维甲酸缺乏对体外鼠磨牙牙胚冠部形态发生的影响
作者：韩建国 高玉光 樊明文
单位：湖北医科大学口腔医学院，湖北 武汉 430079
关键词：牙胚；体外培养；维甲酸；形态发生
牙体牙髓牙周病学杂志990201 摘要 目的：探讨维甲酸对体外鼠磨牙牙胚冠部形态发生的影响。方法：采用RPMI 1640半固态培养基，根据成分不同，培养基分为三组：含枸橼醛的培养基、含枸橼醛和维甲酸的培养基以及空白对照。将16d胎龄的鼠胎下颌第一磨牙牙胚分别置于RPMI 1640无血清半固态培养基表面培养6d，每48h更换培养基1次。结果：在含枸橼醛的培养基和空白培养基，牙胚未形成正常的牙乳头尖，颈环上皮位置表浅；在含枸橼醛和维甲酸的培养基，牙胚形成正常的牙乳头尖，颈环上皮增殖明显。结论：维甲酸缺乏妨碍了牙胚冠部正常形态的发生。
中图号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)02-0093-03
, 百拇医药
[牙体牙髓牙周病学杂志，1999，9(2):93]
Effects of retinoic acid deficiency on mouse molar
crown morphogenesis in vitro
Han Jianguo, Gao Yuguang, Fan Mingwen
Faculty of Stomatology, Hubei Medical University, Wuhan 430079
Abstracts Aim:To evaluate the effects of retinoic acid on mouse molar crown morphogenesis. Methods:We used RPMI1640 serum-free semisolid culture medium in the expriments. According to the difference of components in culture medium, the experiments were divided into three groups:medium containing citral, medium containing citral and retinoic acid and control medium. We used 16-day old mouse embryos. The first mandibular molar germs were cultured for six days. The medium were changed every 48h. Results:In control medium and medium containing citral, the tooth germs didn't form normal cusps and the position of cervical loops of molar germs was similar to that of molar germs at the beginning culture. In the medium containing citral and retinoic acid, the tooth germs formed normal cusps and cervical loops obviously proliferated. Conclusions:The results demonstrated that retinoic acid deficiency impairs normal crown morphogenesis of mouse molar germs.
, 百拇医药
Key words dental germ； retinoic acid；culture；morphogenesis
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 1999,9(2):93]
维甲酸是维生素A在体内代谢的主要产物，是胚胎发育不可缺少的成分，与细胞增殖、分化以及组织形态发生有密切关系。牙齿发育异常是临床上常见的牙体疾病，与遗传、妊娠期间营养成分缺乏有关。本实验采用了小鼠磨牙牙胚体外培养模型，用枸橼醛阻断牙胚组织的内源性维甲酸合成，探讨维甲酸缺乏对牙胚冠部形态发生的影响。
1 材料和方法
本实验所用小鼠为湖北医学科学院提供的昆明小鼠。小鼠胎龄以交配后次日见到阴道栓的时间为0d。将胎龄为16d的昆明小鼠断颈处死，浸入750ml/L酒精中消毒15s。取胎鼠下颌骨，于解剖显微镜下分离下颌第一磨牙牙胚。所用培养基为RPMI?1640无血清半固态培养基，基本成分包括青霉素500U/L，链霉素50mg/L，维生素C 200mg/L，Hepes 20mmol/L，5g/L琼脂。根据培养基中枸橼醛(Sigma)和维甲酸(Sigma；全反式)的成分不同，将培养基分为3组：
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①单纯枸橼醛(1μmol/L)
②枸橼醛(1μmol/L)+维甲酸(5×10-7mol/L)
③空白
培养基制备：用乙醇将维甲酸稀释至5×10-4mol/L；用蒸馏水将枸橼醛稀释至1mmol/L。在相应培养液中分别加入适量的1mmol/L枸橼醛和5×10-4mol/L维甲酸，并预热至40℃左右，再与45℃的30g/L琼脂(Sigma)混合均匀，使相应培养基中含1μmol/L枸橼醛和5×10-7mol/L维甲酸。向培养液中加入琼脂之前，单纯枸橼醛组和空白组均加入相应体积的乙醇，使三组培养基中乙醇含量相同。
培养方法和标本制作：将分离的牙胚分别置于不同的培养基表面，于37℃、含50ml/L CO2恒温恒湿培养箱中培养2d后，更换无枸橼醛的培养基，培养基中其它成分不变，每48h更换培养基1次，共培养6d。培养结束后分别将牙胚置于Bourn's固定液中固定8h，PBS洗30min，再用含少量饱和碳酸锂溶液的700ml/L酒精洗涤，直至牙胚的黄颜色全部褪去。常规脱水，石蜡包埋。制5μm厚度连续切片，苏木素染色，显微镜观察。
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2 结果
16d胎龄的鼠胎下颌第一磨牙牙胚处于帽状期晚期，成釉器分为三层：内釉上皮层、星网状层和外釉上皮层，颈环位置表浅，无明显的牙乳头尖形成(图1)。
图1 16d胎龄的鼠胎下颌第一磨牙牙胚培养开始前处于帽状期，内釉上皮与外釉上皮交汇形成颈环(l) (e:成釉器；p:牙乳头)
培养6d后，在含有相同成分的培养基上，牙胚形态相似；在含有不同成分的培养基上，牙胚形态均有明显差异。与培养开始之前相比，牙胚在空白培养基上形成明显的牙乳头尖，但颈环上皮的位置与培养前相比无明显变化(图2)。在含枸橼醛的培养基上，培养6d后牙胚虽有牙乳头尖形成，但不如空白组牙胚的牙乳头尖显著；颈环上皮的位置和空白组相似，与培养前相比无明显变化(图3)。在含枸橼醛和维甲酸的培养基上，牙胚培养6d后不仅形成高耸的牙乳头尖，颈环上皮也明显增殖，牙胚由帽状期发育至钟状期(图4)。
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图2 培养6d后，在空白对照培养基上形成明显的牙乳头尖(↑所示)，但颈环上皮的位置与培养前比无明显变化 (e:成釉器)
图3 培养6d后，在含枸橼醛的培养基上牙胚虽有牙乳头尖(↑所示)形成，但形态不明显；颈环上皮的位置与培养前相似
(e：成釉器)
图4 培养6d后，在含枸橼醛和维甲酸的培养基上，牙胚不仅形成明显的牙乳头尖(↑所示)，颈环上皮也明显增殖，牙胚发育至钟状期 (e：成釉器 p:牙乳头)
3 讨论
维甲酸是维生素A在体内代谢后具有多方面生物学活性的终产物，可调节细胞的增殖、分化以及器官形态发生等。维甲酸的这些生物学作用与维甲酸的剂量、作用时间和胚胎发育阶段有密切关系[1]。
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牙齿发育过程主要包括三个方面：牙胚形态的发生、成牙本质细胞和成釉细胞的分化以及牙齿硬组织的矿化。鼠磨牙牙胚体外培养是研究牙胚形态发生和细胞分化的良好模型。我们的研究结果表明，维甲酸是牙胚发育必须的成分之一，维甲酸缺乏，导致牙胚冠部形态发生异常。以往的研究显示，枸橼醛能够阻断组织内部维甲酸的合成[2]，这一结论与我们的实验结果相符合。当培养基中加入枸橼醛时，牙胚牙乳头尖的形成明显被抑制，牙胚形态仍停留在帽状期。当培养基中同时加入枸橼醛和维甲酸时，牙胚不仅形成明显的牙乳头尖，颈环上皮也明显增殖，牙胚由帽状发育至钟状期。
牙胚内釉上皮的增殖和冠部形态的发生受牙乳头控制，并由基底膜介导[3]。维甲酸缺乏不仅影响牙胚冠部形态的发生，还可导致不规则牙本质的形成和成釉细胞萎缩[4]。关于维甲酸缺乏影响牙胚发育的分子机制仍不清楚。有研究表明维甲酸缺乏能够妨碍基底膜中层粘连蛋白的合成[5]，维甲酸缺乏还可影响体外培养的软骨细胞表达胶原[6]以及小鼠的上皮细胞表达转化生长因子-β[7]，此外，维甲酸在体外还可与转化生长因子-β相互作用调节细胞的增殖和分化[8]。免疫组化和原位杂交显示牙胚组织细胞的细胞核中存在维甲酸受体RAR(α，β，γ)和RXR(α，β，γ)[9]，它们能够与细胞核中的特异DNA序列相互作用调控靶基因的表达[10]。总之，维甲酸调控牙胚发育分子机制尚需进一步探讨。
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参考文献
1 Mark MP, Lohnes D, Mendelsohn C et al. Role of retinoic acid receptors and of Hox genes in the patterning of the teeth and of the jaw skeleton. Int J Dev Biol, 1995,39:111
2 Kronmiller JE, Beeman CS, Nguyen T et al. Blockade of the initiation of murine odontogenesis in vitro by citral, an inhibitor of endogenous retinoic acid synthesis. Archs Oral Biol, 1995,40:645
3 Oliver M, Ruch JV. Does the basement membrane control the mitotic activity of the inner dental epithelium of the embryonic mouse first lower molars. Dev Biol, 1982,93:310
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4 Mcdowell EM, Snores Rl, Spangler EF. Anomalous growth of rat incisor teeth during chronic intermittent vitamin A deficiency. J Nutr,1987,17:1265
5 Bloch-Zupan A, Mark MP, Weber B et al. In vitro effects of retinoic acid on mouse incisor development. Archs Oral Biol, 1994,39:891
6 Oettinger HF, Pacifici M. Type X collagen gene expression is transitly up-regulated by retinoic acid treatment in chick chondrocyte culture. Exp Cell Res, 1990,191:292
, http://www.100md.com
7 Glick AB, Flanders KC, Danielpour D et al. Retinoic acid induces transforming growth factor-β 2 in cultured keratinocytes and mouse epidermis. Cell Regul, 1989,1:87
8 Sporn MB, Roberts AB. Interactions of retinoids and transforming growth factor- β in regulation of cell differentiation and proliferation. Mol Endocrinol, 1991,5:3
9 Bloch-Zupan A, Decimo D, Loriot M et al. Expression of nuclear retinoic acid receptors during mouse odontogenesis. Differentiation, 1994,7:195
10 Leid M, Kastner P, Chambon P et al. Role of retinoic acid receptors and of Hox genes in the patterning of the teeth and of the jaw skeleton. Int J Dev Biol, 1995,39:111
收稿日期：1998-10-14, 百拇医药
单位：湖北医科大学口腔医学院，湖北 武汉 430079
关键词：牙胚；体外培养；维甲酸；形态发生
牙体牙髓牙周病学杂志990201 摘要 目的：探讨维甲酸对体外鼠磨牙牙胚冠部形态发生的影响。方法：采用RPMI 1640半固态培养基，根据成分不同，培养基分为三组：含枸橼醛的培养基、含枸橼醛和维甲酸的培养基以及空白对照。将16d胎龄的鼠胎下颌第一磨牙牙胚分别置于RPMI 1640无血清半固态培养基表面培养6d，每48h更换培养基1次。结果：在含枸橼醛的培养基和空白培养基，牙胚未形成正常的牙乳头尖，颈环上皮位置表浅；在含枸橼醛和维甲酸的培养基，牙胚形成正常的牙乳头尖，颈环上皮增殖明显。结论：维甲酸缺乏妨碍了牙胚冠部正常形态的发生。
中图号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)02-0093-03
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[牙体牙髓牙周病学杂志，1999，9(2):93]
Effects of retinoic acid deficiency on mouse molar
crown morphogenesis in vitro
Han Jianguo, Gao Yuguang, Fan Mingwen
Faculty of Stomatology, Hubei Medical University, Wuhan 430079
Abstracts Aim:To evaluate the effects of retinoic acid on mouse molar crown morphogenesis. Methods:We used RPMI1640 serum-free semisolid culture medium in the expriments. According to the difference of components in culture medium, the experiments were divided into three groups:medium containing citral, medium containing citral and retinoic acid and control medium. We used 16-day old mouse embryos. The first mandibular molar germs were cultured for six days. The medium were changed every 48h. Results:In control medium and medium containing citral, the tooth germs didn't form normal cusps and the position of cervical loops of molar germs was similar to that of molar germs at the beginning culture. In the medium containing citral and retinoic acid, the tooth germs formed normal cusps and cervical loops obviously proliferated. Conclusions:The results demonstrated that retinoic acid deficiency impairs normal crown morphogenesis of mouse molar germs.
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Key words dental germ； retinoic acid；culture；morphogenesis
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 1999,9(2):93]
维甲酸是维生素A在体内代谢的主要产物，是胚胎发育不可缺少的成分，与细胞增殖、分化以及组织形态发生有密切关系。牙齿发育异常是临床上常见的牙体疾病，与遗传、妊娠期间营养成分缺乏有关。本实验采用了小鼠磨牙牙胚体外培养模型，用枸橼醛阻断牙胚组织的内源性维甲酸合成，探讨维甲酸缺乏对牙胚冠部形态发生的影响。
1 材料和方法
本实验所用小鼠为湖北医学科学院提供的昆明小鼠。小鼠胎龄以交配后次日见到阴道栓的时间为0d。将胎龄为16d的昆明小鼠断颈处死，浸入750ml/L酒精中消毒15s。取胎鼠下颌骨，于解剖显微镜下分离下颌第一磨牙牙胚。所用培养基为RPMI?1640无血清半固态培养基，基本成分包括青霉素500U/L，链霉素50mg/L，维生素C 200mg/L，Hepes 20mmol/L，5g/L琼脂。根据培养基中枸橼醛(Sigma)和维甲酸(Sigma；全反式)的成分不同，将培养基分为3组：
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①单纯枸橼醛(1μmol/L)
②枸橼醛(1μmol/L)+维甲酸(5×10-7mol/L)
③空白
培养基制备：用乙醇将维甲酸稀释至5×10-4mol/L；用蒸馏水将枸橼醛稀释至1mmol/L。在相应培养液中分别加入适量的1mmol/L枸橼醛和5×10-4mol/L维甲酸，并预热至40℃左右，再与45℃的30g/L琼脂(Sigma)混合均匀，使相应培养基中含1μmol/L枸橼醛和5×10-7mol/L维甲酸。向培养液中加入琼脂之前，单纯枸橼醛组和空白组均加入相应体积的乙醇，使三组培养基中乙醇含量相同。
培养方法和标本制作：将分离的牙胚分别置于不同的培养基表面，于37℃、含50ml/L CO2恒温恒湿培养箱中培养2d后，更换无枸橼醛的培养基，培养基中其它成分不变，每48h更换培养基1次，共培养6d。培养结束后分别将牙胚置于Bourn's固定液中固定8h，PBS洗30min，再用含少量饱和碳酸锂溶液的700ml/L酒精洗涤，直至牙胚的黄颜色全部褪去。常规脱水，石蜡包埋。制5μm厚度连续切片，苏木素染色，显微镜观察。
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2 结果
16d胎龄的鼠胎下颌第一磨牙牙胚处于帽状期晚期，成釉器分为三层：内釉上皮层、星网状层和外釉上皮层，颈环位置表浅，无明显的牙乳头尖形成(图1)。
图1 16d胎龄的鼠胎下颌第一磨牙牙胚培养开始前处于帽状期，内釉上皮与外釉上皮交汇形成颈环(l) (e:成釉器；p:牙乳头)
培养6d后，在含有相同成分的培养基上，牙胚形态相似；在含有不同成分的培养基上，牙胚形态均有明显差异。与培养开始之前相比，牙胚在空白培养基上形成明显的牙乳头尖，但颈环上皮的位置与培养前相比无明显变化(图2)。在含枸橼醛的培养基上，培养6d后牙胚虽有牙乳头尖形成，但不如空白组牙胚的牙乳头尖显著；颈环上皮的位置和空白组相似，与培养前相比无明显变化(图3)。在含枸橼醛和维甲酸的培养基上，牙胚培养6d后不仅形成高耸的牙乳头尖，颈环上皮也明显增殖，牙胚由帽状期发育至钟状期(图4)。
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图2 培养6d后，在空白对照培养基上形成明显的牙乳头尖(↑所示)，但颈环上皮的位置与培养前比无明显变化 (e:成釉器)
图3 培养6d后，在含枸橼醛的培养基上牙胚虽有牙乳头尖(↑所示)形成，但形态不明显；颈环上皮的位置与培养前相似
(e：成釉器)
图4 培养6d后，在含枸橼醛和维甲酸的培养基上，牙胚不仅形成明显的牙乳头尖(↑所示)，颈环上皮也明显增殖，牙胚发育至钟状期 (e：成釉器 p:牙乳头)
3 讨论
维甲酸是维生素A在体内代谢后具有多方面生物学活性的终产物，可调节细胞的增殖、分化以及器官形态发生等。维甲酸的这些生物学作用与维甲酸的剂量、作用时间和胚胎发育阶段有密切关系[1]。
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牙齿发育过程主要包括三个方面：牙胚形态的发生、成牙本质细胞和成釉细胞的分化以及牙齿硬组织的矿化。鼠磨牙牙胚体外培养是研究牙胚形态发生和细胞分化的良好模型。我们的研究结果表明，维甲酸是牙胚发育必须的成分之一，维甲酸缺乏，导致牙胚冠部形态发生异常。以往的研究显示，枸橼醛能够阻断组织内部维甲酸的合成[2]，这一结论与我们的实验结果相符合。当培养基中加入枸橼醛时，牙胚牙乳头尖的形成明显被抑制，牙胚形态仍停留在帽状期。当培养基中同时加入枸橼醛和维甲酸时，牙胚不仅形成明显的牙乳头尖，颈环上皮也明显增殖，牙胚由帽状发育至钟状期。
牙胚内釉上皮的增殖和冠部形态的发生受牙乳头控制，并由基底膜介导[3]。维甲酸缺乏不仅影响牙胚冠部形态的发生，还可导致不规则牙本质的形成和成釉细胞萎缩[4]。关于维甲酸缺乏影响牙胚发育的分子机制仍不清楚。有研究表明维甲酸缺乏能够妨碍基底膜中层粘连蛋白的合成[5]，维甲酸缺乏还可影响体外培养的软骨细胞表达胶原[6]以及小鼠的上皮细胞表达转化生长因子-β[7]，此外，维甲酸在体外还可与转化生长因子-β相互作用调节细胞的增殖和分化[8]。免疫组化和原位杂交显示牙胚组织细胞的细胞核中存在维甲酸受体RAR(α，β，γ)和RXR(α，β，γ)[9]，它们能够与细胞核中的特异DNA序列相互作用调控靶基因的表达[10]。总之，维甲酸调控牙胚发育分子机制尚需进一步探讨。
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参考文献
1 Mark MP, Lohnes D, Mendelsohn C et al. Role of retinoic acid receptors and of Hox genes in the patterning of the teeth and of the jaw skeleton. Int J Dev Biol, 1995,39:111
2 Kronmiller JE, Beeman CS, Nguyen T et al. Blockade of the initiation of murine odontogenesis in vitro by citral, an inhibitor of endogenous retinoic acid synthesis. Archs Oral Biol, 1995,40:645
3 Oliver M, Ruch JV. Does the basement membrane control the mitotic activity of the inner dental epithelium of the embryonic mouse first lower molars. Dev Biol, 1982,93:310
, http://www.100md.com
4 Mcdowell EM, Snores Rl, Spangler EF. Anomalous growth of rat incisor teeth during chronic intermittent vitamin A deficiency. J Nutr,1987,17:1265
5 Bloch-Zupan A, Mark MP, Weber B et al. In vitro effects of retinoic acid on mouse incisor development. Archs Oral Biol, 1994,39:891
6 Oettinger HF, Pacifici M. Type X collagen gene expression is transitly up-regulated by retinoic acid treatment in chick chondrocyte culture. Exp Cell Res, 1990,191:292
, http://www.100md.com
7 Glick AB, Flanders KC, Danielpour D et al. Retinoic acid induces transforming growth factor-β 2 in cultured keratinocytes and mouse epidermis. Cell Regul, 1989,1:87
8 Sporn MB, Roberts AB. Interactions of retinoids and transforming growth factor- β in regulation of cell differentiation and proliferation. Mol Endocrinol, 1991,5:3
9 Bloch-Zupan A, Decimo D, Loriot M et al. Expression of nuclear retinoic acid receptors during mouse odontogenesis. Differentiation, 1994,7:195
10 Leid M, Kastner P, Chambon P et al. Role of retinoic acid receptors and of Hox genes in the patterning of the teeth and of the jaw skeleton. Int J Dev Biol, 1995,39:111
收稿日期：1998-10-14, 百拇医药