-2, FN6-8和FG的纯化 FN1-2, FN6-8和FG经超声波破细胞后存在于沉淀中的包涵体中, 包涵体用8 mol*L-1尿素变性缓冲液溶解, 用精氨酸复性系统或氧化型—还原型谷胱甘肽系统进行复性, 将离心后的上清液进行亲合层析, 从Fig 2可知, FN1-2, FN6-8, FG 除有一条主要的蛋白谱带外, 还有少量的杂带, 但杂带的分子质量都比主带的分子质量小.
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2.3 肌腱蛋白-R不同功能片段对脊髓细胞生长的影响
2.3.1 肌腱蛋白-R不同功能片段对脊髓细胞活性的影响 MTT比色微量分析表明,EGFL在100,50 mg*L-1的浓度下对细胞的活性有明显的促进作用. FN1-2在50 mg*L-1的浓度下，促进细胞的存活. EGFS,FN6-8,FG同对照组没有明显差异(Tab 1).
表 1 重组肌腱蛋白-R不同功能片段对脊髓细胞活性的影响
Tab 1 Effect of recombinant tenascin-R domains on survival of spinal cord cells
(n=3,
±s,A570 nm), http://www.100md.com
ρ/(mg*L-1)
Fragment
100
50
25
12.5
EGFL
1.100±0.141b
1.220±0.080b
1.170±0.083
1.122±0.205
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EGFS
1.015±0.151
1.055±0.221
1.058±0.132
0.817±0.040
FN1-2
0.138±0.018
1.232±0.011a
1.090±0.425
0.418±0.068
FN6-8
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0.005±0.000
0.005±0.010
0.004±0.001
0
FG
1.117±0.113
1.000±0.049
1.312±0.095
0.165±0.012
Control
0.105±0.070
0.591±0.014
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0.580±0.158
0.477±0.045
aP<0.05,bP<0.01 vs control.
2.3.2 肌腱蛋白-R不同功能片段对脊髓细胞突起生长的影响 EGFL对突起的生长有明显的促进作用，EGFS,FN6-8可促进突起的生长(Tab 2)，FN1-2和FG对突起的生长无明显的作用.
表 2 重组肌腱蛋白-R不同功能片段对脊髓细胞突起的影响
Tab 2 Effect of recombinant tenascin-R domains on neurite outgrowth of spinal cord cells
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±s) EGFLEGFS
FN1-2
FN6-8
FG
Control
138±65b
98±87a
100±81
117±71a
, 百拇医药 72±51
71±33
aP<0.05,bP<0.01 vs control.
3 讨论
肌腱蛋白-R不同功能片段的表达质粒, 包含了肌腱蛋白-R连续而不重叠的基因序列, 连接在谷胱甘肽转移酶(GST)基因后面, 在大肠杆菌中表达量高且便于纯化, 可利用谷胱甘肽琼脂糖作为填充料, 靠融合蛋白的GST部分结合到谷胱甘肽上, 达到分离的目的, 特异性较强, 分离效果较好, 从Fig 2可以看出, EGFL, EGFS的纯度较高, FN1-2, FN6-8和FG除了主带外, 还有一些分子质量比融合蛋白小的谱带, 根据文献[4]报道, 这可能是融合蛋白降解的结果.
对于包涵体的变性和复性是一个非常棘手的问题, 其原因有二, 一是包涵体形成的机制不清楚, 二是不同蛋白形成的包涵体有不同的性质, 其变性和复性的条件不同, 没有统一的原则和方法可参考. 肌腱蛋白-R的3个片段的融合蛋白以包涵体的形式存在, 对于FN1-2, FN6-8根据文献[13]介绍的方法, 可以进行包涵体的变性和复性, 而对于FG的变性和复性较困难. 在实验中, 参考了文献介绍的多种方法, 效果都不理想, 后我们作了一些改进, 用8 mol*L-1尿素变性缓冲液溶解, 延长变性时间, 让包涵体彻底变性溶解, 再用复性缓冲液进行瞬时放大, 稀释,且勿搅动,4℃静置7～10 d后, 用亲和层析法进行纯化, 得到了较为满意的结果.
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有文献报道，用融合蛋白作为培养液成分，要去除GST部分，我们在实验中考虑到用thrombin消化后，残留的thrombin对细胞的活性有抑制作用，没有切去GST，而是以GST作为对照.
肌腱蛋白-R不同的片段对脊髓细胞的存活和突起的生长有不同的作用. 这同肌腱蛋白-R结构的复杂性密切相关，这也提示，肌腱蛋白-R具有多个受体，它和不同的受体相互作用，产生不同的生物效应. 目前有关受体的研究工作还在进行之中.
作者简介:肖华胜(1968-),男(汉族)，重庆市垫江县人. 博士，讲师. Tel.(029)3374565
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收稿日期：1999-12-09； 修回日期：2000-02-20, 百拇医药