维甲酸对成纤维细胞作用的体外观察
作者：宋维铭 孙广慈 管正玉 徐承熊 张国荣 曹蕊 申智慧 冯越蹇
单位：100041 中国医学科学院中国协和医科大学整形外科医院(宋维铭，孙广慈，管正五，曹蕊，申智慧，冯越蹇)，进修生(张国荣)；中国医学科学院药物研究所(徐承熊)
关键词：维甲酸；成纤维细胞；3HTdR；；瘢痕
中华医学美容杂志980407 【摘要】 目的 探讨维甲酸治疗瘢痕的作用机理及其用于临床的可能性。方法 采用成纤维细胞体外培养技术，并将3HTdR(胸腺嘧啶核苷)掺入成纤维细胞DNA中，研究维甲酸对体外培养成纤维细胞生长增殖，DNA合成及超微结构的影响。结果 维甲酸对成纤维细胞生长增殖，DNA合成有不同程度的抑制作用，呈剂量效应关系；扫描电镜和透射电镜观察显示，维甲酸对成纤维细胞合成胶原有抑制作用。结论 维甲酸治疗瘢痕的作用机理可能与抑制成纤维细胞生长增殖，阻抑成纤维细胞DNA合成及影响成纤维细胞胶原合成有关。
, http://www.100md.com
The effect of retinoic acid on fibroblast in vitro culture Song Weiming, Sun Guangci, Guan Zhengyu,et at. Plastic Surgery Hospital, China Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College. Beijing 100041
【Abstract】 Objective To investigate the possible mechanism of retinoic acid used for the treatment of scar, and clarifying its possibilities in the application of treatment of scar. Methods The effect of retinoic acid on growth proliferation, DNA synthesis and ultrastructure of fibroblasts was studied by means of the techniques of the fibroblast in vitro culture and the 3HTdR incorporation into DNA of fibroblasts. Results The results demonstrated that retinoic acid inhibits the growth proliferation and DNA synthesis of fibroblasts in vitro culture and a dose-dependent relationship between growth proliferation, DNA synethesis of fibroblasts and retinoic acid concentration was observed. Electron microscopic observateion (SEM and TEM) showed that fibrous substances on the cell surface and outside the cell had decreased. All the results indicated that retinoic acid inhibits collagen synthesis of fibroblasts. Conclusion The mechanism of retinoic acid used for the treatment of scar have a bearing on the inhibitation of growth proliferation, interruption of DNA synthesis and interference of collagen synthesis of the fibroblasts.
, 百拇医药
【Key words】 Retinoic acid Fibroblast 3H-TdR Scar
创伤愈合的研究表明，增生性瘢痕和瘢痕疙瘩是由成纤维细胞所致的胶原过量合成和沉积所致[1]。因此，近年来许多研究者运用成纤维细胞培养技术，通过在体外控制条件下研究成纤维细胞的生长增殖、胶原合成等细胞活动及其影响因素，在细胞水平上阐明瘢痕形成与瘢痕增生的调 控机理[2，3]。维甲酸(Retinoic Acid,RA)是维生素A的相关药物，具有广泛的药理作用[4，5，6]，用于治疗瘢痕已收到一定的临床效果[7，8]。为探讨RA治疗瘢痕的作用机理，作者研究了RA对体外培养成纤维细胞的影响。
材料和方法
一、药品与试剂：RA由中国医学科学院药物研究所提供，MEM Eagle 培养基系美国GIBC公司产品，胰蛋白酸及TritonX100为德国Merck公司生产，新生牛血清为天津产品，3HTdR 为中国原子能科学研究院产品，PPO及PoPoP为上海试剂一厂产品，锇酸及Epon812为美国SERVA公司生产。
, http://www.100md.com
二、成纤维细胞培养：将手术切除的皮肤在无菌条件下漂洗、剪碎，浸于含20 %新生牛血清的MEM Eagle 培养液中，置37 ℃ 、含5 %CO2孵箱中培养，待长成致密单层后用0.2 %胰蛋白酶消化传代，适用于科研的是第5～25代[9]。
三、成纤维细胞生长增殖：取第7～15代的对数生长期细胞，每个培养瓶接种8×104个，培养24小时后弃除原培养液。实验组加入不同浓度的RA(10-5-10-8mol/L)，分别于1、2、3、4及6天时收样做细胞计数，取培养时间相同未加药的细胞作为对照，每次实验各药物浓度做3个重复样品，每次实验重复3次，取均数。
四、3HTdR掺入：取第7～9代的对数生长期细胞，调整细胞液浓度为6×104/ml，接种于24孔细胞培养板，每孔加细胞悬液1.5 ml，置37 ℃，含5 %CO2培养箱中培养，培养24小时后弃除原培养液。对照组换不含药物的培养液，给药组换含按实验设计所需浓度的含药培养液，每孔1.5 ml，内含最终浓度为37 KBg/ml(IμCi/ml)的3HTdR，每一药物浓度及对照设5个平行孔。继续培养24小时后收样，弃除含未掺入的3HTdR培养基，用DHanks液洗涤3次，每孔加入0.1N的NaOH 1ml，室温下放置30分钟，取0.5 ml加入闪烁液(PPO 2.8g,PoPoP 0.05 g,二甲苯334 ml，Triton X100 116 ml)在Beckman 液闪仪LS8000进行放射活性计数。
, 百拇医药
五、细胞超微结构：取第7～11代的对数生长期细胞，扫描电镜组以2×105/瓶接种于带盖的培养瓶内，透射电镜组以2×105/瓶接种于不带盖的培养瓶内，培养24小时后选细胞生长良好者换液进行实验。扫描电镜及透射电镜实验均分为对照组和给药组。给药组分别加含最终浓度为30 μg/ml的RA，不加药组为对照，继续培养3天后常规扫描电镜和透射电镜制样。
1.扫描电镜标本制备：盖玻片的标本先用DHanks液冲洗 ，再用2.5 %戊二醛及1 %锇酸固定，其间用0.1 M磷酸缓冲液及双蒸水冲洗。随后，经系列递增浓度的酒精脱水，CO2临界点干燥，离子溅射镀金，然后在日立S520型扫描电镜下观察。
2.透射电镜标本制备：生长于瓶壁的细胞用橡皮刮子将细胞轻轻刮下，收集于离心管中，经离心收集细胞后，用2.5 % 戊二醛固定 及0.1 M磷酸缓冲液冲洗。再用1 %锇酸固定及双蒸水冲洗 。随后，用系列递增浓度的丙酮脱水，Epon812包埋，LKB超薄切片机切片，醋酸钠和枸椽酸铅双染，然后在日立H600型透射电镜下观察。
, 百拇医药
结 果
一、RA对成纤维细胞生长的抑制作用
1.RA不同剂量的作用(图1)：当把RA浓度定为10-6～10-8mol/L,观察作用6天对成纤维细胞所产生的影响。结果表明：RA对成纤维细胞生长的抑制作用，随药物浓度的升高而增强，呈剂量效应关系。
图1 RA不同作用浓度对成纤维细胞的影响
图2 RA不同作用时间对成纤维细胞的影响
2.RA不同时间的作用(图2)：把RA浓度定为10-6mol/L,分别观察1、2、3、4及6天5个不同时间对纤维细胞所产生的影响。结果显示：RA对成纤维细胞的生长抑制作用，随药物作用时间的延长而增强，呈时间效应关系。
, 百拇医药
二、RA对成纤维细胞DNA合成的影响
用DNA代谢的前身物质3HTdR掺入成纤维细胞DNA中，观察细胞内DNA合成水平，结果见附表。实验结果显示：随着RA浓度增加，3HTdR掺入下降，3HTdR掺入抑制率上升，呈剂量效应关系。表明在RA作用下，成纤维细胞DNA合成减少，生长呈抑制状态。
三、RA对成纤维细胞超微结构的影响
1.扫描电镜观察(图3)：在扫描电镜下给药组成纤维细胞表面纤维状物质和泡状突起明显减少，甚至表现为光秃。
对照组，扫描电镜×3 000
, 百拇医药
维甲酸组，透射电镜×1 200
图3 成纤维细胞扫描电镜观察
对照组成纤维细胞表面可见大量纤维状物质并交织成网状；维甲酸组成纤维细胞表面纤维状物质极少见。
2.透射电镜观察(图4)：在透射电镜下给药组成纤维细胞胞浆的粗面内质网明显减少，所见内质网显著扩张，腔中内容物稀少，有的甚至囊泡化，粗面内质网上的核蛋白体有不同程度的脱颗粒和解聚现象，线粒体肿胀或空泡化，胞膜内侧分泌小泡明显减少，胞膜外侧无均质分泌物。
对照组，扫描电镜×3 000
维甲酸组，透射电镜×1 200
, 百拇医药
图4 成纤维细胞透射电镜观察
对照组成纤维细胞胞浆内具有丰富的粗面内质网和线粒体；维甲酸组成纤维细胞浆内粗面内质网明显扩张，甚至囊泡化，核糖体脱颗粒和解聚，线粒体肿胀，空泡化。
讨 论
瘢痕的形成是创伤愈合的结果。伤口愈合质量的优劣，就局部细胞病理学而言，主要取决于：①良好的上皮细胞再生、迁移和覆盖；②成纤维细胞适量合成胶原的沉积和交联。成纤维细胞可分为合成型和收缩型。近年有研究认为：瘢痕的挛缩倾向是由于成纤维细胞收缩的结果[10]。因此，若在创伤愈合过程中使用某种药物，既能促使上皮细胞增殖分化，又能适当抑制成(肌)纤维细胞的过度增殖和活性，理应达到促进伤口愈合并防止瘢痕增生和挛缩的作用。
成纤维细胞是合成胶原的主要细胞，成纤维细胞合成与分泌胶原能力的增强或成纤维细胞的大量增殖，都可能导致胶原总量的增加[11]。不难设想，成纤维细胞的大量增殖必然会导致胶原的过量产生，如果阻断成纤维细胞的生长增殖，当能阻止瘢痕的发生与发展。
, 百拇医药
大量的细胞学与生物化学研究表明[12]，胶原蛋白是在成纤维细胞的粗面内质网内合成，而粗面内质网是由内质网与核蛋白体共同形成的一个复合机能单位，是细胞进行生物合成的重要基地。现已证实[13]，成纤维细胞粗面内质网上的核蛋白体是胶原蛋白前体合成的场所，而且证明这种合成作用不是在单个核蛋白体上，而是在多聚核蛋白体上进行。所以，核蛋白体在内质网膜上的附着、脱落以及内质网的结构变化，对胶原蛋白的合成功能具有重要意义。
本研究结果表明，用药组成纤维细胞数量明显减少，细胞生长抑制作用与RA呈时间、剂量呈效应关系，3HTdR掺入明显受抑制。电镜观察显示，用药组细胞形态有明显变化，表现为粗面内质网上的多聚核蛋白体脱颗粒和解聚，内质网扩张成大 小不等的囊泡，囊泡中内容物稀少或无内容物，而细胞表面和细胞外面纤维状物质则很少，表面突起亦减少。说明RA明显地影响成纤维细胞内质网和核蛋白体，通过对蛋白质合成过程的作用，抑制胶原的生成，此外还观察到RA对线粒体的影响也很明显。线粒体是细胞进行能量代谢的中心，合成反应需要能量，因此，通过这一途经也可影响到成纤维细胞合成胶原蛋白的功能。据此推测，RA治疗瘢痕的作用机理可能与抑制成纤维细胞生长增殖，阻抑成纤维细胞的DNA合成及影响胶原的合成有关。
, 百拇医药
然而，瘢痕的形成极其复杂，RA在体内的实际生物学过程中，是否也具有体外实验表现出的生物活性，仍需进一步研究。而且RA治疗瘢痕的作用机理可能是多方面的[14]，要完全阐明，还有待深入探讨。
附表 RA对成纤维细胞3HTdR掺入的影响 浓度
(mol/L)
cpm
(
)
抑制率(%)
(对照组-实验组)/对照组X100%
P值
, 百拇医药
对照组
2274±270
10-7
563±157
75.2
<0.01
10-6
449±196
80.3
<0.01
10-5
418±76
, 百拇医药
81.6
<0.01
10-4
341±39
85.0
<0.01
本研究承蒙北京中国医学科学院基础医学研究所细胞生物室徐炎，北京中日友好医院电镜室郭唯、盛瑞红、王石麟大力帮助，特此致谢。
本课题为国家卫生部基金资助
参考文献
1 Diegelmann R F, Cohen I D, McCoy B J. Growth kinetics and collagen synthesis of normal skin, normal scar and keloid fibrolasts in vitro. J Cell Physiol, 1979,98:341346.
, 百拇医药
2 Mooy L S, Tan EML, Holness R, et al. Effects of phenytoin on collagen metabolism and growth of skin fibroblast in culture. Clin Res, 1983, 31:22A.
3 Datubo-Brown D D, Blight A. Inhibition of human fibroblast growth in vitro by a snake oil. Br J Plast Surg, 1990,43:183186.
4 Orfanos C E, Ehlert R, Gollnick H. The retinoids: A review of their clinical pharmacology and therapeutic use. Drugs, 1987,34:459503.
, http://www.100md.com
5 Martin S, Tallman M D, Peter H, et al. Retinoids in cancer treatment. J Clin Pharmacol, 1992,32:868873.
6 De Luca L M, Darwiche N, Jones C S, et al.Retinoids in differen tiation and neoplasia. Sci Am Sci Med, 1995,2:2837.
7 Panabiere-Castaings M H. Retinoic acid in the treatment of keloids. J Dermatol Surg Oncol, 1988,14:12751276.
8 Daly T J, Golitz L E, Weston M L. A double-blind placebo controlled efficacy study tretinoin cream 0.05 % in the treatment of keloids and hypertrophic scars. Clin Res, 1986,34:159A.
, http://www.100md.com
9 Heckman C A, Vroman L, Pitlick A. The nature of substrate attached materials in human fibroblast cultures: Localization of cell and fetal calf serum components. Tissue and cell 1977,9:317334.
10 Gabbiani G,Hirschel B J,Ryan G B,et al.Granulation tissue as a contractile organ:A study of structure and function.J Exp Med,1972,135:719728.
11 Cohen I K, McCoy B J.The biloogy and control of surface overhealing. World J Surg, 1980, 4:289295.
, 百拇医药
12 洪涛主编.生物医学超微结构与电子显微镜技术.北京：科学出版社，1984.346354.
13 Hay E D. Extracellular matrix. J Cell Biol,1981,91:205223.
14 Sung L H, Tsuchihashi M. Tenshin S, et al. Effect of retinoic acid on contraction of collagen gel induced by fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun, 1994,205:455459.
(收稿：1997-12-17 修回：1998-07-17), 百拇医药
单位：100041 中国医学科学院中国协和医科大学整形外科医院(宋维铭，孙广慈，管正五，曹蕊，申智慧，冯越蹇)，进修生(张国荣)；中国医学科学院药物研究所(徐承熊)
关键词：维甲酸；成纤维细胞；3HTdR；；瘢痕
中华医学美容杂志980407 【摘要】 目的 探讨维甲酸治疗瘢痕的作用机理及其用于临床的可能性。方法 采用成纤维细胞体外培养技术，并将3HTdR(胸腺嘧啶核苷)掺入成纤维细胞DNA中，研究维甲酸对体外培养成纤维细胞生长增殖，DNA合成及超微结构的影响。结果 维甲酸对成纤维细胞生长增殖，DNA合成有不同程度的抑制作用，呈剂量效应关系；扫描电镜和透射电镜观察显示，维甲酸对成纤维细胞合成胶原有抑制作用。结论 维甲酸治疗瘢痕的作用机理可能与抑制成纤维细胞生长增殖，阻抑成纤维细胞DNA合成及影响成纤维细胞胶原合成有关。
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The effect of retinoic acid on fibroblast in vitro culture Song Weiming, Sun Guangci, Guan Zhengyu,et at. Plastic Surgery Hospital, China Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College. Beijing 100041
【Abstract】 Objective To investigate the possible mechanism of retinoic acid used for the treatment of scar, and clarifying its possibilities in the application of treatment of scar. Methods The effect of retinoic acid on growth proliferation, DNA synthesis and ultrastructure of fibroblasts was studied by means of the techniques of the fibroblast in vitro culture and the 3HTdR incorporation into DNA of fibroblasts. Results The results demonstrated that retinoic acid inhibits the growth proliferation and DNA synthesis of fibroblasts in vitro culture and a dose-dependent relationship between growth proliferation, DNA synethesis of fibroblasts and retinoic acid concentration was observed. Electron microscopic observateion (SEM and TEM) showed that fibrous substances on the cell surface and outside the cell had decreased. All the results indicated that retinoic acid inhibits collagen synthesis of fibroblasts. Conclusion The mechanism of retinoic acid used for the treatment of scar have a bearing on the inhibitation of growth proliferation, interruption of DNA synthesis and interference of collagen synthesis of the fibroblasts.
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【Key words】 Retinoic acid Fibroblast 3H-TdR Scar
创伤愈合的研究表明，增生性瘢痕和瘢痕疙瘩是由成纤维细胞所致的胶原过量合成和沉积所致[1]。因此，近年来许多研究者运用成纤维细胞培养技术，通过在体外控制条件下研究成纤维细胞的生长增殖、胶原合成等细胞活动及其影响因素，在细胞水平上阐明瘢痕形成与瘢痕增生的调 控机理[2，3]。维甲酸(Retinoic Acid,RA)是维生素A的相关药物，具有广泛的药理作用[4，5，6]，用于治疗瘢痕已收到一定的临床效果[7，8]。为探讨RA治疗瘢痕的作用机理，作者研究了RA对体外培养成纤维细胞的影响。
材料和方法
一、药品与试剂：RA由中国医学科学院药物研究所提供，MEM Eagle 培养基系美国GIBC公司产品，胰蛋白酸及TritonX100为德国Merck公司生产，新生牛血清为天津产品，3HTdR 为中国原子能科学研究院产品，PPO及PoPoP为上海试剂一厂产品，锇酸及Epon812为美国SERVA公司生产。
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二、成纤维细胞培养：将手术切除的皮肤在无菌条件下漂洗、剪碎，浸于含20 %新生牛血清的MEM Eagle 培养液中，置37 ℃ 、含5 %CO2孵箱中培养，待长成致密单层后用0.2 %胰蛋白酶消化传代，适用于科研的是第5～25代[9]。
三、成纤维细胞生长增殖：取第7～15代的对数生长期细胞，每个培养瓶接种8×104个，培养24小时后弃除原培养液。实验组加入不同浓度的RA(10-5-10-8mol/L)，分别于1、2、3、4及6天时收样做细胞计数，取培养时间相同未加药的细胞作为对照，每次实验各药物浓度做3个重复样品，每次实验重复3次，取均数。
四、3HTdR掺入：取第7～9代的对数生长期细胞，调整细胞液浓度为6×104/ml，接种于24孔细胞培养板，每孔加细胞悬液1.5 ml，置37 ℃，含5 %CO2培养箱中培养，培养24小时后弃除原培养液。对照组换不含药物的培养液，给药组换含按实验设计所需浓度的含药培养液，每孔1.5 ml，内含最终浓度为37 KBg/ml(IμCi/ml)的3HTdR，每一药物浓度及对照设5个平行孔。继续培养24小时后收样，弃除含未掺入的3HTdR培养基，用DHanks液洗涤3次，每孔加入0.1N的NaOH 1ml，室温下放置30分钟，取0.5 ml加入闪烁液(PPO 2.8g,PoPoP 0.05 g,二甲苯334 ml，Triton X100 116 ml)在Beckman 液闪仪LS8000进行放射活性计数。
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五、细胞超微结构：取第7～11代的对数生长期细胞，扫描电镜组以2×105/瓶接种于带盖的培养瓶内，透射电镜组以2×105/瓶接种于不带盖的培养瓶内，培养24小时后选细胞生长良好者换液进行实验。扫描电镜及透射电镜实验均分为对照组和给药组。给药组分别加含最终浓度为30 μg/ml的RA，不加药组为对照，继续培养3天后常规扫描电镜和透射电镜制样。
1.扫描电镜标本制备：盖玻片的标本先用DHanks液冲洗 ，再用2.5 %戊二醛及1 %锇酸固定，其间用0.1 M磷酸缓冲液及双蒸水冲洗。随后，经系列递增浓度的酒精脱水，CO2临界点干燥，离子溅射镀金，然后在日立S520型扫描电镜下观察。
2.透射电镜标本制备：生长于瓶壁的细胞用橡皮刮子将细胞轻轻刮下，收集于离心管中，经离心收集细胞后，用2.5 % 戊二醛固定 及0.1 M磷酸缓冲液冲洗。再用1 %锇酸固定及双蒸水冲洗 。随后，用系列递增浓度的丙酮脱水，Epon812包埋，LKB超薄切片机切片，醋酸钠和枸椽酸铅双染，然后在日立H600型透射电镜下观察。
, 百拇医药
结 果
一、RA对成纤维细胞生长的抑制作用
1.RA不同剂量的作用(图1)：当把RA浓度定为10-6～10-8mol/L,观察作用6天对成纤维细胞所产生的影响。结果表明：RA对成纤维细胞生长的抑制作用，随药物浓度的升高而增强，呈剂量效应关系。
图1 RA不同作用浓度对成纤维细胞的影响
图2 RA不同作用时间对成纤维细胞的影响
2.RA不同时间的作用(图2)：把RA浓度定为10-6mol/L,分别观察1、2、3、4及6天5个不同时间对纤维细胞所产生的影响。结果显示：RA对成纤维细胞的生长抑制作用，随药物作用时间的延长而增强，呈时间效应关系。
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二、RA对成纤维细胞DNA合成的影响
用DNA代谢的前身物质3HTdR掺入成纤维细胞DNA中，观察细胞内DNA合成水平，结果见附表。实验结果显示：随着RA浓度增加，3HTdR掺入下降，3HTdR掺入抑制率上升，呈剂量效应关系。表明在RA作用下，成纤维细胞DNA合成减少，生长呈抑制状态。
三、RA对成纤维细胞超微结构的影响
1.扫描电镜观察(图3)：在扫描电镜下给药组成纤维细胞表面纤维状物质和泡状突起明显减少，甚至表现为光秃。
对照组，扫描电镜×3 000
, 百拇医药
维甲酸组，透射电镜×1 200
图3 成纤维细胞扫描电镜观察
对照组成纤维细胞表面可见大量纤维状物质并交织成网状；维甲酸组成纤维细胞表面纤维状物质极少见。
2.透射电镜观察(图4)：在透射电镜下给药组成纤维细胞胞浆的粗面内质网明显减少，所见内质网显著扩张，腔中内容物稀少，有的甚至囊泡化，粗面内质网上的核蛋白体有不同程度的脱颗粒和解聚现象，线粒体肿胀或空泡化，胞膜内侧分泌小泡明显减少，胞膜外侧无均质分泌物。
对照组，扫描电镜×3 000
维甲酸组，透射电镜×1 200
, 百拇医药
图4 成纤维细胞透射电镜观察
对照组成纤维细胞胞浆内具有丰富的粗面内质网和线粒体；维甲酸组成纤维细胞浆内粗面内质网明显扩张，甚至囊泡化，核糖体脱颗粒和解聚，线粒体肿胀，空泡化。
讨 论
瘢痕的形成是创伤愈合的结果。伤口愈合质量的优劣，就局部细胞病理学而言，主要取决于：①良好的上皮细胞再生、迁移和覆盖；②成纤维细胞适量合成胶原的沉积和交联。成纤维细胞可分为合成型和收缩型。近年有研究认为：瘢痕的挛缩倾向是由于成纤维细胞收缩的结果[10]。因此，若在创伤愈合过程中使用某种药物，既能促使上皮细胞增殖分化，又能适当抑制成(肌)纤维细胞的过度增殖和活性，理应达到促进伤口愈合并防止瘢痕增生和挛缩的作用。
成纤维细胞是合成胶原的主要细胞，成纤维细胞合成与分泌胶原能力的增强或成纤维细胞的大量增殖，都可能导致胶原总量的增加[11]。不难设想，成纤维细胞的大量增殖必然会导致胶原的过量产生，如果阻断成纤维细胞的生长增殖，当能阻止瘢痕的发生与发展。
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大量的细胞学与生物化学研究表明[12]，胶原蛋白是在成纤维细胞的粗面内质网内合成，而粗面内质网是由内质网与核蛋白体共同形成的一个复合机能单位，是细胞进行生物合成的重要基地。现已证实[13]，成纤维细胞粗面内质网上的核蛋白体是胶原蛋白前体合成的场所，而且证明这种合成作用不是在单个核蛋白体上，而是在多聚核蛋白体上进行。所以，核蛋白体在内质网膜上的附着、脱落以及内质网的结构变化，对胶原蛋白的合成功能具有重要意义。
本研究结果表明，用药组成纤维细胞数量明显减少，细胞生长抑制作用与RA呈时间、剂量呈效应关系，3HTdR掺入明显受抑制。电镜观察显示，用药组细胞形态有明显变化，表现为粗面内质网上的多聚核蛋白体脱颗粒和解聚，内质网扩张成大 小不等的囊泡，囊泡中内容物稀少或无内容物，而细胞表面和细胞外面纤维状物质则很少，表面突起亦减少。说明RA明显地影响成纤维细胞内质网和核蛋白体，通过对蛋白质合成过程的作用，抑制胶原的生成，此外还观察到RA对线粒体的影响也很明显。线粒体是细胞进行能量代谢的中心，合成反应需要能量，因此，通过这一途经也可影响到成纤维细胞合成胶原蛋白的功能。据此推测，RA治疗瘢痕的作用机理可能与抑制成纤维细胞生长增殖，阻抑成纤维细胞的DNA合成及影响胶原的合成有关。
, 百拇医药
然而，瘢痕的形成极其复杂，RA在体内的实际生物学过程中，是否也具有体外实验表现出的生物活性，仍需进一步研究。而且RA治疗瘢痕的作用机理可能是多方面的[14]，要完全阐明，还有待深入探讨。
附表 RA对成纤维细胞3HTdR掺入的影响 浓度
(mol/L)
cpm
(
)抑制率(%)
(对照组-实验组)/对照组X100%
P值
, 百拇医药
对照组
2274±270
10-7
563±157
75.2
<0.01
10-6
449±196
80.3
<0.01
10-5
418±76
, 百拇医药
81.6
<0.01
10-4
341±39
85.0
<0.01
本研究承蒙北京中国医学科学院基础医学研究所细胞生物室徐炎，北京中日友好医院电镜室郭唯、盛瑞红、王石麟大力帮助，特此致谢。
本课题为国家卫生部基金资助
参考文献
1 Diegelmann R F, Cohen I D, McCoy B J. Growth kinetics and collagen synthesis of normal skin, normal scar and keloid fibrolasts in vitro. J Cell Physiol, 1979,98:341346.
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2 Mooy L S, Tan EML, Holness R, et al. Effects of phenytoin on collagen metabolism and growth of skin fibroblast in culture. Clin Res, 1983, 31:22A.
3 Datubo-Brown D D, Blight A. Inhibition of human fibroblast growth in vitro by a snake oil. Br J Plast Surg, 1990,43:183186.
4 Orfanos C E, Ehlert R, Gollnick H. The retinoids: A review of their clinical pharmacology and therapeutic use. Drugs, 1987,34:459503.
, http://www.100md.com
5 Martin S, Tallman M D, Peter H, et al. Retinoids in cancer treatment. J Clin Pharmacol, 1992,32:868873.
6 De Luca L M, Darwiche N, Jones C S, et al.Retinoids in differen tiation and neoplasia. Sci Am Sci Med, 1995,2:2837.
7 Panabiere-Castaings M H. Retinoic acid in the treatment of keloids. J Dermatol Surg Oncol, 1988,14:12751276.
8 Daly T J, Golitz L E, Weston M L. A double-blind placebo controlled efficacy study tretinoin cream 0.05 % in the treatment of keloids and hypertrophic scars. Clin Res, 1986,34:159A.
, http://www.100md.com
9 Heckman C A, Vroman L, Pitlick A. The nature of substrate attached materials in human fibroblast cultures: Localization of cell and fetal calf serum components. Tissue and cell 1977,9:317334.
10 Gabbiani G,Hirschel B J,Ryan G B,et al.Granulation tissue as a contractile organ:A study of structure and function.J Exp Med,1972,135:719728.
11 Cohen I K, McCoy B J.The biloogy and control of surface overhealing. World J Surg, 1980, 4:289295.
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12 洪涛主编.生物医学超微结构与电子显微镜技术.北京：科学出版社，1984.346354.
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(收稿：1997-12-17 修回：1998-07-17), 百拇医药