血清无机磷的酶法测定
作者：潘秋荣 赵建华 陈江华 王毓三
单位：潘秋荣(常州中医院检验科，江苏常州213003)；赵建华 陈江华 王毓三(江苏省临床检验中心)
关键词：无机磷；酶偶联法
临床检验杂志990306 摘要 建立了一种酶偶联测定血清无机磷的方法。方法线性范围为0～3 mmol/L,变异系数批内
＝1.03 mmol/L,n＝20，CV＝1.21%；批间：
＝1.28 mmol/L,n＝20，CV＝3.7%。与钼酸铵紫外光度法相关性为：r＝0.9942，Y＝0.9509X+0.0541。参考值范围为0.98～1.55 mmol/L。
我们参考有关文献[1]建立了酶偶联测定血清无机磷的方法，简便、可靠、灵敏且适合自动分析。
, http://www.100md.com
蓝色的DCIP(2，6-二氯苯靛酚 氧化型)被还原为无色的DCIP形式，可在606 nm处测定吸光度的下降值[1]，计算无机磷的含量。
1 材料
1.1 试剂 次黄苷(Inosine Wr 268.2)，黄嘌呤氧化酶(XOD)15.6 U/ml批号1875)和2，6-二氯苯靛酚(DCIP Wr290.1)均为Sigma公司产品，无磷酸核苷磷酸化酶(NP 25 U/ml)为Boehringer Mannheim公司产品。
1.2 无机磷标准贮存液 A：精确称取KH2PO4 438.71 mg,用去离子水溶解后定容至100 ml。B：精确称取KH2PO4 6.81 g,用去离子水溶解后定容至1 L,其浓度为50 mmol/L。
, 百拇医药
1.3 无机磷标准应用液 取贮存液A 4 ml加去离子水定容至100 ml(室温)，配成无机磷标准应用液1.29 mmol/L。
1.4 仪器 岛津CL-720分光光度计
1.5 底物缓冲液(pH 7.2) (114 mmol/L TEA,4.15 mmol/L次黄苷，0.08 mmol/L DCIP)吸取三乙醇胺(TEA Mr 149.19，含量80%，密度1.120～1.125)1.9 ml,次黄苷115 mg,DCIP 2.338 mg依次溶于约80 ml蒸馏水中，用1 mol/L HCl调pH至7.20再用去离子水定容至100 ml。
2 测定方法
取标有空白，测定和标准的3支试管各加入底物缓冲液1 ml,工具酶XOD原酶10 μl(0.151 U/ml)，NP原酶5 μl(0.125 U/ml)混匀，三管再分别加入双蒸水、检测样品、无机磷标准应用液20 μl，混合后37℃水浴15分钟，在606 nm波长处测吸光度的下降值。
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注：在加入样品后，酶促反应液中各成份的终末浓度：TEA 110 mmol/L,次黄苷4.0 mmol/L,DCIP 0.077 mmol/L,XOD 150 U/L,NP 120 U/L，pH 7.2。
3 计算
Pi(mmol/L)＝(Ax-Ao)/(As-Ao)×1.29
(式中：Ax为测定管吸光度，Ao为空白管吸光度，As为标准吸光度)
4 结果
4.1 反应终点时间的确定 将贮存液B配制成2.5 mmol/L和1.25 mmol/L的无机磷溶液作为样品；然后取两支试管按上述操作方法操作，分别加入两样品各20 μl，用岛津CL-720分光光度计连续检测吸光度的变化(每隔60秒)，得时间-吸光度曲线。结果表明在0～12分钟内吸光度下降较快，12分钟后曲线趋于平缓，吸光度变化不大，表明反应接近终点，故本实验选择15分钟为反应终点。
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4.2 最佳pH的选择 用1 mol/L HCl调节底物缓冲液pH，在pH 6.8～7.6范围内每隔0.2 pH单位为一测试点，分别测定同一份混合血清样品的吸光度变化。结果表明：在pH 7.2时吸光度下降最快，故选测定最适pH为7.2。
4.3 最佳次黄苷浓度选择 将底物缓冲液中的次黄苷分别配成：3.12 mmol/L，4.15 mmol/L，5.18 mmol/L，6.25 mmol/L，7.29 mmol/L，其它条件不变进行实验，结果底物浓度为4.15 mmol/L时吸光度下降最明显，随底物浓度的再增加，吸光度变化较平缓，故选择次黄苷4.15 mmol/L为最佳浓度。
4.4 工具酶浓度的选择 将反应混合液中的NP配成：50 U/L，100 U/L，120 U/L，150 U/L，200 U/L，37℃水浴4分钟后测定各管吸光度。随NP浓度的增加，吸光度下降明显，当NP≤120 U/L(5 μl)时曲线较陡峭，当NP≥120 U/L时曲线较平缓，为此我们选用NP 120 U/L为最适浓度。同时也可节省酶用量。用同样的方法选择XOD终末浓度为150 U/L。
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4.5 线性范围的测定 将Pi贮存液B分别配成浓度为：0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，3.5，4.0，5.0 mmol/L的溶液，按操作方法分别测其吸光度下降。结果该方法检测无机磷的线性范围为0～3.0 mmol/L。
4.6 精密度的测定 用同份混合血清做实验(n＝20),批内CV：
＝1.03 mmol/L,s＝0.0125，CV＝1.21%；批间CV：
＝1.28 mmol/L,s＝0.047，CV＝3.7%。
4.7 干扰实验 选择一份无机磷浓度为1.29 mmol/L样品，分别加入不同量的固体葡萄糖充分溶解后测各管磷含量，结果显示，葡萄糖浓度<20 mmol/L时对测定结果无影响。
, 百拇医药 4.8 方法对比 将混合血清分成20份，分别加入不同量的浓KH2PO4贮存液，并校正由于加入KH2PO4溶液引起的稀释，使其形成磷浓度梯度(限于0～3.0 mmol/L)，分别用本方法和钼酸铵紫外光度法(用Technicon RA-XT生化分析仪)测定，结果用配对检验：t＝1.263，P>0.05。两法作相关性分析r＝0.9942，回归方程Y＝0.9509X+0.0541，t＝39.2，P<0.001，两法相关性好。
5 讨论
5.1 该方法稳定，可靠，干扰因素少。葡萄糖可直接还原DCIP而影响无机磷的测定，实验证明葡萄糖浓度<20 mmol/L对本法测定无明显影响。另据文献报道[1]：胆红素、血红蛋白、脂质对该方法测定亦无影响，抗坏血酸浓度在250 mg/L、甘露醇200 mmol/L以下用酶法对无机磷测定不会产生有意义的影响。
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5.2 在测定过程中要尽量保持终末空白吸光度在1.0左右，以免在测定管中DCIP的量不足而造成无机磷值偏低[1]。可根据情况在配制底物缓冲液时适当增减DCIP的量。
5.3 血液中存在有机磷和无机磷，有机磷主要存在于血细胞，故采血后应尽快地分离血清或血浆，以免溶血后有机磷释放，而被磷酸酯酶水解，生成无机磷[3～5]使测定结果偏高。
该方法同样适用于测定其它体液及尿液中的无机磷。
参考文献
[1]Ungerer P J J,Heila M O.An enzymatic assay of inorganic phosphate nucleoside phosphorylase and xanthing oxidase.Clin Chem Acta,1993,223:149
, http://www.100md.com
[2]Oosthizen H M,Ungerer J P T,Bissbort S H.A novel kinetic method for determination of S-ADA.Clin Chem,1993,39:2182
[3]叶应妩，王毓三.全国临床检验操作规程.第二版.南京：东南大学出版社，1997.193～195
[4]金有余.临床生化检验学.北京：海洋出版社，1993.210～212
[5]谷世荣，等.菲尼酮作还原剂测定血清及尿中无机磷.临床检验杂志，1994；12(3)：133
(1998-10-29修回), 百拇医药
单位：潘秋荣(常州中医院检验科，江苏常州213003)；赵建华 陈江华 王毓三(江苏省临床检验中心)
关键词：无机磷；酶偶联法
临床检验杂志990306 摘要 建立了一种酶偶联测定血清无机磷的方法。方法线性范围为0～3 mmol/L,变异系数批内
＝1.03 mmol/L,n＝20，CV＝1.21%；批间：＝1.28 mmol/L,n＝20，CV＝3.7%。与钼酸铵紫外光度法相关性为：r＝0.9942，Y＝0.9509X+0.0541。参考值范围为0.98～1.55 mmol/L。我们参考有关文献[1]建立了酶偶联测定血清无机磷的方法，简便、可靠、灵敏且适合自动分析。
, http://www.100md.com
蓝色的DCIP(2，6-二氯苯靛酚 氧化型)被还原为无色的DCIP形式，可在606 nm处测定吸光度的下降值[1]，计算无机磷的含量。
1 材料
1.1 试剂 次黄苷(Inosine Wr 268.2)，黄嘌呤氧化酶(XOD)15.6 U/ml批号1875)和2，6-二氯苯靛酚(DCIP Wr290.1)均为Sigma公司产品，无磷酸核苷磷酸化酶(NP 25 U/ml)为Boehringer Mannheim公司产品。
1.2 无机磷标准贮存液 A：精确称取KH2PO4 438.71 mg,用去离子水溶解后定容至100 ml。B：精确称取KH2PO4 6.81 g,用去离子水溶解后定容至1 L,其浓度为50 mmol/L。
, 百拇医药
1.3 无机磷标准应用液 取贮存液A 4 ml加去离子水定容至100 ml(室温)，配成无机磷标准应用液1.29 mmol/L。
1.4 仪器 岛津CL-720分光光度计
1.5 底物缓冲液(pH 7.2) (114 mmol/L TEA,4.15 mmol/L次黄苷，0.08 mmol/L DCIP)吸取三乙醇胺(TEA Mr 149.19，含量80%，密度1.120～1.125)1.9 ml,次黄苷115 mg,DCIP 2.338 mg依次溶于约80 ml蒸馏水中，用1 mol/L HCl调pH至7.20再用去离子水定容至100 ml。
2 测定方法
取标有空白，测定和标准的3支试管各加入底物缓冲液1 ml,工具酶XOD原酶10 μl(0.151 U/ml)，NP原酶5 μl(0.125 U/ml)混匀，三管再分别加入双蒸水、检测样品、无机磷标准应用液20 μl，混合后37℃水浴15分钟，在606 nm波长处测吸光度的下降值。
, 百拇医药
注：在加入样品后，酶促反应液中各成份的终末浓度：TEA 110 mmol/L,次黄苷4.0 mmol/L,DCIP 0.077 mmol/L,XOD 150 U/L,NP 120 U/L，pH 7.2。
3 计算
Pi(mmol/L)＝(Ax-Ao)/(As-Ao)×1.29
(式中：Ax为测定管吸光度，Ao为空白管吸光度，As为标准吸光度)
4 结果
4.1 反应终点时间的确定 将贮存液B配制成2.5 mmol/L和1.25 mmol/L的无机磷溶液作为样品；然后取两支试管按上述操作方法操作，分别加入两样品各20 μl，用岛津CL-720分光光度计连续检测吸光度的变化(每隔60秒)，得时间-吸光度曲线。结果表明在0～12分钟内吸光度下降较快，12分钟后曲线趋于平缓，吸光度变化不大，表明反应接近终点，故本实验选择15分钟为反应终点。
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4.2 最佳pH的选择 用1 mol/L HCl调节底物缓冲液pH，在pH 6.8～7.6范围内每隔0.2 pH单位为一测试点，分别测定同一份混合血清样品的吸光度变化。结果表明：在pH 7.2时吸光度下降最快，故选测定最适pH为7.2。
4.3 最佳次黄苷浓度选择 将底物缓冲液中的次黄苷分别配成：3.12 mmol/L，4.15 mmol/L，5.18 mmol/L，6.25 mmol/L，7.29 mmol/L，其它条件不变进行实验，结果底物浓度为4.15 mmol/L时吸光度下降最明显，随底物浓度的再增加，吸光度变化较平缓，故选择次黄苷4.15 mmol/L为最佳浓度。
4.4 工具酶浓度的选择 将反应混合液中的NP配成：50 U/L，100 U/L，120 U/L，150 U/L，200 U/L，37℃水浴4分钟后测定各管吸光度。随NP浓度的增加，吸光度下降明显，当NP≤120 U/L(5 μl)时曲线较陡峭，当NP≥120 U/L时曲线较平缓，为此我们选用NP 120 U/L为最适浓度。同时也可节省酶用量。用同样的方法选择XOD终末浓度为150 U/L。
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4.5 线性范围的测定 将Pi贮存液B分别配成浓度为：0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，3.5，4.0，5.0 mmol/L的溶液，按操作方法分别测其吸光度下降。结果该方法检测无机磷的线性范围为0～3.0 mmol/L。
4.6 精密度的测定 用同份混合血清做实验(n＝20),批内CV：
＝1.03 mmol/L,s＝0.0125，CV＝1.21%；批间CV：＝1.28 mmol/L,s＝0.047，CV＝3.7%。4.7 干扰实验 选择一份无机磷浓度为1.29 mmol/L样品，分别加入不同量的固体葡萄糖充分溶解后测各管磷含量，结果显示，葡萄糖浓度<20 mmol/L时对测定结果无影响。
, 百拇医药 4.8 方法对比 将混合血清分成20份，分别加入不同量的浓KH2PO4贮存液，并校正由于加入KH2PO4溶液引起的稀释，使其形成磷浓度梯度(限于0～3.0 mmol/L)，分别用本方法和钼酸铵紫外光度法(用Technicon RA-XT生化分析仪)测定，结果用配对检验：t＝1.263，P>0.05。两法作相关性分析r＝0.9942，回归方程Y＝0.9509X+0.0541，t＝39.2，P<0.001，两法相关性好。
5 讨论
5.1 该方法稳定，可靠，干扰因素少。葡萄糖可直接还原DCIP而影响无机磷的测定，实验证明葡萄糖浓度<20 mmol/L对本法测定无明显影响。另据文献报道[1]：胆红素、血红蛋白、脂质对该方法测定亦无影响，抗坏血酸浓度在250 mg/L、甘露醇200 mmol/L以下用酶法对无机磷测定不会产生有意义的影响。
, http://www.100md.com
5.2 在测定过程中要尽量保持终末空白吸光度在1.0左右，以免在测定管中DCIP的量不足而造成无机磷值偏低[1]。可根据情况在配制底物缓冲液时适当增减DCIP的量。
5.3 血液中存在有机磷和无机磷，有机磷主要存在于血细胞，故采血后应尽快地分离血清或血浆，以免溶血后有机磷释放，而被磷酸酯酶水解，生成无机磷[3～5]使测定结果偏高。
该方法同样适用于测定其它体液及尿液中的无机磷。
参考文献
[1]Ungerer P J J,Heila M O.An enzymatic assay of inorganic phosphate nucleoside phosphorylase and xanthing oxidase.Clin Chem Acta,1993,223:149
, http://www.100md.com
[2]Oosthizen H M,Ungerer J P T,Bissbort S H.A novel kinetic method for determination of S-ADA.Clin Chem,1993,39:2182
[3]叶应妩，王毓三.全国临床检验操作规程.第二版.南京：东南大学出版社，1997.193～195
[4]金有余.临床生化检验学.北京：海洋出版社，1993.210～212
[5]谷世荣，等.菲尼酮作还原剂测定血清及尿中无机磷.临床检验杂志，1994；12(3)：133
(1998-10-29修回), 百拇医药