无环鸟苷和单克隆抗体治疗实验性单疱病毒性角膜炎
作者：刘卫华* 王香兰* 彭淑玲*
单位：*北京市眼科研究所，100730
关键词：角膜炎；单纯疱疹病毒；无环鸟苷/治疗应用；抗体；单克隆/治疗应用
眼科980117 摘 要 以BALB/c小鼠HSK为动物模型，应用无环鸟苷(ACV)和单克隆抗体(McAb)在接种病毒后不同时间开始点眼治疗，观察对角膜炎的疗效。各治疗组与对照组相比均有显著疗效。接种病毒后同一时间开始治疗(1小时或24小时)，ACV与McAb对角膜病变的疗效相似，1小时开始治疗组上皮病变明显轻于24小时开始治疗组。此外，ACV治疗组角膜新生血管减少。
分类号 R772.21
单疱病毒性角膜炎(HSK)是角膜病的首要致盲原因。本实验研究了在角膜接种HSV-1 KOS株后分别于1小时和24小时开始用无环鸟苷和5种单克隆抗体局部点眼治疗，观察对角膜炎的治疗作用。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1材料
1.1.1 病毒：单纯疱疹病毒Ⅰ型KOS株(来自中国预防医学科学院病毒所)。
1.1.2 细胞：原代乳兔肾细胞。
1.1.3 抗单疱病毒(HSV)单克隆抗体滴眼剂：购自第四军医大学，选用抗HSV糖蛋白gCMcAb2C5，2A8，1A12，Mad-2和抗gD McAb1D10株的腹水经纯化而得纯Ⅰ gG。
1.1.4 0.1%无环鸟苷滴眼剂：湖北潜江制药厂生产。
1.1.5 动物：BALB/c雌性小鼠，4～6周，购自中国医学科学院实验动物研究所繁育场。
, 百拇医药
1.1.6 检查仪器：Topcon SL-6E裂隙灯显微镜。
1.2 方法
1.2.1 HSV-1 KOS株的培养传代：乳兔肾皮质部原代细胞长成单层后，用HSV-1病毒接种，37℃培养，逐日观察细胞病变效应(CPE)，收集病毒悬液，-70℃冰箱冻存。
1.2.2 病毒滴定：将病毒悬液进行10倍稀释，加入在96孔培养板的单层乳兔肾细胞中，每个病毒稀释度接种4孔，加培养液作为阴性对照。置37℃ 5%CO2孵育5天，每天观察各孔的CPE，按病变细胞多少以“+”计算。计算组织培养半数感染剂量(TCID50)。
1.2.3 间接免疫荧光法检测McAb的效价：将HSV-1病毒感染细胞抗原片，滴加稀释的McAb，使抗原抗体结合。滴加1∶16稀释的荧光抗体(异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠IgG)，孵育、洗涤、干燥后，在荧光显微镜下观察。
, 百拇医药
1.2.4 建立感染模型和分组：小鼠用一周时间适应环境，用裂隙灯检查，排除眼部异常。实验组共40只BALB/c小鼠，在颈部皮下注射0.05%噻胺酮0.5ml，麻醉后，角膜上皮划痕，每眼滴入病毒原液10μl，闭眼按摩30秒钟。随机抽样分成5个组，每组8只小鼠，16只眼。第1组为对照组，予生理盐水点眼；2～5组均为药液点眼治疗组。种毒后1小时开始治疗，第2组用0.1%ACV滴眼剂，第3组用0.5%McAb滴眼剂，均治疗5天。种毒后24小时开始治疗，第4组用0.1%ACV，第5组用McAb，均治疗12天。设第6组为模拟感染，角膜划痕后不接种病毒，生理盐水点眼。各组点眼治疗：每只眼每次1滴(约10μl)，每2小时1次，每日8次。
1.2.5 临床观察：在种毒后2、4、6、8、10、12、15、18天角膜荧光素钠染色后用裂隙灯显微镜观察角膜上皮病变，并记录实质病变、脑炎死亡、角膜新生血管的发生。
角膜上皮病变按占角膜面积划分为0～4度[1]：
, 百拇医药
1度：<25%；2度：25%～50%；3度：51%～75%；4度：>75%
每度间以病变密度和深度又计为0.5度
角膜实质病变划分为0～4度[2]：
0度：正常；1度：轻度水肿或轻度基质不透明；2度：不透明和基质水肿限于角膜直径的1/2以内；3度：角膜基质水肿和不透明超过角膜直径的1/2；4度：角膜基质水肿和不透明严重，看不到虹膜。
2 结果
2.1 HSV-1组织培养半数感染剂量
TCID50为10-5.5
2.2 McAb滴眼液免疫活性测定
, 百拇医药
间接免疫荧光测定，0.1%McAb眼药水的免疫活性，效价为10-3，0.5%McAb眼药水的效价为10-4。
2.3 临床疗效
2.3.1 脑炎死亡率：对照组小鼠在接种病毒后第6～12天因单疱病毒性脑炎共死亡3只。种毒后1小时开始治疗组，ACV组未发生死亡，McAb组死亡1只，24小时开始治疗组，ACV组在种毒后13天死亡1只，McAb组在第10天和12天共死亡2只。卡方检验无显著差异(p>0.05)。各组去除死亡小鼠后统计眼部病变。
2.3.2 角膜上皮病变：接种HSV-1后2～4天，对照组小鼠均发病，出现点状、棒状、树枝状角膜炎，在第8天后发展为地图状角膜炎，第10天时达高峰，以后病变逐渐减轻。模拟感染组无病变发生。以两样本均数t检验进行统计学处理。
接种HSV-1后1小时开始治疗组，在种毒后第4天，两治疗组均无病变记为0，与对照组病变0.70±0.31相比有显著差异(p<0.05)。角膜上皮病变对照组12天时病变为1.45±0.46，而ACV组为0.06±0.06，McAb组为0.07±0.07，基本治愈，治疗组与对照组相比均有显著差异(p<0.05)，两治疗组间无显著差异，疗效相近(p>0.05)，见表1。
, 百拇医药
接种HSV-1后24小时开始治疗，ACV组和McAb组种毒后2天时出现上皮病变，在种毒后第12天，McAb组病变记为0，而对照组为1.45±0.46，与对照组相比有显著差异(p<0.05)，治疗有效。两治疗组间，疗效相似(p>0.05)，见表1。
接种病毒后1小时开始治疗组优于24小时开始治疗组，表现在种毒后第4和第6天2组与4组相比有显著差异(p<0.05)，而在种毒后第2、4、6天3组与5组相比有显著差异(p<0.05)。1小时开始McAb治疗组上皮病变最轻。
2.3.3 实质病变：角膜接种病毒后第10天对照组小鼠发生实质性角膜炎，角膜水肿、浸润，第18天10只眼有5只发生实质性角膜炎，病变达高峰，以后逐渐减轻。模拟感染组无病变发生。用两样本均数t检验进行统计学处理。
接种HSV-1后1小时开始治疗组，第15天时ACV组病变为0.13±0.13，而McAb组病变为0.07±0.05，基本治愈，而对照组实质病变为1.10±0.38，两治疗组角膜实质病变与对照组相比均有显著差异(p<0.05)，两治疗组间无显著差异，治疗效果相似(p>0.05)，见表2。
, 百拇医药
接种HSV-1后24小时开始治疗组，在种毒后第18天ACV治疗组角膜实质病变为0.43±0.31，与对照组相比有显著差异(p<0.05)，见表2。
在各治疗组中，2组与4组，3组与5组相比无显著差异。说明种毒后1小时和24小时开始治疗对实质病变的疗效无明显差异。
2.3.4 角膜新生血管：对照组种毒后第2天开始出现新生血管，第18天达高峰，5/10只眼出现新生血管，而1小时开始治疗组，ACV组16只眼中有1只眼、McAb组14只眼中有3只眼出现新生血管。ACV治疗组新生血管发生与对照组相比，卡方检验结果有显著差异(p<0.05)，与对照组相比角膜新生血管减少。模拟感染组无病变发生。
表1 角膜上皮病变治疗结果 接种后
病变程度(平均值±标准差)
, 百拇医药 天数
对照
(1组)
1小时开始治疗组
24小时开始治疗组
ACV(2组)
McAb(3组)
ACV(4组)
McAb(5组)
2
4
6
8
, http://www.100md.com
10
12
15
18
0.75±0.28
0.70±0.31
0.85±0.32
0.95±0.48
1.50±0.48
1.45±0.46
1.05±0.35
0.90±0.31
, 百拇医药
1.09±0.33
0 *
0.06±0.06*
0.25±0.25
0.25±0.25*
0.06±0.06*
0.16±0.16*
0.16±0.16*
0 *
0 *
0 *
0.32±0.16
, 百拇医药
0.39±0.21
0.07±0.07*
0.07±0.05*
0.07±0.05*
0.89±0.26
0.79±0.32
0.86±0.35
0.29±0.20
0.36±0.22
0.50±0.34
0.57±0.39
0.21±0.16*
, http://www.100md.com
1.08±0.36*
0.54±0.22
0.25±0.18
0
0.38±0.22
0 *
0 *
0 *
*各组与1组比较p<0.05表2 角膜实质病变治疗结果 接种后
病变程度(平均值±标准差)
天数
对照
, http://www.100md.com
(1组)
1小时开始治疗组
24小时开始治疗组
ACV(2组)
McAb(3组)
ACV(4组)
McAb(5组)
10
12
15
18
1.00±0.42
, 百拇医药 1.10±0.46
1.10±0.38
1.90±0.64
0.13±0.16
0.06±0.06
0.13±0.13*
0.13±0.13*
0.29±0.16
0.06±0.06
0.14±0.14
0.07±0.05*
0.36±0.25
, 百拇医药
0.14±0.14
0.50±0.34
0.43±0.31*
0 *
0 *
0 *
0 *
*各组与1组比较：p<0.05
3 讨论
单纯疱疹病毒为中等大小的病毒，其基因组为线状双股DNA。5个糖蛋白基因产物分别为gB、gC、gD、gE和gG[3]。其中gB、gC、gD和gE决定病毒的吸附与穿入过程，抗糖蛋白gD抗体可阻断病毒吸附，使之不能与细胞融合[4]。
, 百拇医药
HSV糖蛋白gC和gD的McAb在体外具有中和反应活性，在体内对病毒攻击具有保护作用。接种HSV糖蛋白后，人体产生抗体和细胞介导的免疫力[3]。高谦等[5]用微量组织培养中和试验和ADCC-51Cr释放实验的研究结果表明，5种抗HSV McAb中仅2C5有较高中和效价和ADCC活性，1D10虽无中和活性但有较高的ADCC活性，家兔皮内局部保护实验结果与ADCC效应相符合，1D10和2C5对家兔皮内局部感染HSV也有保护作用，认为抗HSV McAb在动物体内的保护作用与ADCC活性密切相关。本实验所用的5种不同的McAb，其中2C5中和效价为1∶128[5]。
无环鸟苷是特异性的、相对无毒的抗HSV-1的有效药物[6、7]。作用机制为竞争性抑制病毒DNA聚合酶，阻止dGTP掺入病毒DNA，抑制病毒DNA的合成[8]。
, 百拇医药
本实验以BALB/c近交系小鼠为单疱病毒性角膜炎模型，以尽量减少小鼠之间免疫力的差别。发现BALB/c小鼠免疫力低下，对HSV-1 KOS株较敏感，较易发生实质性角膜炎。采用McAb和抗HSV-1药物ACV早期局部点眼治疗，与对照组相比均取得明显疗效。治疗组与对照组相比，角膜上皮和实质病变均减轻。ACV组与对照组相比，角膜新生血管减少。1小时开始用McAb组角膜上皮病变最轻，McAb可能通过中和游离的病毒和阻止病毒吸附和穿入而起作用。此外，McAb可能通过ADCC引起细胞免疫而达到抗病毒作用。
种毒后1小时开始治疗组上皮病变明显轻于24小时开始治疗组，且疗程由12天缩短至5天。说明感染HSV后早期治疗明显优于晚期治疗。
4 参考文献
1 王香兰，等.眼科研究，1991；9(3)：129
2 Inoue Y，et al.Invest Ophthalmol Vis Sci，1990；31：411
, 百拇医药
3 顾方舟，等.病毒、立克次体及衣原体疾病诊断技术.第六版，北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1994：215
4 Heiligenhaus A，et al.Eye，1995；9：85
5 高谦，等.单克隆抗体通迅，1985；10：1
6 Elion GB，et al.Proc Natl Acad Sci USA.1977；74：5716
7 Schaeffer HJ，et al.Nature，1978；272：535
8 陈祖基.实用眼科药理学.北京：中国科学技术出版社，1993：175
(1997-07-03收稿，1997-12-03修回), 百拇医药
单位：*北京市眼科研究所，100730
关键词：角膜炎；单纯疱疹病毒；无环鸟苷/治疗应用；抗体；单克隆/治疗应用
眼科980117 摘 要 以BALB/c小鼠HSK为动物模型，应用无环鸟苷(ACV)和单克隆抗体(McAb)在接种病毒后不同时间开始点眼治疗，观察对角膜炎的疗效。各治疗组与对照组相比均有显著疗效。接种病毒后同一时间开始治疗(1小时或24小时)，ACV与McAb对角膜病变的疗效相似，1小时开始治疗组上皮病变明显轻于24小时开始治疗组。此外，ACV治疗组角膜新生血管减少。
分类号 R772.21
单疱病毒性角膜炎(HSK)是角膜病的首要致盲原因。本实验研究了在角膜接种HSV-1 KOS株后分别于1小时和24小时开始用无环鸟苷和5种单克隆抗体局部点眼治疗，观察对角膜炎的治疗作用。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1材料
1.1.1 病毒：单纯疱疹病毒Ⅰ型KOS株(来自中国预防医学科学院病毒所)。
1.1.2 细胞：原代乳兔肾细胞。
1.1.3 抗单疱病毒(HSV)单克隆抗体滴眼剂：购自第四军医大学，选用抗HSV糖蛋白gCMcAb2C5，2A8，1A12，Mad-2和抗gD McAb1D10株的腹水经纯化而得纯Ⅰ gG。
1.1.4 0.1%无环鸟苷滴眼剂：湖北潜江制药厂生产。
1.1.5 动物：BALB/c雌性小鼠，4～6周，购自中国医学科学院实验动物研究所繁育场。
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1.1.6 检查仪器：Topcon SL-6E裂隙灯显微镜。
1.2 方法
1.2.1 HSV-1 KOS株的培养传代：乳兔肾皮质部原代细胞长成单层后，用HSV-1病毒接种，37℃培养，逐日观察细胞病变效应(CPE)，收集病毒悬液，-70℃冰箱冻存。
1.2.2 病毒滴定：将病毒悬液进行10倍稀释，加入在96孔培养板的单层乳兔肾细胞中，每个病毒稀释度接种4孔，加培养液作为阴性对照。置37℃ 5%CO2孵育5天，每天观察各孔的CPE，按病变细胞多少以“+”计算。计算组织培养半数感染剂量(TCID50)。
1.2.3 间接免疫荧光法检测McAb的效价：将HSV-1病毒感染细胞抗原片，滴加稀释的McAb，使抗原抗体结合。滴加1∶16稀释的荧光抗体(异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠IgG)，孵育、洗涤、干燥后，在荧光显微镜下观察。
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1.2.4 建立感染模型和分组：小鼠用一周时间适应环境，用裂隙灯检查，排除眼部异常。实验组共40只BALB/c小鼠，在颈部皮下注射0.05%噻胺酮0.5ml，麻醉后，角膜上皮划痕，每眼滴入病毒原液10μl，闭眼按摩30秒钟。随机抽样分成5个组，每组8只小鼠，16只眼。第1组为对照组，予生理盐水点眼；2～5组均为药液点眼治疗组。种毒后1小时开始治疗，第2组用0.1%ACV滴眼剂，第3组用0.5%McAb滴眼剂，均治疗5天。种毒后24小时开始治疗，第4组用0.1%ACV，第5组用McAb，均治疗12天。设第6组为模拟感染，角膜划痕后不接种病毒，生理盐水点眼。各组点眼治疗：每只眼每次1滴(约10μl)，每2小时1次，每日8次。
1.2.5 临床观察：在种毒后2、4、6、8、10、12、15、18天角膜荧光素钠染色后用裂隙灯显微镜观察角膜上皮病变，并记录实质病变、脑炎死亡、角膜新生血管的发生。
角膜上皮病变按占角膜面积划分为0～4度[1]：
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1度：<25%；2度：25%～50%；3度：51%～75%；4度：>75%
每度间以病变密度和深度又计为0.5度
角膜实质病变划分为0～4度[2]：
0度：正常；1度：轻度水肿或轻度基质不透明；2度：不透明和基质水肿限于角膜直径的1/2以内；3度：角膜基质水肿和不透明超过角膜直径的1/2；4度：角膜基质水肿和不透明严重，看不到虹膜。
2 结果
2.1 HSV-1组织培养半数感染剂量
TCID50为10-5.5
2.2 McAb滴眼液免疫活性测定
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间接免疫荧光测定，0.1%McAb眼药水的免疫活性，效价为10-3，0.5%McAb眼药水的效价为10-4。
2.3 临床疗效
2.3.1 脑炎死亡率：对照组小鼠在接种病毒后第6～12天因单疱病毒性脑炎共死亡3只。种毒后1小时开始治疗组，ACV组未发生死亡，McAb组死亡1只，24小时开始治疗组，ACV组在种毒后13天死亡1只，McAb组在第10天和12天共死亡2只。卡方检验无显著差异(p>0.05)。各组去除死亡小鼠后统计眼部病变。
2.3.2 角膜上皮病变：接种HSV-1后2～4天，对照组小鼠均发病，出现点状、棒状、树枝状角膜炎，在第8天后发展为地图状角膜炎，第10天时达高峰，以后病变逐渐减轻。模拟感染组无病变发生。以两样本均数t检验进行统计学处理。
接种HSV-1后1小时开始治疗组，在种毒后第4天，两治疗组均无病变记为0，与对照组病变0.70±0.31相比有显著差异(p<0.05)。角膜上皮病变对照组12天时病变为1.45±0.46，而ACV组为0.06±0.06，McAb组为0.07±0.07，基本治愈，治疗组与对照组相比均有显著差异(p<0.05)，两治疗组间无显著差异，疗效相近(p>0.05)，见表1。
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接种HSV-1后24小时开始治疗，ACV组和McAb组种毒后2天时出现上皮病变，在种毒后第12天，McAb组病变记为0，而对照组为1.45±0.46，与对照组相比有显著差异(p<0.05)，治疗有效。两治疗组间，疗效相似(p>0.05)，见表1。
接种病毒后1小时开始治疗组优于24小时开始治疗组，表现在种毒后第4和第6天2组与4组相比有显著差异(p<0.05)，而在种毒后第2、4、6天3组与5组相比有显著差异(p<0.05)。1小时开始McAb治疗组上皮病变最轻。
2.3.3 实质病变：角膜接种病毒后第10天对照组小鼠发生实质性角膜炎，角膜水肿、浸润，第18天10只眼有5只发生实质性角膜炎，病变达高峰，以后逐渐减轻。模拟感染组无病变发生。用两样本均数t检验进行统计学处理。
接种HSV-1后1小时开始治疗组，第15天时ACV组病变为0.13±0.13，而McAb组病变为0.07±0.05，基本治愈，而对照组实质病变为1.10±0.38，两治疗组角膜实质病变与对照组相比均有显著差异(p<0.05)，两治疗组间无显著差异，治疗效果相似(p>0.05)，见表2。
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接种HSV-1后24小时开始治疗组，在种毒后第18天ACV治疗组角膜实质病变为0.43±0.31，与对照组相比有显著差异(p<0.05)，见表2。
在各治疗组中，2组与4组，3组与5组相比无显著差异。说明种毒后1小时和24小时开始治疗对实质病变的疗效无明显差异。
2.3.4 角膜新生血管：对照组种毒后第2天开始出现新生血管，第18天达高峰，5/10只眼出现新生血管，而1小时开始治疗组，ACV组16只眼中有1只眼、McAb组14只眼中有3只眼出现新生血管。ACV治疗组新生血管发生与对照组相比，卡方检验结果有显著差异(p<0.05)，与对照组相比角膜新生血管减少。模拟感染组无病变发生。
表1 角膜上皮病变治疗结果 接种后
病变程度(平均值±标准差)
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对照
(1组)
1小时开始治疗组
24小时开始治疗组
ACV(2组)
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0.75±0.28
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1.09±0.33
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0.06±0.06*
0.25±0.25
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0.16±0.16*
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*各组与1组比较p<0.05表2 角膜实质病变治疗结果 接种后
病变程度(平均值±标准差)
天数
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(1组)
1小时开始治疗组
24小时开始治疗组
ACV(2组)
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3 讨论
单纯疱疹病毒为中等大小的病毒，其基因组为线状双股DNA。5个糖蛋白基因产物分别为gB、gC、gD、gE和gG[3]。其中gB、gC、gD和gE决定病毒的吸附与穿入过程，抗糖蛋白gD抗体可阻断病毒吸附，使之不能与细胞融合[4]。
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HSV糖蛋白gC和gD的McAb在体外具有中和反应活性，在体内对病毒攻击具有保护作用。接种HSV糖蛋白后，人体产生抗体和细胞介导的免疫力[3]。高谦等[5]用微量组织培养中和试验和ADCC-51Cr释放实验的研究结果表明，5种抗HSV McAb中仅2C5有较高中和效价和ADCC活性，1D10虽无中和活性但有较高的ADCC活性，家兔皮内局部保护实验结果与ADCC效应相符合，1D10和2C5对家兔皮内局部感染HSV也有保护作用，认为抗HSV McAb在动物体内的保护作用与ADCC活性密切相关。本实验所用的5种不同的McAb，其中2C5中和效价为1∶128[5]。
无环鸟苷是特异性的、相对无毒的抗HSV-1的有效药物[6、7]。作用机制为竞争性抑制病毒DNA聚合酶，阻止dGTP掺入病毒DNA，抑制病毒DNA的合成[8]。
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本实验以BALB/c近交系小鼠为单疱病毒性角膜炎模型，以尽量减少小鼠之间免疫力的差别。发现BALB/c小鼠免疫力低下，对HSV-1 KOS株较敏感，较易发生实质性角膜炎。采用McAb和抗HSV-1药物ACV早期局部点眼治疗，与对照组相比均取得明显疗效。治疗组与对照组相比，角膜上皮和实质病变均减轻。ACV组与对照组相比，角膜新生血管减少。1小时开始用McAb组角膜上皮病变最轻，McAb可能通过中和游离的病毒和阻止病毒吸附和穿入而起作用。此外，McAb可能通过ADCC引起细胞免疫而达到抗病毒作用。
种毒后1小时开始治疗组上皮病变明显轻于24小时开始治疗组，且疗程由12天缩短至5天。说明感染HSV后早期治疗明显优于晚期治疗。
4 参考文献
1 王香兰，等.眼科研究，1991；9(3)：129
2 Inoue Y，et al.Invest Ophthalmol Vis Sci，1990；31：411
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3 顾方舟，等.病毒、立克次体及衣原体疾病诊断技术.第六版，北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1994：215
4 Heiligenhaus A，et al.Eye，1995；9：85
5 高谦，等.单克隆抗体通迅，1985；10：1
6 Elion GB，et al.Proc Natl Acad Sci USA.1977；74：5716
7 Schaeffer HJ，et al.Nature，1978；272：535
8 陈祖基.实用眼科药理学.北京：中国科学技术出版社，1993：175
(1997-07-03收稿，1997-12-03修回), 百拇医药