大鼠中脑导水管周围灰质至脊髓背角5-HT能纤维的投射
作者：张崇智 何仲义 速家震 秦 毅 王效军
单位：张崇智 何仲义 速家震 秦 毅 王效军(宁夏医学院解剖学教研室 750004)
关键词：中脑；导水管周围灰质；脊髓背角；过氧化物酶
宁夏医学杂志990701 【摘要】 目的 确定与痛觉调节有关的中脑导水管周围灰质(PAG)至脊髓(SpC)背角的五羟色胺(5-HT)能神经元通路。方法 用辣根过氧化物酶(HRP)逆行追踪与免疫细胞化学相结合的方法对大鼠PAG至SpC背角的5-HT能投射纤维予以标记。结果 在大鼠PAG和延髓中缝核(NR)内观察到HRP阳性与5-HT阳性的双标记神经元，该纤维可投射到颈、胸、腰段SpC；双标细胞以同侧为主，对侧较少。结论 实验结果表明，从PAG-NR-SpC背角形成一条间接通路；另一条为PAG直接向SPC背角投射而成的直接通路。
The projection from serotoninergicneurons of periaqueductal gray to
, 百拇医药
dorsal horn of spinal cord in the rat
Zhang Chongzhi，He Zhongyi，Su Jiazhen，et al.
(Anatomy Dept. of Ningxia Med.Coll.)
【Abstract】 Objectives To determine the 5-HT pathway from periaqueductal gray (PAG) to the dorsal horns of spinal cord (SpC) related to the painful regulation.Methods Using a combining method of HRP retrograde tracing with immunocytochemistry for labelling the serotonergic projections from the PAG to the dorsal horns of SpC.Results Both HRP and 5-HT immunoractivity double-labeled neurons were observed in the PAG and nucleus raphe (NR) of rats.The HRP and 5-HT fibers that project to SpC were found in the dorsal horns of the cervical，thoracic and lumbar segments of the SpC.And the double-labeled neurons on ipsilateral side were much more than that on contralateral side.Conclutions The results showed that there might be a connecting way for PAG-NR-SpC indirect pathway which relayed at NR，the other is a direct pathway that PAG neurons project to dorsal horn of SpC.
, 百拇医药
【Key words】 Mesencpheclin，periaqueductalgray；Spinal cord related；Immunoenzyme techniques
有资料认为，PAG可直接发出纤维投射至脊髓〔1，2〕。中缝核群是痛觉调节的重要中枢部位，内含5-HT能及其它多种递质的神经元。神经生理学及神经药理学证实该核群内的5-HT能和ENK能神经元与痛觉抑制有关〔3〕。刘庆莹等的研究，进一步阐明脊髓背角内的5-HT能纤维主要来自延髓中缝大核及腹侧网状结构〔4，5〕。现已确认脊髓背角接受外周伤害性冲动的躯体初级传入纤维，PAG通过延髓中缝核及邻近的网状结构至脊髓背角这条下行通路对脊髓背角的初级传入纤维具有较强的调节作用。然而，是否中缝核群5-HT下行系统在脊髓各部节段均有投射纤维终止，由PAG直接投射至脊髓背角的纤维数量多寡以及PAG如何直接作用于脊髓背角初级纤维的问题研究尚少。本文拟用HRP逆行追踪和免疫细胞化学结合法进一步研究PAG-延髓中缝核NR-脊髓背角通5-HT能神经元的投射，为研究该通路对外周伤害性刺激的机制提供形态学依据。
, 百拇医药
1 材料和方法
SD大鼠30只，体重160～280g，雌雄不拘。20%乌拉坦(5ml/kg)腹腔麻醉，直视下将30%HRP(Sigma Ⅵ)1μl缓慢注入右侧脊髓背角(其中颈段8只，胸段12只，腰段10只)。存活48小时后，生理盐水灌洗，之后依次用含0.1%多聚甲醛和1.25%戊二醛的磷酸缓冲液(0.1mol/L PH7.4)500ml及含10%蔗糖的磷缓液(0.1mol/L 4℃)灌注。注毕，取出脑干置入含30%蔗糖的 PBS液中(4℃冰箱)过夜。恒冷箱连续水平切片，片厚40μm，隔片取一。先用TMB法呈色，后用DAB/CoCl2/H2O2溶液稳定TMB反应产物(5分钟)。PBS洗6次后，选有HRP阳性标记细胞的切片用ABC法进行免疫反应：切片孵育于抗5-HT血清(1：8000，第四军医大学)48小时(4℃)，再将切片分别孵于羊抗兔血清(GAR1：200)和ABC(1：200)液中各2小时，入0.05%DAB/0.02%H2O2呈色5～10分钟。上述各步骤前后均用PBS充分洗涤，光镜观察。
, 百拇医药
对照实验：每组动物各取2例为对照，以PBS代替一级抗血清作免疫细胞化学反应。
2 结果
在HRP和免疫细胞化学结合实验的切片上，可见三种细胞：①5-HT免疫反应阳性的神经元胞浆中散在均匀的棕黄色颗粒；②HRP单标细胞的胞浆中可见粗大的黑色颗粒；③HRP和5-HT双标细胞，在棕黄色背景的胞浆内散布着粗大的黑色颗粒。
2.1 HRP标记组：PAG向脊髓背角投射的起源细胞在PAG的吻、中、尾侧均可见到，以尾侧的腹外侧区占优势。脊髓各段注射组以颈段组切片的标记细胞为多，胸段次之，腰段最少。PAG内的HRP标记细胞双侧可见，但同侧多于对侧。主要为梭形和三角形的中型细胞(20～30um)。小型(<20μm)梭形细胞和大型(>30μm)多角形细胞较少见。在延髓隐核、苍白核、及大缝核均可见到HRP逆标细胞，但以大缝核内为多。细胞形态为中小型多极、椭园形或梭形细胞，标记细胞数目由多至少仍为颈段组>胸段组>腰段组，注射区同侧占优势。
, 百拇医药
2.2 HRP-5-HT双标组：PAG内的HRP-5-HT双标细胞数量较少，且主要分布于PAG的中、尾段腹外侧区。PAG内，此类细胞反占HRP标记细胞总数的6.5%，双标细胞多为中小梭形、三角形及多角形细胞较少见。注射侧多于对侧。延髓缝核(隐核、苍白核及大缝核)内双标细胞较PAG内明显增多，此类细胞占HRP标记细胞总数的43.6%。其中又以大缝核内双标细胞为最多，占缝核双标细胞总数的53.0%。双标细胞亦为中小型多角细胞为主，颈段组较多，腰段组最少，注射侧大于对侧。对照组实验动物切片未见5-HT免疫反应阳性神经元。
3 讨论
大鼠脊髓背角注射HRP后，经5-HT免疫细胞化学反应的切片，在PAG和延髓缝核均出现了HRP和5-HT免疫阳性的双标细胞，从而证明脊髓背角有直接来自PAG和延髓缝核的5-HT能下行投射纤维。但实验结果也表明来源于PAG区的双标细胞较少，仅占HRP阳性细胞总数的6.5%。而来自延髓缝核的则占53%，其中又以大中缝核为主要来源，可占缝核双标细胞总数的69%。Bowker对猫的研究表明，投射到脊髓的缝核神经元有80%是属于5-HT能纤维，且其中75%以上来自中缝大核。实验结果显示：颈、胸、腰段各实验组的动物均在PAG和缝核内出现双标细胞，其数量依此为颈段>胸段>腰段。本文认为该结果由于难以排除在较高位脊髓段注射HRP时对投射至低位脊髓的下行过路纤维污染造成的假阳性，还不足以证明至其它节段的5-HT纤维少于颈段，但可以说明PAG和延髓缝核发出的5-HT下行投射纤维可达脊髓各节段，从而对各部脊髓背角的初级传入纤维伤害性刺激行使调控机能。
, 百拇医药
诸多资料表明，PAG具有多种复杂的生理机能，尤其在中枢的内源性镇痛系统中起着重要作用。其纤维联系广泛，几乎涉及中枢神经系大部分结构〔8〕。PAG内除含有学者们广泛关注的与痛觉有关的P物质、5-HT及ENK能神经元外，新近采用的免疫细胞化学方法和原位杂交技术还发现该区内尚有生长抑素、血管活性肽、神经肽、降钙基因相关肽、甘丙肽等肽类物质〔7〕，细胞色素氧化酶和一氧化氮(合酶)等免疫阳性的神经元。Bowker证实，自缝核投射至脊髓背角的神经元含有5-HT、SP和ENK，其中5-HT能纤维为主要成分。那么，由PAG和缝核投射到脊髓背角的神经元是否还含有其它化学递质或神经活性物质，机能如何，这些物质的共存现象等尚缺乏进一步的研究。
研究结果提示，终止于脊髓背角的5-HT纤维终末来源于延髓缝核(中缝大核为主)和PAG。推测从PAG至脊髓背角有两条通路，即从PAG-延髓中缝核和邻近网状结构-脊髓背角之间形成一条5-HT能纤维的间接通路；另一条则是PAG-脊髓背角的直接通路。根据目前研究，这些纤维大多含有与镇痛有关的神经递质，PAG可能正是通过这二条通路对脊髓背角的初级伤害性传入发挥其抑痛的生理功能。
, 百拇医药
参考文献
1 刘贤钊，朱家祥，等.延髓缝核SP神经元至脊髓背角的下行投射—HRP逆行追踪与免疫细胞化学结合法研究.神经解剖学杂志，1988，4(2)：178
2 Kudo N，Furukawa F，Okado N.Development of descending fibers to the rat embryonic spinal cord.Neurosci Res，1993，16(2)：131
3 Wang-QP，Nakai Y，et al.The dorsal raphe ：an important nucleus in pain modulation Bain Res Bull，1994，34(6)：575
4 刘庆莹，朱长庚，等.脊髓背角5-羟色胺纤维的来源和超微结构分布—HRP与免疫细胞化学结合法研究和免疫电镜观察.解剖学报，1988，19(4)：376
, http://www.100md.com
5 冯广友，周明付，等.大鼠脑干5-羟色胺神经元至今致腰骶髓的投射研究.河南医大学报，1994，29(1)：13
6 Boker RM，Reddy-VK，et al.Serotonergic raphe neurons projecting to the feline lumber and cervical spinal cord：a quatitative hoseradish peroxidase-immunocytochemical study.Neurosci Lett，1987，75(1)：31
7 刘孟，许鹿希.大鼠中脑导水管周围灰质的细胞构筑及纤维系.解剖科学进展.1996，2(4)：313
责编：杨自革
(收稿：1998—11—04), 百拇医药
单位：张崇智 何仲义 速家震 秦 毅 王效军(宁夏医学院解剖学教研室 750004)
关键词：中脑；导水管周围灰质；脊髓背角；过氧化物酶
宁夏医学杂志990701 【摘要】 目的 确定与痛觉调节有关的中脑导水管周围灰质(PAG)至脊髓(SpC)背角的五羟色胺(5-HT)能神经元通路。方法 用辣根过氧化物酶(HRP)逆行追踪与免疫细胞化学相结合的方法对大鼠PAG至SpC背角的5-HT能投射纤维予以标记。结果 在大鼠PAG和延髓中缝核(NR)内观察到HRP阳性与5-HT阳性的双标记神经元，该纤维可投射到颈、胸、腰段SpC；双标细胞以同侧为主，对侧较少。结论 实验结果表明，从PAG-NR-SpC背角形成一条间接通路；另一条为PAG直接向SPC背角投射而成的直接通路。
The projection from serotoninergicneurons of periaqueductal gray to
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dorsal horn of spinal cord in the rat
Zhang Chongzhi，He Zhongyi，Su Jiazhen，et al.
(Anatomy Dept. of Ningxia Med.Coll.)
【Abstract】 Objectives To determine the 5-HT pathway from periaqueductal gray (PAG) to the dorsal horns of spinal cord (SpC) related to the painful regulation.Methods Using a combining method of HRP retrograde tracing with immunocytochemistry for labelling the serotonergic projections from the PAG to the dorsal horns of SpC.Results Both HRP and 5-HT immunoractivity double-labeled neurons were observed in the PAG and nucleus raphe (NR) of rats.The HRP and 5-HT fibers that project to SpC were found in the dorsal horns of the cervical，thoracic and lumbar segments of the SpC.And the double-labeled neurons on ipsilateral side were much more than that on contralateral side.Conclutions The results showed that there might be a connecting way for PAG-NR-SpC indirect pathway which relayed at NR，the other is a direct pathway that PAG neurons project to dorsal horn of SpC.
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【Key words】 Mesencpheclin，periaqueductalgray；Spinal cord related；Immunoenzyme techniques
有资料认为，PAG可直接发出纤维投射至脊髓〔1，2〕。中缝核群是痛觉调节的重要中枢部位，内含5-HT能及其它多种递质的神经元。神经生理学及神经药理学证实该核群内的5-HT能和ENK能神经元与痛觉抑制有关〔3〕。刘庆莹等的研究，进一步阐明脊髓背角内的5-HT能纤维主要来自延髓中缝大核及腹侧网状结构〔4，5〕。现已确认脊髓背角接受外周伤害性冲动的躯体初级传入纤维，PAG通过延髓中缝核及邻近的网状结构至脊髓背角这条下行通路对脊髓背角的初级传入纤维具有较强的调节作用。然而，是否中缝核群5-HT下行系统在脊髓各部节段均有投射纤维终止，由PAG直接投射至脊髓背角的纤维数量多寡以及PAG如何直接作用于脊髓背角初级纤维的问题研究尚少。本文拟用HRP逆行追踪和免疫细胞化学结合法进一步研究PAG-延髓中缝核NR-脊髓背角通5-HT能神经元的投射，为研究该通路对外周伤害性刺激的机制提供形态学依据。
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1 材料和方法
SD大鼠30只，体重160～280g，雌雄不拘。20%乌拉坦(5ml/kg)腹腔麻醉，直视下将30%HRP(Sigma Ⅵ)1μl缓慢注入右侧脊髓背角(其中颈段8只，胸段12只，腰段10只)。存活48小时后，生理盐水灌洗，之后依次用含0.1%多聚甲醛和1.25%戊二醛的磷酸缓冲液(0.1mol/L PH7.4)500ml及含10%蔗糖的磷缓液(0.1mol/L 4℃)灌注。注毕，取出脑干置入含30%蔗糖的 PBS液中(4℃冰箱)过夜。恒冷箱连续水平切片，片厚40μm，隔片取一。先用TMB法呈色，后用DAB/CoCl2/H2O2溶液稳定TMB反应产物(5分钟)。PBS洗6次后，选有HRP阳性标记细胞的切片用ABC法进行免疫反应：切片孵育于抗5-HT血清(1：8000，第四军医大学)48小时(4℃)，再将切片分别孵于羊抗兔血清(GAR1：200)和ABC(1：200)液中各2小时，入0.05%DAB/0.02%H2O2呈色5～10分钟。上述各步骤前后均用PBS充分洗涤，光镜观察。
, 百拇医药
对照实验：每组动物各取2例为对照，以PBS代替一级抗血清作免疫细胞化学反应。
2 结果
在HRP和免疫细胞化学结合实验的切片上，可见三种细胞：①5-HT免疫反应阳性的神经元胞浆中散在均匀的棕黄色颗粒；②HRP单标细胞的胞浆中可见粗大的黑色颗粒；③HRP和5-HT双标细胞，在棕黄色背景的胞浆内散布着粗大的黑色颗粒。
2.1 HRP标记组：PAG向脊髓背角投射的起源细胞在PAG的吻、中、尾侧均可见到，以尾侧的腹外侧区占优势。脊髓各段注射组以颈段组切片的标记细胞为多，胸段次之，腰段最少。PAG内的HRP标记细胞双侧可见，但同侧多于对侧。主要为梭形和三角形的中型细胞(20～30um)。小型(<20μm)梭形细胞和大型(>30μm)多角形细胞较少见。在延髓隐核、苍白核、及大缝核均可见到HRP逆标细胞，但以大缝核内为多。细胞形态为中小型多极、椭园形或梭形细胞，标记细胞数目由多至少仍为颈段组>胸段组>腰段组，注射区同侧占优势。
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2.2 HRP-5-HT双标组：PAG内的HRP-5-HT双标细胞数量较少，且主要分布于PAG的中、尾段腹外侧区。PAG内，此类细胞反占HRP标记细胞总数的6.5%，双标细胞多为中小梭形、三角形及多角形细胞较少见。注射侧多于对侧。延髓缝核(隐核、苍白核及大缝核)内双标细胞较PAG内明显增多，此类细胞占HRP标记细胞总数的43.6%。其中又以大缝核内双标细胞为最多，占缝核双标细胞总数的53.0%。双标细胞亦为中小型多角细胞为主，颈段组较多，腰段组最少，注射侧大于对侧。对照组实验动物切片未见5-HT免疫反应阳性神经元。
3 讨论
大鼠脊髓背角注射HRP后，经5-HT免疫细胞化学反应的切片，在PAG和延髓缝核均出现了HRP和5-HT免疫阳性的双标细胞，从而证明脊髓背角有直接来自PAG和延髓缝核的5-HT能下行投射纤维。但实验结果也表明来源于PAG区的双标细胞较少，仅占HRP阳性细胞总数的6.5%。而来自延髓缝核的则占53%，其中又以大中缝核为主要来源，可占缝核双标细胞总数的69%。Bowker对猫的研究表明，投射到脊髓的缝核神经元有80%是属于5-HT能纤维，且其中75%以上来自中缝大核。实验结果显示：颈、胸、腰段各实验组的动物均在PAG和缝核内出现双标细胞，其数量依此为颈段>胸段>腰段。本文认为该结果由于难以排除在较高位脊髓段注射HRP时对投射至低位脊髓的下行过路纤维污染造成的假阳性，还不足以证明至其它节段的5-HT纤维少于颈段，但可以说明PAG和延髓缝核发出的5-HT下行投射纤维可达脊髓各节段，从而对各部脊髓背角的初级传入纤维伤害性刺激行使调控机能。
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诸多资料表明，PAG具有多种复杂的生理机能，尤其在中枢的内源性镇痛系统中起着重要作用。其纤维联系广泛，几乎涉及中枢神经系大部分结构〔8〕。PAG内除含有学者们广泛关注的与痛觉有关的P物质、5-HT及ENK能神经元外，新近采用的免疫细胞化学方法和原位杂交技术还发现该区内尚有生长抑素、血管活性肽、神经肽、降钙基因相关肽、甘丙肽等肽类物质〔7〕，细胞色素氧化酶和一氧化氮(合酶)等免疫阳性的神经元。Bowker证实，自缝核投射至脊髓背角的神经元含有5-HT、SP和ENK，其中5-HT能纤维为主要成分。那么，由PAG和缝核投射到脊髓背角的神经元是否还含有其它化学递质或神经活性物质，机能如何，这些物质的共存现象等尚缺乏进一步的研究。
研究结果提示，终止于脊髓背角的5-HT纤维终末来源于延髓缝核(中缝大核为主)和PAG。推测从PAG至脊髓背角有两条通路，即从PAG-延髓中缝核和邻近网状结构-脊髓背角之间形成一条5-HT能纤维的间接通路；另一条则是PAG-脊髓背角的直接通路。根据目前研究，这些纤维大多含有与镇痛有关的神经递质，PAG可能正是通过这二条通路对脊髓背角的初级伤害性传入发挥其抑痛的生理功能。
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参考文献
1 刘贤钊，朱家祥，等.延髓缝核SP神经元至脊髓背角的下行投射—HRP逆行追踪与免疫细胞化学结合法研究.神经解剖学杂志，1988，4(2)：178
2 Kudo N，Furukawa F，Okado N.Development of descending fibers to the rat embryonic spinal cord.Neurosci Res，1993，16(2)：131
3 Wang-QP，Nakai Y，et al.The dorsal raphe ：an important nucleus in pain modulation Bain Res Bull，1994，34(6)：575
4 刘庆莹，朱长庚，等.脊髓背角5-羟色胺纤维的来源和超微结构分布—HRP与免疫细胞化学结合法研究和免疫电镜观察.解剖学报，1988，19(4)：376
, http://www.100md.com
5 冯广友，周明付，等.大鼠脑干5-羟色胺神经元至今致腰骶髓的投射研究.河南医大学报，1994，29(1)：13
6 Boker RM，Reddy-VK，et al.Serotonergic raphe neurons projecting to the feline lumber and cervical spinal cord：a quatitative hoseradish peroxidase-immunocytochemical study.Neurosci Lett，1987，75(1)：31
7 刘孟，许鹿希.大鼠中脑导水管周围灰质的细胞构筑及纤维系.解剖科学进展.1996，2(4)：313
责编：杨自革
(收稿：1998—11—04), 百拇医药