子宫内膜癌多药耐药基因(MDRI)的表达及其意义
作者：王言奎 罗 兵 刘东光 戴淑真 纪新强
单位：青岛市(266021)青岛医学院
关键词：抗药性 多药 聚合酶链反应 子宫内膜癌
齐鲁肿瘤杂志980307
摘 要 目的 探讨子宫内膜癌多药耐药基因(MDR1)的表达及其意义。方法 利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，对37例初治子宫内膜癌、10例正常子宫内膜及10例正常子宫肌层组织MDR1 基因的表达进行检测，同时用MTT 法对宫内膜癌进行肿瘤细胞体外药敏试验。结果 37例子宫内膜癌和10例正常子宫内膜组织MDR1 表达均为阳性,MTT药敏试验表明绝大多数子宫内膜癌对化疗药物具有交叉耐药性。结论 子宫内膜癌对化疗的耐药可能是一种固有性MDR,这可能与MDR1基因的表达有关。
Expression and Implication of Multidrug Resistance Gene(MDR1) in Endometrial Carcinoma
, 百拇医药
Wang Yankui,Luo Bing,Liu Dongguang,et al Endometrial Carcinoma.
(Department of Obstetrics and Gynecology, The Affiliated Hospital of Medical College,Qingdao University,Qingdao 266003)
Abstract Objective To study the expression and implication of multidrug resistance gene(MDR1) in endometrial carcinoma. Methods Using reverse transcription PCR(RT-PCR),the expression and implication of MDR1 gene was detected in endometrial carcinoma from 37 primary untreated patients,10 physiological endometriums and 10 normal myometrial tissues.In endometrial carcinomas,sensitivity to anticancer agents was also examined by MTT.Results MDR1 gene was positive in 37 samples of endometrial carcinoma and each physiological endometrium.No MDR1 gene was detected in each myometrium.Cross drug resistance to anticancer agents was showed by MTT in almost all the endometrial carcinoma.Conclusions The multidrug resistance (MDR) in endometrial carcinoma may be related with the expression of MDR1 gene.
, 百拇医药
Key words Drug resistance Multiple polymerase chain reaction Endometrial carcinoma
多药耐药(MDR)是化疗成功治疗肿瘤的主要障碍之一，多药耐药基因(MDRI)的表达是形成MDR 的一个主要原因，对MDR的研究多集中在血液系统恶性疾病，而对子宫内膜癌等实体瘤研究较少，本文对子宫内膜癌MDR1基因的表达进行了检测，并结合肿瘤细胞体外药敏试验(MTT)对其临床意义进行了初步探讨。
1 材料和方法
1.1研究对象
选取1995年7月～1997年10月住院手术的子宫内膜癌37例，平均年龄54.6岁(28～60岁)，所有病人术前均未行放疗、化疗或孕激素治疗。分期(FIGO,1998)：Ⅰ期29例、Ⅱ期6例、Ⅲ期2例；组织学类型：腺癌30例、腺鳞癌5例、透明细胞癌2例；组织病理学分级(FIGO,1998):G1 18例、G2 11例、G3 8例。手术中采集肿瘤组织标本后立即置含营养液的无菌瓶中，尽快送实验室处埋。同时选取正常子宫内膜和肌层各10例，均为因子宫肌瘤而行子宫全切并经术后病埋诊断正常者，这些组织标本采集后立即置液氮中保存。
, 百拇医药
1.2 MTT比色法
用胶原酶消化肿瘤组织制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1～5×105个/m1，接种于96孔培养板内，每孔200μ1。实验设培养液对照组、肿瘤细胞对照组及加不同抗肿瘤药物的实验组，每组设3个平行孔：实验组内每孔抗加肿瘤药物20μ1(终浓度为各抗肿瘤药物血峰浓度)，37℃，Co2培养48h,加20μlMTT继续培养4h,1000g离心10min,弃上清，加200μl DMSO混匀，用酶标检测仪测每孔吸光度(A)值，按下列公式计算药物对细胞的抑制率(%)：
×100%
1.3 MDR1 mRNA检测
1.3.1 RNA制备 将肿瘤组织制成单细胞悬液，用Trizol试剂一步法提取细胞总RNA，紫外分光光度计定量。
, 百拇医药
1.3.2 cDNA合成 取1μg细胞总RNA，采用逆转录试剂盒(Proinega 公司产品)提供的标准条件进行逆转录反应，所获cDNA用作PCR反应模板。
1.3.3 PCR引物 MDRI引物及内参照引物β2-MG(β2微球蛋白)参考文献[1]，由北京赛百盛生物工程公司合成，其中MDR1扩增片段长度为157bp,β2-MG扩增产物为114bp。MDR1上游引物序列为：
5′-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3′
下游引物序列为：
5′-GTTCAACTTCTGCTCCTGA
β2-MG上游引物序列为：
, 百拇医药
5′-ACCCCCATCGAAAAAGATGA-3′
下游引物序列为：
5′-ATCTTCAAACCTCCATGATG-3′
1.3.4 PCR扩增 PCR反应体系为30μl,包括逆转录产物(cDNA)3μl，10×buffer3μl,dNTP0.2mmol/L,MgCL2 1.5mmol/L,2对引物各0.5μmol/L,Taq DNA聚合酶lu。PCR反应条件为95℃ 30S，55℃ 30S，72℃ 60S，35个循环，最后72℃延伸5min。
1.3.5 PCR产物电泳 取10μlPCR产物于含溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶中电泳 ，80v,lh,紫外透射仪下观察结果并拍照，用LKB激光密度扫描仪扫描底片，并计算MDR1与β2-MG曲线下峰面积作为PCR产物的含量，用两者的比值表示MDR1的表达水平。
, 百拇医药
2 结果
2.1MDR1基因的表达
β2-MG在所有组织标本中均有稳定的表达，证实了逆转录所得cDNA样品的完整性，而MDR1则表现出较大的差异。37例子宫内膜癌及10例正常子宫内膜组织中均有MDR1基因的表达，其表达水平分别为0.37±0.15和0.33±0.13，统计学处理无显著性差异(P>0.05)，而10例正常子宫肌层组织均无MDR1基因的表达。
2.2 不同化疗药物对子宫内膜癌的细胞抑制率，见表1。
表1 不同化疗药物对子宫内膜癌的细胞抑制率 药物
例数
肿瘤细胞抑制率(%)(
±s)
, 百拇医药
肿瘤细胞抑制率<50%例数(%)
长春新碱
37
24.70±8.88
37(100)
阿霉素
37
23.41±17.51
35(94.6)
鬼臼乙叉甙
37
35.80±13.33
, 百拇医药
32(86.49)
丝裂霉素
37
28.16±19.97
32(86.49)
顺铂
37
42.22±21.97
25(67.57)
3 讨论
MDR指肿瘤细胞同时对多种结构和作用机制不同的抗肿瘤药物产生耐药，MDR1基因的表达是其形成的重要原因之一，MDR1基因编码一种分子量为170KD的P-糖蛋白(P-glycoprotein,Pgp),Pgp是一种细胞膜糖蛋白，它利用细胞膜ATP能量与化疗药物结合并将药物泵出细胞外，使细胞内药物浓度降低，从而产生MDR，主要对天然植物碱类和抗生素类等亲脂性抗癌药产生耐药。
, http://www.100md.com
MDR1基因在部分人体正常组织中具有较高水平的表达，如：结肠、肾脏、肝脏、肾上腺等，正常子宫内膜亦有较高水平MDR1mRNA的表达[2、3]。来源于这些组织的肿瘤，由正常细胞演变成恶性细胞时，恶性细胞继续表达MDR1，因此临床上来源于这些组织的肿瘤，对初始化疗就具有耐药性。本文研究结果显示正常子宫内膜有MDR1基因的表达，与Esteller等的研究结果一致[3]，37例子宫内膜癌MDR1基因表达均为阳性，因本研究所有病人术前均未接受放疗、化疗或孕激素治疗，因此，内膜癌组织中MDR1基因的表达是固有的MDR1基因，而不是化疗药物诱导产生的，这种基因的表达及MDR的产生称固有性耐药(Intrinsic drug resistance)。这与临床上子宫内膜癌对化疗不敏感是相符的，同时，本文MTT检测结果显示绝大多数MDR相关药物对子宫内膜癌不敏感(肿瘤细胞抑制率<50%)，这与其MDR1基因的表达情况也是一致的。同时我们观察到32.43%的子宫内膜癌对顺铂敏感，与Rantanen等研究结果一致[4]，从而提示对子宫内膜癌化疗应选用MDR非相关药物。肿瘤细胞对化疗药物产生耐药有多种机制，除与MDR1基因的过度表达有关外，还与拓扑异构酶Ⅱ(TOPⅡ)活性或结构异常，谷胱甘肽S-转移酶活性异常、多药耐药相关蛋白(MRP)基因的过度表达等多种机制有关。本文37例内膜癌均有MDR1基因的表达，这证明子宫内膜癌对化疗药物的主要耐药机制可能是MDR1基因的表达。
, 百拇医药
孕激素治疗是对子宫内膜非典型增生及孕激素受体(PR)阳性子宫内膜癌治疗的有效方法之一，孕激素是通过PR而发挥作用的，尽管MDR1基因过度表达并产生Pgp，但Pgp对孕激素的作用是否没有抑制或抑制作用很小，尚有待进一步研究。
总之，MTT显示绝大部分子宫内膜癌对化疗药不敏感，这与临床上的治疗结果相符，子宫内膜癌的MDR是一种固有性的耐药，MDR1基因的过度表达可能是其产生的主要原因。
参考文献
[1] Noonan KE,BecK C,Holzmayer TA,et al. Quantitative analysis of MDR1(Multidrug resistance)gene expression in human tumor by polymerase chain reaction.Proc Natl Acad Sci USA,1990,87:7160.
, 百拇医药
[2] Fojo AT,cleda K,Slaman DJ,et al.Expression of a multidrug resistance gene in human tumors and tissue.Proc Natl Acad Sci USA,1987,84:265.
[3] Esteller M,Martinez-Palones JM,Garcia A,et al.High rate of MDR-1 and heterogeneous pattern of MRP expression without gene amplification in endometrial carcinoma.Int J Cancer,1995,63:798.
[4] Rantanen V,Grenman S,Kulmala J,et al.Comparative evaluation of cisplatin and carboplatin sensitivity in endometral adenocarcinoma cell lines.Br J Cancer,1994,69:482., 百拇医药
单位：青岛市(266021)青岛医学院
关键词：抗药性 多药 聚合酶链反应 子宫内膜癌
齐鲁肿瘤杂志980307
摘 要 目的 探讨子宫内膜癌多药耐药基因(MDR1)的表达及其意义。方法 利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，对37例初治子宫内膜癌、10例正常子宫内膜及10例正常子宫肌层组织MDR1 基因的表达进行检测，同时用MTT 法对宫内膜癌进行肿瘤细胞体外药敏试验。结果 37例子宫内膜癌和10例正常子宫内膜组织MDR1 表达均为阳性,MTT药敏试验表明绝大多数子宫内膜癌对化疗药物具有交叉耐药性。结论 子宫内膜癌对化疗的耐药可能是一种固有性MDR,这可能与MDR1基因的表达有关。
Expression and Implication of Multidrug Resistance Gene(MDR1) in Endometrial Carcinoma
, 百拇医药
Wang Yankui,Luo Bing,Liu Dongguang,et al Endometrial Carcinoma.
(Department of Obstetrics and Gynecology, The Affiliated Hospital of Medical College,Qingdao University,Qingdao 266003)
Abstract Objective To study the expression and implication of multidrug resistance gene(MDR1) in endometrial carcinoma. Methods Using reverse transcription PCR(RT-PCR),the expression and implication of MDR1 gene was detected in endometrial carcinoma from 37 primary untreated patients,10 physiological endometriums and 10 normal myometrial tissues.In endometrial carcinomas,sensitivity to anticancer agents was also examined by MTT.Results MDR1 gene was positive in 37 samples of endometrial carcinoma and each physiological endometrium.No MDR1 gene was detected in each myometrium.Cross drug resistance to anticancer agents was showed by MTT in almost all the endometrial carcinoma.Conclusions The multidrug resistance (MDR) in endometrial carcinoma may be related with the expression of MDR1 gene.
, 百拇医药
Key words Drug resistance Multiple polymerase chain reaction Endometrial carcinoma
多药耐药(MDR)是化疗成功治疗肿瘤的主要障碍之一，多药耐药基因(MDRI)的表达是形成MDR 的一个主要原因，对MDR的研究多集中在血液系统恶性疾病，而对子宫内膜癌等实体瘤研究较少，本文对子宫内膜癌MDR1基因的表达进行了检测，并结合肿瘤细胞体外药敏试验(MTT)对其临床意义进行了初步探讨。
1 材料和方法
1.1研究对象
选取1995年7月～1997年10月住院手术的子宫内膜癌37例，平均年龄54.6岁(28～60岁)，所有病人术前均未行放疗、化疗或孕激素治疗。分期(FIGO,1998)：Ⅰ期29例、Ⅱ期6例、Ⅲ期2例；组织学类型：腺癌30例、腺鳞癌5例、透明细胞癌2例；组织病理学分级(FIGO,1998):G1 18例、G2 11例、G3 8例。手术中采集肿瘤组织标本后立即置含营养液的无菌瓶中，尽快送实验室处埋。同时选取正常子宫内膜和肌层各10例，均为因子宫肌瘤而行子宫全切并经术后病埋诊断正常者，这些组织标本采集后立即置液氮中保存。
, 百拇医药
1.2 MTT比色法
用胶原酶消化肿瘤组织制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1～5×105个/m1，接种于96孔培养板内，每孔200μ1。实验设培养液对照组、肿瘤细胞对照组及加不同抗肿瘤药物的实验组，每组设3个平行孔：实验组内每孔抗加肿瘤药物20μ1(终浓度为各抗肿瘤药物血峰浓度)，37℃，Co2培养48h,加20μlMTT继续培养4h,1000g离心10min,弃上清，加200μl DMSO混匀，用酶标检测仪测每孔吸光度(A)值，按下列公式计算药物对细胞的抑制率(%)：
×100%1.3 MDR1 mRNA检测
1.3.1 RNA制备 将肿瘤组织制成单细胞悬液，用Trizol试剂一步法提取细胞总RNA，紫外分光光度计定量。
, 百拇医药
1.3.2 cDNA合成 取1μg细胞总RNA，采用逆转录试剂盒(Proinega 公司产品)提供的标准条件进行逆转录反应，所获cDNA用作PCR反应模板。
1.3.3 PCR引物 MDRI引物及内参照引物β2-MG(β2微球蛋白)参考文献[1]，由北京赛百盛生物工程公司合成，其中MDR1扩增片段长度为157bp,β2-MG扩增产物为114bp。MDR1上游引物序列为：
5′-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3′
下游引物序列为：
5′-GTTCAACTTCTGCTCCTGA
β2-MG上游引物序列为：
, 百拇医药
5′-ACCCCCATCGAAAAAGATGA-3′
下游引物序列为：
5′-ATCTTCAAACCTCCATGATG-3′
1.3.4 PCR扩增 PCR反应体系为30μl,包括逆转录产物(cDNA)3μl，10×buffer3μl,dNTP0.2mmol/L,MgCL2 1.5mmol/L,2对引物各0.5μmol/L,Taq DNA聚合酶lu。PCR反应条件为95℃ 30S，55℃ 30S，72℃ 60S，35个循环，最后72℃延伸5min。
1.3.5 PCR产物电泳 取10μlPCR产物于含溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶中电泳 ，80v,lh,紫外透射仪下观察结果并拍照，用LKB激光密度扫描仪扫描底片，并计算MDR1与β2-MG曲线下峰面积作为PCR产物的含量，用两者的比值表示MDR1的表达水平。
, 百拇医药
2 结果
2.1MDR1基因的表达
β2-MG在所有组织标本中均有稳定的表达，证实了逆转录所得cDNA样品的完整性，而MDR1则表现出较大的差异。37例子宫内膜癌及10例正常子宫内膜组织中均有MDR1基因的表达，其表达水平分别为0.37±0.15和0.33±0.13，统计学处理无显著性差异(P>0.05)，而10例正常子宫肌层组织均无MDR1基因的表达。
2.2 不同化疗药物对子宫内膜癌的细胞抑制率，见表1。
表1 不同化疗药物对子宫内膜癌的细胞抑制率 药物
例数
肿瘤细胞抑制率(%)(
±s), 百拇医药
肿瘤细胞抑制率<50%例数(%)
长春新碱
37
24.70±8.88
37(100)
阿霉素
37
23.41±17.51
35(94.6)
鬼臼乙叉甙
37
35.80±13.33
, 百拇医药
32(86.49)
丝裂霉素
37
28.16±19.97
32(86.49)
顺铂
37
42.22±21.97
25(67.57)
3 讨论
MDR指肿瘤细胞同时对多种结构和作用机制不同的抗肿瘤药物产生耐药，MDR1基因的表达是其形成的重要原因之一，MDR1基因编码一种分子量为170KD的P-糖蛋白(P-glycoprotein,Pgp),Pgp是一种细胞膜糖蛋白，它利用细胞膜ATP能量与化疗药物结合并将药物泵出细胞外，使细胞内药物浓度降低，从而产生MDR，主要对天然植物碱类和抗生素类等亲脂性抗癌药产生耐药。
, http://www.100md.com
MDR1基因在部分人体正常组织中具有较高水平的表达，如：结肠、肾脏、肝脏、肾上腺等，正常子宫内膜亦有较高水平MDR1mRNA的表达[2、3]。来源于这些组织的肿瘤，由正常细胞演变成恶性细胞时，恶性细胞继续表达MDR1，因此临床上来源于这些组织的肿瘤，对初始化疗就具有耐药性。本文研究结果显示正常子宫内膜有MDR1基因的表达，与Esteller等的研究结果一致[3]，37例子宫内膜癌MDR1基因表达均为阳性，因本研究所有病人术前均未接受放疗、化疗或孕激素治疗，因此，内膜癌组织中MDR1基因的表达是固有的MDR1基因，而不是化疗药物诱导产生的，这种基因的表达及MDR的产生称固有性耐药(Intrinsic drug resistance)。这与临床上子宫内膜癌对化疗不敏感是相符的，同时，本文MTT检测结果显示绝大多数MDR相关药物对子宫内膜癌不敏感(肿瘤细胞抑制率<50%)，这与其MDR1基因的表达情况也是一致的。同时我们观察到32.43%的子宫内膜癌对顺铂敏感，与Rantanen等研究结果一致[4]，从而提示对子宫内膜癌化疗应选用MDR非相关药物。肿瘤细胞对化疗药物产生耐药有多种机制，除与MDR1基因的过度表达有关外，还与拓扑异构酶Ⅱ(TOPⅡ)活性或结构异常，谷胱甘肽S-转移酶活性异常、多药耐药相关蛋白(MRP)基因的过度表达等多种机制有关。本文37例内膜癌均有MDR1基因的表达，这证明子宫内膜癌对化疗药物的主要耐药机制可能是MDR1基因的表达。
, 百拇医药
孕激素治疗是对子宫内膜非典型增生及孕激素受体(PR)阳性子宫内膜癌治疗的有效方法之一，孕激素是通过PR而发挥作用的，尽管MDR1基因过度表达并产生Pgp，但Pgp对孕激素的作用是否没有抑制或抑制作用很小，尚有待进一步研究。
总之，MTT显示绝大部分子宫内膜癌对化疗药不敏感，这与临床上的治疗结果相符，子宫内膜癌的MDR是一种固有性的耐药，MDR1基因的过度表达可能是其产生的主要原因。
参考文献
[1] Noonan KE,BecK C,Holzmayer TA,et al. Quantitative analysis of MDR1(Multidrug resistance)gene expression in human tumor by polymerase chain reaction.Proc Natl Acad Sci USA,1990,87:7160.
, 百拇医药
[2] Fojo AT,cleda K,Slaman DJ,et al.Expression of a multidrug resistance gene in human tumors and tissue.Proc Natl Acad Sci USA,1987,84:265.
[3] Esteller M,Martinez-Palones JM,Garcia A,et al.High rate of MDR-1 and heterogeneous pattern of MRP expression without gene amplification in endometrial carcinoma.Int J Cancer,1995,63:798.
[4] Rantanen V,Grenman S,Kulmala J,et al.Comparative evaluation of cisplatin and carboplatin sensitivity in endometral adenocarcinoma cell lines.Br J Cancer,1994,69:482., 百拇医药