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编号:10276965
肌酸激酶亚型的电泳分离和荧光扫描法
http://www.100md.com 《临床检验杂志》 1999年第3期
     作者:赵昕 韩冰 杨振华

    单位:北京医院检验科,北京100730

    关键词:肌酸激酶同工酶;肌酸激酶亚型;琼脂糖凝胶电泳

    临床检验杂志990303 摘要 为了建立用琼脂糖电泳法同时测定肌酸激酶MB同工酶及CK-MM、CK-MB亚型的方法,使用不连续缓冲体系,在稳流、低压条件下电泳30分钟将两种亚型分离,荧光扫描。结果CK-MM在853~14 U/L,CK-MB在152~2.4 U/L之间结果无明显差异,CK-MM和CK-MB亚型最低检出限分别为12 U/L和2.1 U/L。一份血清标本在同一块凝胶上点7个样,连续做两次,CK-MM亚型及CK-MB亚型和同工酶具有好的重复性。已经检测了数百名心梗病人和骨骼肌疾病的病人,证明该法快速、简单、灵敏,重复性好,适用于医院常规实验室。

    肌酸激酶由基因位点控制。可形成三种同工酶,即CK-MM、CK-MB和CK-BB。CK-MM同工酶又可分成MM1、MM2、MM3三种亚型,CK-MB也可分为MB1和MB2两种亚型。目前,亚型的检测方法除电泳法外,还有一些其它的方法,但对于临床应用来说,它要求测定方法简单,快速,经济和灵敏,这样才能适用于临床常规实验室。但上述方法很难满足这方面的要求。现在我们在不断研究和改进的基础上建立的CK同工酶及亚型的测定方法已经用于临床。
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    1 材料和方法

    1.1 仪器 电泳槽和Appraise荧光光密度计均由Beckman公司生产,浇板装置由Pharmacia公司生产,DYY-Ⅲ2稳压稳流电泳仪由北京六一仪器厂生产。

    1.2 试剂 琼脂糖为中科院生物物理所试剂厂生产,CK底物液为上海长征公司生产,吗啡啉丙磺酸(MOPS)和吗啡啉羟基丙磺酸(MOPSO)及甲基噻唑四唑盐(MTT)均为Sigma公司生产,吩嗪甲酯硫酸盐(PMS)由Fluka公司生产。

    琼脂糖凝胶缓冲液pH为6.6,称取EDTA 0.55 g,咪唑1.7 g,硼酸0.23 g,巴比妥钠1.5 g,2-氨基-2-甲基1,3丙二醇3.5 g,加水溶解后用1 mol/L盐酸调pH为6.6,然后加水到1升。

    阴极电泳槽缓冲液pH为7.8,称取MOPS 10.46 g,溶于水后用5 mol/L NaOH调pH值,然后加水到1升。
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    阳极电泳槽缓冲液pH为7.4,称取MOPS 12.4 g,溶于水后用5 mol/L NaOH调pH值,然后加水到1升。

    1.3 方法

    1.3.1 制板 琼脂糖0.3 g,加入30 ml琼脂糖凝胶缓冲液,加热溶解。取一张26×13 cm的透明胶片,贴放在12.5×60 cm的玻璃板上,透明胶片上放0.5 mm厚的塑料胶条,将玻璃板、胶片及胶条用架子固定在专用浇板装置上后倾斜放好,将溶解的琼脂糖凝胶趁热慢慢从胶片的下端浇到上端,边浇边用27×12.5 cm的玻璃板由下向上慢慢推压凝胶,使其均匀铺在胶片上,并将玻璃板压在浇好的凝胶上,玻璃板上放上重铁块,水平放置,待冷却后,放入4℃冰箱30分钟,取出后撬开上层玻璃板,打开架子,将带有凝胶的透明胶片切成8×10 cm的胶片,放在保湿盒中,置4℃冰箱备用。

    1.3.2 点样 在距琼脂糖凝胶片一端3 cm处铺一条2×10 cm的滤纸,吸去表面水份,弃去滤纸,在此处放上加样塑料膜(1 cm×6 mm的8个加样孔),在加样孔处加10 μl的待测血清,10分钟后移去加样薄膜,准备电泳。
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    1.3.3 电泳 Beckman公司的电泳槽由冷却室和电泳槽两部分组成,冷却室设在电泳槽上部成拱形,将加完样的琼脂糖凝胶贴放在冷却室下面的凝胶片放样处,点样处位于阴极,冷却室内装有冰块,在电泳槽的阴阳极分别倒入MOPS和MOPSO电泳液,将冷却室盖在电泳槽上,此时凝胶的两端分别插入阴阳极电泳液中,开启电源,稳流30 mA,电压在160 V~220 V之间变化,电泳30分钟。

    1.3.4 反应 在电泳后的凝胶片上加1 ml CK 底物液,放入暗盒中,42℃温箱孵育20分钟,取出用水冲洗胶面。

    1.3.5 扫描 将冲洗过的胶片放入Beckman烘干箱烘干,烘干后的胶片用Appraise光密度计340 nm荧光扫描。

    1.3.6 统计分析采用EPI软件,统计数据用均值和标准差表示。

    2 实验结果
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    2.1 稀释实验 取CK总酶活性为1005 U/L,CK-MB为15.1%的血清,用已灭活的血清分别稀释成7种浓度,稀释后CK-MM的活性为853~14 U/L,在同一块凝胶板上电泳,结果见表1。

    表1 CK亚型稀释试验结果(%)

    CK-MM(14~853 U/L)

    CK-MB(2.4~152 U/L)

    MM1

    MM2

    MM3

    MB1

    MB2

    亚型比例
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    x±s

    CV

    14.8~16.9

    15.7±0.74.5

    58.8~62.861±1.5

    2.5

    22.4~24.923.5±1.0

    4.4

    29.4~33.631.4±1.5

    4.7

    66.4~70.668.5±1.5

    2.2
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    结果证实,当CK-MM在853~14 U/L,CK-MB在152~2.4 U/L之间,结果无明显差异,当低于最低值时有时也显荧光,但扫描结果误差较大,即CV增大。

    2.2 重复性实验 将CK总酶944 U/L,CK-MB 3.2%的一份血清在同一块凝胶上点7个样,连续做2次,共测定14点,CK-MM1、CK-MM2、CK-MM3、CK-MB1、CK-MB2的第一次板内CV%为3.5、3.5、4.8、3.7、3.2,第二次板内CV%为4.4、4.4、4.7、3.0、2.6。

    2.3 参考值 对40份体检健康者血清按上述方法进行电泳,全部查出CK-MM亚型,12人查出CK-MB亚型。这些体检者CK为74.9±34.2(U/L),CK-MB同工酶为3.5%±0.8%,MM1、MM2、MM3分别为62.8%±4.0%、27.3%±3.9%、9.9%±2.9%,MB1和MB2为65.6%±3.7%、34.4%±3.7%。
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    健康人CK亚型电泳结果的荧光扫描图见图1。

    附图 健康人CK亚型电泳后荧光扫描图

    2.4 荧光法与染色法比较 在一块凝胶上点6个样品,中间空一个位置不点,进行电泳,电泳结束后加CK底物液,孵育20分钟后,用水冲洗,然后在凝胶片中间切开,一块烘干用荧光扫描,另一块染色,染色液为0.3 g/L的MTT和0.1 g/L的PMS以25∶1的比例混合,将染色液均匀铺在未烘干的凝胶片上,放在暗盒中,3~5分钟,色带清楚后,立即用水冲洗,然后用Appraise荧光光密度计的吸收光系统扫描。

    荧光法与染色法的灵敏度均由图谱上峰的高低来判断,在光密度计按增益的程度扫描,当扫描的图谱上看不到峰图时,说明已低于检测限度。染色法最低可检测CK-MM为36 U/L,荧光法为12 U/L;染色法最低可检测CK-MB为12.3 U/L,荧光法为2.1 U/L,荧光法的灵敏度明显高于染色法。与国外报道CK-MM亚型最低可检测21 U/L[1],CK-MB亚型最低可检测1.25 U/L[2]接近。
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    3 讨论

    我们试用过很多方法测定CK-MM亚型,开始用甲染色的方法,采用不连续缓冲体系,电泳槽为巴比妥缓冲液,但染色方法灵敏度低[3],特别是MB亚型,所以改用荧光扫描[4],提高检测灵敏度。但以巴比妥缓冲液放电极槽时,凝胶烘干后,胶片上有盐类结晶,影响荧光扫描,而在阴极改用MOPS缓冲液后,减少了结晶对CK-MM亚型的影响,但CK-MB亚型的分离仍受影响。我们的实验证明阳极为MOPSO缓冲液的凝胶CK-MB亚型分得更清楚。我们还发现,用巴比妥做缓冲液时,电泳结束后,阳极缓冲液变黑,用水冲洗电泳槽时,阳极碳棒上有黑色物质被冲洗下来,而改用MOPSO做缓冲液时,就无此现象。本法当电泳结束时,凝胶片的温度为8℃,避免了酶的失活。

    我们由于选用了合适的电泳槽和凝胶缓冲液,以及设计合理的电泳槽装置,同时采用荧光扫描,使CK-MB同工酶及亚型的检测灵敏度大为提高,并且对数百名心梗病人的样品进行了检测,证明CK亚型是对心梗病人进行早期和准确诊断的特异性指标。在心肌受损时,组织中的CK-MM3和CK-MB2释放到血中,在羧基肽酶的作用下CK-MM3渐次转变为CK-MM2和CK-MM1,CK-MB2转变为CK-MB1,使MM3/MM1和MB2/MB1的值从低到高,然后又降低,心梗病人在发病4小时后,CK及CK-MB同工酶均未升高以前,MM3/MM1的比值升高,8~12小时达高峰,MB2/MB1的值在发病后2小时升高,6~8小时达高峰,24小时后均恢复正常,4~16小时诊断AMI的灵敏度MM3/MM1最高达83%,MB2/MB1最高达97%,对心梗病人CK亚型的诊断灵敏度均高于CK和CK-MB同工酶,同时我们还对心绞痛及骨骼肌等其它疾病病人的样品进行了检测,证实本法快速,简单,经济、实用。
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    参考文献

    [1]Nohara R,Sobel B E,Jaffe A S.Quantitative analysis for isoforms of creatine kinase MM in plasma by chromatofocusing,with on-line monitoring of enzyme activity.Clin Chem,1988,34(2):235

    [2]Puleo P R,Guadagno P A,Roberts R.Sensitive,rapid assay of subform of creatinekinase MB in plasma,Clin Chem,1989,35:1452

    [3]王玻,杨振华.肌型肌酸激酶亚型快速测定法及其临床应用.中华医学杂志,1990,70:401

    [4]胡厚源,杨振华,张远慧.琼脂糖凝胶电泳法测定血清肌酸激酶MB亚型.中华医学检验杂志,1995,18(6):354

    (1998-11-18修回), http://www.100md.com