硫代反义寡聚核苷酸对HSV的作用及对小鼠HSV角膜炎发病的影响**
作者：刘宏伟* 周 毅* 彭淑玲* 王香兰*
单位：
*北京市眼科研究所，100730；**北京市卫生局资助课题，本文曾获卫生部国际交流中心日本参天制药眼科医生奖
关键词：硫代核苷酸类；疱疹病毒；人；角膜炎
硫代反义寡聚核苷酸对HSV的作用及对小鼠HSV 角膜炎发病的影响 摘 要 为了观察硫代反义寡聚核苷酸对单纯疱疹病毒(HSV)毒力和小鼠实验性HSV角膜炎发病的影响，培养细胞中加入滴度为102 TCID50的HSV和100、50、25、12.5μg/ml的反义寡聚核苷酸，培养3天，将对照病毒和与100、25μg/ml药物作用的病毒稀释至10-3，做空斑实验。将对照病毒和与50、12.5μg/ml药物作用的病毒稀释至10-2，种植于小鼠角膜，观察角膜上皮和实质病变。病毒对照组的空斑数为26.5个，100和25μg/ml药物组分别为7.5和6.0个，两药物组的空斑数极显著少于对照组，其空斑抑制率分别为71.7%和75.5%。小鼠角膜上皮病变，在第3和第8天，两药物组显著轻于对照组，角膜实质病变三组间无显著性差异。硫代反义寡聚核苷酸可使HSV的毒力下降，使病毒对小鼠角膜的感染力降低。
, http://www.100md.com
分类号 R772.21
Effect of phosphorothioate antisense oligonucleotide on HSV and mice HSV keratitis/Liu Hongwei…//Ophthalmol CHN.-1998，7(1).-54～56(Department of Pharmacology，Beijing Institute of Ophthalmology，Beijing 100730)
To observe the effect of phosphorothiate antisense oligonucleotide on HSV activity and mice HSV kera-titis，102TCID50virus and 100，50，25，12.5μg/ml oligonucleotide were added in cell culture plates.The cells were cultured for 3 days.The control virus and virus co-cultured with 100，25μg/ml drugs were diluted to 10-3and plaque assay was done.The control virus and virus co-cultured with 50，12.5μg/ml drugs were diluted to 10-2and planted in the mice cornea.The corneal epithialial and stroma lesion was observed.The plaque number of the control group was 26.5 and those of 100，25μg/ml drug groups were 7.5 and 6.0 respectively.The plaque number of each of drug group was very significantly less than that of the control group.Their inhibitive efficiency was 77.7% and 75.5% respectively.Mice corneal epithialial lesion of two drug groups was significantly less than that of the control group in the 3rd and 8th day.There were no significant diferences among the three groups in corneal stroma lesion.So we draw a conclusion that phosphorothiate antisense oligonucleotide may decrease HSV activity and lighten mice corneal infective degree to HSV.
, 百拇医药
Subject terms Keratitis；Nucleotides；Herpes；Virus hominis
反义寡聚核苷酸已被证明是基因表达的特异性抑制剂，它可抑制包括HSV在内的多种病毒的复制，但有关与反义寡聚核苷酸作用后HSV毒力的研究未见报道，本实验用与UL48基因mRNA互补的硫代反义寡聚核苷酸与HSV作用，观察其对病毒活力和小鼠病毒性角膜炎发病的影响。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 培养液 胎牛血清，MEM培养基(Gibco/BRL)，L-谷氨酰胺。
1.1.2 细胞 Vero细胞购自中国预防医学科学院生物技术研究所，用含10%的胎牛血清培养基培养。
, 百拇医药
1.1.3 病毒 HSV-1的KOS株病毒由本室保存，经测定TCID50为10-7。多聚酶链反应(PCR)检测为HSV-1病毒。
1.1.4 硫代反义寡聚核苷酸的合成 与UL48基因mRNA互补的18bp寡聚核苷酸由赛百盛公司合成，其序列为5-GTC CGC GTC CAT GTC GGC-3，在1-2和17-18处以硫取代磷氧键中的氧成为硫代寡聚核苷酸。
1.1.5 动物 Balb/c小鼠购自中国药品生物制品检定所动物中心，体重为20克，均为雌性。
1.2 实验方法
1.2.1 空斑实验 96孔培养板长成单层细胞后，加入102的TCID50病毒和100、50、25、12.5μg/ml的硫代反义寡聚核苷酸，另设病毒对照，继续培养3天。24孔培养板长成单层细胞后，将与100和25μg/ml药物作用的病毒和对照病毒稀释至10-3，分别加入小板内，吸附一小时，倒掉病毒液，加入空斑上层液(含甲基纤维素等物质)，72小时后，用结晶紫染色，数空斑。
, 百拇医药
1.2.2 小鼠HSV角膜炎的造型 实验前检查30只小鼠双眼无病变，用1ml的注射器针头在小鼠的右角膜上划“井”字，然后分为三组，每组10只小鼠，将对照病毒和与50和12.5μg/ml药物作用的病毒稀释至10-2，每眼分别滴加5μl，轻揉30秒。
1.2.3 小鼠角膜病变的观察 用裂隙灯显微镜观察种毒后第2、3、4、6、8和11天的角膜上皮和实质病变。按病变程度划分度数[1]。
1.3 统计学处理 使用SYSTAT软件包中的单因素方差分析。
2 结果
2.1 空斑实验
病毒对照组的空斑数为26.5±8.0个，100和25μg/ml药物组分别为7.5±1.7和6.0±2.7个，两药物组与对照组间有极显著性差异(P<0.01)，两药物组间无显著性差异(见附图)。两者的空斑抑制率分别为71.7%和75.5%。
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附图 空斑实验结果
A 正常对照 B 病毒对照 C 反义寡聚
核苷酸(25μg/ml) D 反义寡聚核苷酸(100μg/ml)
表1 小鼠角膜上皮病变(n＝10)
时间(天)
病毒对照组
12.5μg/ml组
50μg/ml组
2
3
4
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6
8
11
0.50±0.33
0.65±0.42
0.85±0.67
1.05±0.90
0.85±0.67
0.25±0.35
0.40±0.21
0.30±0.26
0.50±0.41
, 百拇医药
0.50±0.47
0.30±0.42
0.20±0.26
0.30±0.26
0.35±0.24
0.40±0.36
0.55±0.28
0.40±0.21
0.25±0.26
*p<0.05 表2 小鼠角膜实质病变(n＝10)
时间(天)
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病毒对照组
12.5μg/ml组
50μg/ml组
2
3
4
6
8
11
0.15±0.24
0.25±0.35
0.45±0.37
0.50±0.24
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0.45±0.37
0.25±0.26
0.15±0.24
0.15±0.24
0.35±0.34
0.40±0.21
0.40±0.32
0.15±0.24
0.20±0.35
0.15±0.34
0.45±0.28
0.45±0.37
, 百拇医药
0.40±0.32
0.20±0.26
2.2 小鼠实验性HSV角膜炎
2.2.1 角膜上皮病变 三组小鼠种毒后第2天发病，第3、8天，两药物组的病变显著轻于对照组(P<0.05)，两药物组间无显著性差异(表1)。
2.2.2 角膜实质病变 三组间无显著性差异(表2)。
3 讨论
基因表达的调控可通过核酸之间的相互作用来实现，能够与mRNA互补、选择性阻断mRNA翻译的寡聚核苷酸称为反义寡聚核苷酸。反义寡聚核苷酸与靶核酸互补结合具有高度特异性和亲和力，因此对生物体的正常功能影响较小。寡聚核苷酸在生理环境中易被DNA酶降解，用硫修饰可提高其稳定性[2]。本实验的寡聚核苷酸是用硫修饰了链的两端，而中间部分未修饰，这样有利于它与靶链的更好结合。
, 百拇医药
主要体被蛋白(Vmw65)由HSV-1的UL48基因编码，它是一种490个氨基酸的蛋白质，可激活HSV的极早期基因(α基因)的表达，α基因又激活β、γ基因的表达，使病毒开始复制。据报道[3，4]，UL48基因mRNA的反义寡聚核苷酸可抑制Vmw65蛋白的合成和HSV的复制。
我们用与100μg/ml和25μg/ml反义寡聚核苷酸作用的HSV做空斑实验，抑制率在70%左右，与文献报道相近[4]。
用与反义寡聚核苷酸作用的HSV种植于小鼠的角膜上，造成HSV角膜炎。结果发现，与对照病毒相比，药物组的角膜上皮病变程度减轻。原因可能是反义寡聚核苷酸与HSV作用，降低了病毒的毒力，使病毒感染角膜的能力下降。文献报道，极早期基因IE4、5mRNA的反义寡聚核苷酸[5、6]、UL13mRNA[7]及DNA聚合酶mRNA的反义寡聚核苷酸[8]对实验性HSV角膜炎都有一定的预防或治疗作用。本实验两种不同浓度的反义寡聚核苷酸在空斑实验和对小鼠角膜炎发病的影响方面作用相近。有文献报道，寡聚核苷酸的作用在低浓度时有量效关系，但达一定浓度，药物的作用不会再增加[3]。
, 百拇医药
从本实验的结果可看出，与硫代反义寡聚核苷酸作用的HSV的毒力下降，对小鼠角膜的感染力减弱。
4 参考文献
1 刘宏伟，彭淑玲，周毅，等.免疫调节剂对小鼠实验性单纯疱疹性角膜炎发病的影响.眼科，1993；2：41
2 Hoke GD，Draper K，Freier SM，et al.Effects of phosphorothioate capping on antisense oligonucleotide stability，hybridization and antiviral efficacy versus herpes simplex virus infection.Nucleic Acids Res，1991；19：5743
3 Draper K，Ceruzzi M，Kmetz ME，et al.Complementary oligonucleotide sequence inhibits both Vmw65 gene expression and replication of herpes simplex virus.Antiviral Res，1990；13：151
, http://www.100md.com
4 Kmetz ME，Ceruzzi M，Schwartz J.Vmw65 phosphorothioate oligonucleotides inhibit HSV KOS replication and Vmw65 protein synthesis.Antiviral Res，1991；16：173
5 Metcalf JF，Cosper CS，Rich LS，et al.A synthetic antisense oligonucleotide analogue prevents herpetic stromal keratitis in CF-1 mice.Invest Ophthalmol Vis Sci(ARVO)，1991；32：806
6 Wakamatsu Y，lwatani W，Miyanaga Y.Efficacy of antisense phosphorothionate oligonucleotide in experimental rabbit HSV-1 keratitis.Invest Ophthalmol Vis Sci(ARVO)，1996；37：s48
, 百拇医药
7 Brandt CR，Coakley LM，Grau DR，et al.Antisense oligonucleotide to the HSV-1 UL-13 gene is effective against herpetic keratitis.Invest Ophthalmol Vis Sci(ARVO)，1991；32：854
8 Kimura T，Hotta Y，Sado K，et al.Phosphorothioate oligodeoxynucleotides as a potent antiviral agent in herpetic keratitis：preliminary animal study.Invest Ophthalmol Vis Sci(ARVO)，1991；32：806
(1997-04-23收稿), 百拇医药
单位：
*北京市眼科研究所，100730；**北京市卫生局资助课题，本文曾获卫生部国际交流中心日本参天制药眼科医生奖
关键词：硫代核苷酸类；疱疹病毒；人；角膜炎
硫代反义寡聚核苷酸对HSV的作用及对小鼠HSV 角膜炎发病的影响 摘 要 为了观察硫代反义寡聚核苷酸对单纯疱疹病毒(HSV)毒力和小鼠实验性HSV角膜炎发病的影响，培养细胞中加入滴度为102 TCID50的HSV和100、50、25、12.5μg/ml的反义寡聚核苷酸，培养3天，将对照病毒和与100、25μg/ml药物作用的病毒稀释至10-3，做空斑实验。将对照病毒和与50、12.5μg/ml药物作用的病毒稀释至10-2，种植于小鼠角膜，观察角膜上皮和实质病变。病毒对照组的空斑数为26.5个，100和25μg/ml药物组分别为7.5和6.0个，两药物组的空斑数极显著少于对照组，其空斑抑制率分别为71.7%和75.5%。小鼠角膜上皮病变，在第3和第8天，两药物组显著轻于对照组，角膜实质病变三组间无显著性差异。硫代反义寡聚核苷酸可使HSV的毒力下降，使病毒对小鼠角膜的感染力降低。
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分类号 R772.21
Effect of phosphorothioate antisense oligonucleotide on HSV and mice HSV keratitis/Liu Hongwei…//Ophthalmol CHN.-1998，7(1).-54～56(Department of Pharmacology，Beijing Institute of Ophthalmology，Beijing 100730)
To observe the effect of phosphorothiate antisense oligonucleotide on HSV activity and mice HSV kera-titis，102TCID50virus and 100，50，25，12.5μg/ml oligonucleotide were added in cell culture plates.The cells were cultured for 3 days.The control virus and virus co-cultured with 100，25μg/ml drugs were diluted to 10-3and plaque assay was done.The control virus and virus co-cultured with 50，12.5μg/ml drugs were diluted to 10-2and planted in the mice cornea.The corneal epithialial and stroma lesion was observed.The plaque number of the control group was 26.5 and those of 100，25μg/ml drug groups were 7.5 and 6.0 respectively.The plaque number of each of drug group was very significantly less than that of the control group.Their inhibitive efficiency was 77.7% and 75.5% respectively.Mice corneal epithialial lesion of two drug groups was significantly less than that of the control group in the 3rd and 8th day.There were no significant diferences among the three groups in corneal stroma lesion.So we draw a conclusion that phosphorothiate antisense oligonucleotide may decrease HSV activity and lighten mice corneal infective degree to HSV.
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Subject terms Keratitis；Nucleotides；Herpes；Virus hominis
反义寡聚核苷酸已被证明是基因表达的特异性抑制剂，它可抑制包括HSV在内的多种病毒的复制，但有关与反义寡聚核苷酸作用后HSV毒力的研究未见报道，本实验用与UL48基因mRNA互补的硫代反义寡聚核苷酸与HSV作用，观察其对病毒活力和小鼠病毒性角膜炎发病的影响。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 培养液 胎牛血清，MEM培养基(Gibco/BRL)，L-谷氨酰胺。
1.1.2 细胞 Vero细胞购自中国预防医学科学院生物技术研究所，用含10%的胎牛血清培养基培养。
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1.1.3 病毒 HSV-1的KOS株病毒由本室保存，经测定TCID50为10-7。多聚酶链反应(PCR)检测为HSV-1病毒。
1.1.4 硫代反义寡聚核苷酸的合成 与UL48基因mRNA互补的18bp寡聚核苷酸由赛百盛公司合成，其序列为5-GTC CGC GTC CAT GTC GGC-3，在1-2和17-18处以硫取代磷氧键中的氧成为硫代寡聚核苷酸。
1.1.5 动物 Balb/c小鼠购自中国药品生物制品检定所动物中心，体重为20克，均为雌性。
1.2 实验方法
1.2.1 空斑实验 96孔培养板长成单层细胞后，加入102的TCID50病毒和100、50、25、12.5μg/ml的硫代反义寡聚核苷酸，另设病毒对照，继续培养3天。24孔培养板长成单层细胞后，将与100和25μg/ml药物作用的病毒和对照病毒稀释至10-3，分别加入小板内，吸附一小时，倒掉病毒液，加入空斑上层液(含甲基纤维素等物质)，72小时后，用结晶紫染色，数空斑。
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1.2.2 小鼠HSV角膜炎的造型 实验前检查30只小鼠双眼无病变，用1ml的注射器针头在小鼠的右角膜上划“井”字，然后分为三组，每组10只小鼠，将对照病毒和与50和12.5μg/ml药物作用的病毒稀释至10-2，每眼分别滴加5μl，轻揉30秒。
1.2.3 小鼠角膜病变的观察 用裂隙灯显微镜观察种毒后第2、3、4、6、8和11天的角膜上皮和实质病变。按病变程度划分度数[1]。
1.3 统计学处理 使用SYSTAT软件包中的单因素方差分析。
2 结果
2.1 空斑实验
病毒对照组的空斑数为26.5±8.0个，100和25μg/ml药物组分别为7.5±1.7和6.0±2.7个，两药物组与对照组间有极显著性差异(P<0.01)，两药物组间无显著性差异(见附图)。两者的空斑抑制率分别为71.7%和75.5%。
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附图 空斑实验结果
A 正常对照 B 病毒对照 C 反义寡聚
核苷酸(25μg/ml) D 反义寡聚核苷酸(100μg/ml)
表1 小鼠角膜上皮病变(n＝10)
时间(天)
病毒对照组
12.5μg/ml组
50μg/ml组
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*p<0.05 表2 小鼠角膜实质病变(n＝10)
时间(天)
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病毒对照组
12.5μg/ml组
50μg/ml组
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2.2 小鼠实验性HSV角膜炎
2.2.1 角膜上皮病变 三组小鼠种毒后第2天发病，第3、8天，两药物组的病变显著轻于对照组(P<0.05)，两药物组间无显著性差异(表1)。
2.2.2 角膜实质病变 三组间无显著性差异(表2)。
3 讨论
基因表达的调控可通过核酸之间的相互作用来实现，能够与mRNA互补、选择性阻断mRNA翻译的寡聚核苷酸称为反义寡聚核苷酸。反义寡聚核苷酸与靶核酸互补结合具有高度特异性和亲和力，因此对生物体的正常功能影响较小。寡聚核苷酸在生理环境中易被DNA酶降解，用硫修饰可提高其稳定性[2]。本实验的寡聚核苷酸是用硫修饰了链的两端，而中间部分未修饰，这样有利于它与靶链的更好结合。
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主要体被蛋白(Vmw65)由HSV-1的UL48基因编码，它是一种490个氨基酸的蛋白质，可激活HSV的极早期基因(α基因)的表达，α基因又激活β、γ基因的表达，使病毒开始复制。据报道[3，4]，UL48基因mRNA的反义寡聚核苷酸可抑制Vmw65蛋白的合成和HSV的复制。
我们用与100μg/ml和25μg/ml反义寡聚核苷酸作用的HSV做空斑实验，抑制率在70%左右，与文献报道相近[4]。
用与反义寡聚核苷酸作用的HSV种植于小鼠的角膜上，造成HSV角膜炎。结果发现，与对照病毒相比，药物组的角膜上皮病变程度减轻。原因可能是反义寡聚核苷酸与HSV作用，降低了病毒的毒力，使病毒感染角膜的能力下降。文献报道，极早期基因IE4、5mRNA的反义寡聚核苷酸[5、6]、UL13mRNA[7]及DNA聚合酶mRNA的反义寡聚核苷酸[8]对实验性HSV角膜炎都有一定的预防或治疗作用。本实验两种不同浓度的反义寡聚核苷酸在空斑实验和对小鼠角膜炎发病的影响方面作用相近。有文献报道，寡聚核苷酸的作用在低浓度时有量效关系，但达一定浓度，药物的作用不会再增加[3]。
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从本实验的结果可看出，与硫代反义寡聚核苷酸作用的HSV的毒力下降，对小鼠角膜的感染力减弱。
4 参考文献
1 刘宏伟，彭淑玲，周毅，等.免疫调节剂对小鼠实验性单纯疱疹性角膜炎发病的影响.眼科，1993；2：41
2 Hoke GD，Draper K，Freier SM，et al.Effects of phosphorothioate capping on antisense oligonucleotide stability，hybridization and antiviral efficacy versus herpes simplex virus infection.Nucleic Acids Res，1991；19：5743
3 Draper K，Ceruzzi M，Kmetz ME，et al.Complementary oligonucleotide sequence inhibits both Vmw65 gene expression and replication of herpes simplex virus.Antiviral Res，1990；13：151
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4 Kmetz ME，Ceruzzi M，Schwartz J.Vmw65 phosphorothioate oligonucleotides inhibit HSV KOS replication and Vmw65 protein synthesis.Antiviral Res，1991；16：173
5 Metcalf JF，Cosper CS，Rich LS，et al.A synthetic antisense oligonucleotide analogue prevents herpetic stromal keratitis in CF-1 mice.Invest Ophthalmol Vis Sci(ARVO)，1991；32：806
6 Wakamatsu Y，lwatani W，Miyanaga Y.Efficacy of antisense phosphorothionate oligonucleotide in experimental rabbit HSV-1 keratitis.Invest Ophthalmol Vis Sci(ARVO)，1996；37：s48
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7 Brandt CR，Coakley LM，Grau DR，et al.Antisense oligonucleotide to the HSV-1 UL-13 gene is effective against herpetic keratitis.Invest Ophthalmol Vis Sci(ARVO)，1991；32：854
8 Kimura T，Hotta Y，Sado K，et al.Phosphorothioate oligodeoxynucleotides as a potent antiviral agent in herpetic keratitis：preliminary animal study.Invest Ophthalmol Vis Sci(ARVO)，1991；32：806
(1997-04-23收稿), 百拇医药