中国人血管抑制素Endostatin基因的分子克隆与序列鉴定
作者：贺祥 潘卫 王路 陈秋莉 殷学平 潘欣 芮耀诚 戚中田
单位：贺祥 潘卫 王路 陈秋莉 殷学平 潘欣 芮耀诚 戚中田(第二军医大学基础部微生物教研室 上海 200433)
关键词：Endostatin；克隆；序列
中国肿瘤生物治疗杂志000211
摘 要 目的： 内抑素(Endostatin)是一种有效的血管生成抑制因子，分离、克隆和测定中国人的Endostatin基因，为进一步研究Endostatin的功能奠定了基础。方法： 从中国人胎肝组织中提取mRNA，用RT-PCR方法将Endostatin的cDNA扩增出，克隆到pGEM-T载体中，测定其DNA序列。结果： 中国人的Endostatin cDNA序列被成功克隆，序列分析证实为Endostatin基因。结论： 中国人的Endostatin cDNA基因编码序列与国外文献报道的相应序列完全一致。
, http://www.100md.com
《中国图书资料分类法》分类号 Q344.12
Molecular Cloning and Sequencing of Endostatin cDNA Derived from Chinese Fetus Hepatocytes
He Xiang Pan Wei Wang Lu Chen Qiuli Yin Xueping Pan Xin Rui Yaocheng Qi Zhongtian
(Department of Microbiology, Department of Basal Medicine, Second Military Medical University, Shanghai 200433)
Abstract Objective: Endostatin is an effective endogenous inhibitor of angiogensis. To lay foundation of studying the further function of endostatin, the endostatin cDNA from Chinese fetus hepatocytes was isolated, cloned and sequenced. Methods: The total mRNA was isolated from Chinese fetus hepatocytes. The endostatin cDNA was synthesized and amplified from the mRNA by RT-PCR and the PCR product was cloned into pGEM-T vector and subjected to DNA sequencing. Results: The endostatin cDNA was successfully cloned and sequenced. Conclusion: The coding sequence of Chinese Endostatin cDNA is the same as reported sequence derived from foreigner.
, 百拇医药
Key words Endostatin; clone; sequence
早在1863年，Virchow已注意到恶性肿瘤组织中血管绝对数急剧增多的现象，1945年Algire又提出肿瘤血管形成(neovascularization)的概念。Folkman等研究发现[1]实体肿瘤形成后，即进入无血管的浸润前期，此时肿瘤细胞主要靠弥散供给营养，这样的肿瘤结节直径一般小于2～3 mm，细胞数在107以内，肿瘤超过这样的体积还缺乏新生的毛细血管和小血管，肿瘤组织将发生退化，一旦新生的毛细血管长进肿瘤组织，肿瘤即加速生长，且易发生浸润和转移。因此，抑制血管生成可能是限制肿瘤生长和防止转移的有效策略。
内抑素[2](Endostatin)是一种有效的血管生成抑制因子，是1997年O'Reilly等继Angiostatin[3]之后从小鼠血管瘤细胞培养物中分离到的另一种血管抑制因子，是胶原ⅩⅧ 20 kD未端蛋白降解产物，该物质被证明有血管生长抑制作用，并能有效抑制多种小鼠肿瘤生长及转移。为进一步研究Endostatin的序列、特点及功能，我们从中国人胎肝组织中提取RNA，用RT-PCR方法将Endostatin扩增出，克隆到PGEM-T载体中，测定克隆片段的DNA序列。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 中国人胎肝组织
从长海医院妇产科引产胎儿肝脏组织中获取。
1.1.2 克隆载体及菌种
PGEM-T克隆载体来自PROMEGA公司，大肠肝菌DH5α为本室保存菌种。
1.1.3 引物合成
引物PrEn-U：5′-CTA CTT GGA GGC AGT-3′，引物PrEn-D：5′-CAC AGC CAC CGC GAC-3′及OligdT均由大连宝生物生物工程有限公司合成。
1.1.4 工具酶
, 百拇医药
Taq酶、限制酶、连接酶为GiBcol BRL产品；AMV反转录酶为Promega公司产品。
1.2 方法
1.2.1 胎肝组织总RNA的抽提
将Ig胎肝组织匀浆，加0.5 ml PBS(生理缓冲液)， 制成细胞悬液，取100 μl悬液，加500 μl Trizol混匀，用0.3 ml氯仿抽提，取上清液，加0.4 ml氯仿抽提，取上清300 μl，加30 μl 2 mol NaAc，加2.5倍体积无水乙醇，-70℃放置20 r/min，4℃ 15 000 r/min 离心15 min，70%冰乙醇洗2次 沉淀，抽干，溶于100 μl DEPC处理的水中，放置-70℃保存备用。
1.2.2 Endo的RT-PCR扩增
分别以OligodT和PrEn-D为引物进行反转录，取5×Buffer 4.0 μl, dNTP(2.5 mmol/L)2.0 μl, 引物OligodT或PrEn-D各1.0 μl, AMV反转录酶(10 U/μl)1.0 μl, RNA 5.0 μl ，ddH2O 8 μl，反应体积20 μl，70℃ 5 min，37℃ 1 h进行反转录反应。
, 百拇医药
取10×PCR Buffer(不含Mg2+)3.0 μl, 引物PrEn-U, PrEn-D各1.0 μl, Taq酶1.0 μl, ddH2O 24 μl ,混合加入上述反转录PCR液，反应体积共50 μl，94℃ 3 min，然后，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共35次循环，72℃ 7 min，至4℃。
1.2.3 Endo的克隆及酶切鉴定
取经低溶点胶纯化的Endo PCR扩增产物5 μl(50 ng)及pGEM-T载体1 μl(50 ng)于10 μl体积14℃过夜进行连接反应。转化大肠杆菌DH5α，从培养板上挑10个克隆抽提质粒。
用HindⅢ和 BamHⅠ酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆。
1.2. 4 Endo的序列测定
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挑选阳性克隆抽提质粒并用GFP自动测序仪进行正/反向测序。所测序列用DNAsis软件进行分析比较。
2 结 果
2.1 Endo的RT-PCR扩增
提取的中国人胎肝RNA分别用Endostatin特异引物PrEn-D和OligodT进行反转录，合成反应在37℃进行。再用引物PrEn-U和PrEn-D进行PCR扩增，结果如图1所示在分子量在550 bp处，OligodT合成的cDNA有较为特异的扩增，而PrEn-D扩增效果不理想。
2.2 pGEM-Endo的克隆和酶切鉴定
将由以OligodT合成的cDNA为模板的PCR扩增的Endo产物克隆到PGEM-T载体中，重组质粒酶谱分析结果表明该DNA片段被正确克隆(见图2)。
, 百拇医药
图1 中国人Endostatin cDNA 的RT-PCR扩增
Fig.1 The RT-PCR amplification of Chinese Endostatin cDNA
Lane 1: Negative control;
Lane 2: cDNA reverse transcripted with primer PrEn-D;
Lane 3:PCR products of cDNA reverse transcripted with primer Oligo-dT;
Lane 4: Positive control; Lane 5: PCR marker
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图2 pGEM-T-Endostatin 的酶切鉴定
Fig.2 Digestion of pGEM-T-Endostatin with EcoRⅠ and BamHⅠ
Lane 1: λ DNA/HindⅢ marker;
Lane 2～6: pGEM-T-Endostatin from various clones digested
with EcoRⅠ and BamHⅠ; Lane 7: PCR products of endostatin;
Lane 8: λ DNA/HindⅢ+ EcoRⅠ marker
2.3 序列测定
, 百拇医药
挑取3个不同的DNA克隆进行DNA序列测定，其中1个质粒为反向克隆。测序结果经DNAsis软件分析比较(见图3)，3个克隆的序列完全相同，为Endostatin编码序列。将该序列与国外发表序列比较，二者序列完全一致。
3 讨 论
一般的观点认为使用靶基因的特异序列为引物合成CDNA进行靶基因的cDNA扩增会取得比用OligodT合成cDNA进行扩增更好的效果[4]，而我们Endostatin的扩增实验结果是正好相反(见结果1)。可能的原因是当靶基因RNA含量很少并在总RNA中的比例较少时，序列特异的引物比OligodT会更有利靶基因的cDNA合成。然而，人肝组织Endostatin mRNA的含量很丰富[5]，用OligodT就足以保证一定量的靶基因cDNA被合成出来。在进行靶基因PCR的扩增中，由于，用序列特异引物PrEn-D合成的cDNA模板，限制反应特异扩增的只有一个引物PrEn-U，而OligodT合成的cDNA，同时有一对引物PrEn-U，PrEn-D限制PCR反应的特异扩增。因而该方法取得更好的实验结果。
, 百拇医药
图3 中国人Endostatin的核苷酸序列及推导的氨基酸序列
Fig.3 The determined DOA sequence and deduced amino acid sequence of Chinese Endostatin
人类基因组中，有一些基因很保守，而另一些基因则存在着基因多态性现象[6]。我们进行中国人Endostatin基因克隆的根本目的是要了解中国人的Endostatin基因序列是否与已报道的国外序列一致，是否有多态性现象，为将来对Endostatin进行结构功能研究及其开发利用打下基础。我们的实验结果证实从一例中国人胎肝组织克隆的Endostatin序列已与国外报道序列完全一致，而且国内外所报道的序列来也完全一致，初步说明了Endostatin的序列较为保守。然而，目前所测序还较少，还不能完全肯定该基因不存在多态性，我们正在进行更多不同个体的Endostatin基因克隆，以期进一步证实该结论
, 百拇医药
国家自然科学基金资助
贺祥,男,34岁,助理研究员,主要从事肿瘤分子药理学研究
参 考 文 献
1，Folkman J. Tumor angiogenesis: Therapeutic implication. N Engl J Med， 1971, 225: 1182
2，O'Reilly MS, Boehm T, Shing Y， et al. Endostatin: An endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell， 1997, 88: 277
3，O'Reilly MS, Holmgren L, Shing Y， et al. Angiostatin: A novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma. Cell, 1994, 79: 315
, http://www.100md.com
4，萨姆布鲁克 J， 弗里奇 EF， 曼尼阿蒂斯 T. 分子克隆实验指南. 金冬雁， 黎孟枫 等译. 第2版， 北京： 科学出版社， 1993. 672
5，Sasaki T, Fukai N, Mann K, et al. Structure, function and tissue forms of the c-terminal globular domain of collagen ⅩⅧ containing the angiogenesis inhibitor endostatin. EMBO J, 1998, 17(15): 4249
6，Prins J, Leus FR, Bouma BN, et al. The identification of polymorphisms in the coding region of the apolipoprotein (a) gene-association with earlier identified polymorphic sites and influence on the lipoprotein (a) concentration. Thromb Haemost， 1999, 82(6):1709
(1999-07-20收稿； 1999-10-05修回), 百拇医药
单位：贺祥 潘卫 王路 陈秋莉 殷学平 潘欣 芮耀诚 戚中田(第二军医大学基础部微生物教研室 上海 200433)
关键词：Endostatin；克隆；序列
中国肿瘤生物治疗杂志000211
摘 要 目的： 内抑素(Endostatin)是一种有效的血管生成抑制因子，分离、克隆和测定中国人的Endostatin基因，为进一步研究Endostatin的功能奠定了基础。方法： 从中国人胎肝组织中提取mRNA，用RT-PCR方法将Endostatin的cDNA扩增出，克隆到pGEM-T载体中，测定其DNA序列。结果： 中国人的Endostatin cDNA序列被成功克隆，序列分析证实为Endostatin基因。结论： 中国人的Endostatin cDNA基因编码序列与国外文献报道的相应序列完全一致。
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《中国图书资料分类法》分类号 Q344.12
Molecular Cloning and Sequencing of Endostatin cDNA Derived from Chinese Fetus Hepatocytes
He Xiang Pan Wei Wang Lu Chen Qiuli Yin Xueping Pan Xin Rui Yaocheng Qi Zhongtian
(Department of Microbiology, Department of Basal Medicine, Second Military Medical University, Shanghai 200433)
Abstract Objective: Endostatin is an effective endogenous inhibitor of angiogensis. To lay foundation of studying the further function of endostatin, the endostatin cDNA from Chinese fetus hepatocytes was isolated, cloned and sequenced. Methods: The total mRNA was isolated from Chinese fetus hepatocytes. The endostatin cDNA was synthesized and amplified from the mRNA by RT-PCR and the PCR product was cloned into pGEM-T vector and subjected to DNA sequencing. Results: The endostatin cDNA was successfully cloned and sequenced. Conclusion: The coding sequence of Chinese Endostatin cDNA is the same as reported sequence derived from foreigner.
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Key words Endostatin; clone; sequence
早在1863年，Virchow已注意到恶性肿瘤组织中血管绝对数急剧增多的现象，1945年Algire又提出肿瘤血管形成(neovascularization)的概念。Folkman等研究发现[1]实体肿瘤形成后，即进入无血管的浸润前期，此时肿瘤细胞主要靠弥散供给营养，这样的肿瘤结节直径一般小于2～3 mm，细胞数在107以内，肿瘤超过这样的体积还缺乏新生的毛细血管和小血管，肿瘤组织将发生退化，一旦新生的毛细血管长进肿瘤组织，肿瘤即加速生长，且易发生浸润和转移。因此，抑制血管生成可能是限制肿瘤生长和防止转移的有效策略。
内抑素[2](Endostatin)是一种有效的血管生成抑制因子，是1997年O'Reilly等继Angiostatin[3]之后从小鼠血管瘤细胞培养物中分离到的另一种血管抑制因子，是胶原ⅩⅧ 20 kD未端蛋白降解产物，该物质被证明有血管生长抑制作用，并能有效抑制多种小鼠肿瘤生长及转移。为进一步研究Endostatin的序列、特点及功能，我们从中国人胎肝组织中提取RNA，用RT-PCR方法将Endostatin扩增出，克隆到PGEM-T载体中，测定克隆片段的DNA序列。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 中国人胎肝组织
从长海医院妇产科引产胎儿肝脏组织中获取。
1.1.2 克隆载体及菌种
PGEM-T克隆载体来自PROMEGA公司，大肠肝菌DH5α为本室保存菌种。
1.1.3 引物合成
引物PrEn-U：5′-CTA CTT GGA GGC AGT-3′，引物PrEn-D：5′-CAC AGC CAC CGC GAC-3′及OligdT均由大连宝生物生物工程有限公司合成。
1.1.4 工具酶
, 百拇医药
Taq酶、限制酶、连接酶为GiBcol BRL产品；AMV反转录酶为Promega公司产品。
1.2 方法
1.2.1 胎肝组织总RNA的抽提
将Ig胎肝组织匀浆，加0.5 ml PBS(生理缓冲液)， 制成细胞悬液，取100 μl悬液，加500 μl Trizol混匀，用0.3 ml氯仿抽提，取上清液，加0.4 ml氯仿抽提，取上清300 μl，加30 μl 2 mol NaAc，加2.5倍体积无水乙醇，-70℃放置20 r/min，4℃ 15 000 r/min 离心15 min，70%冰乙醇洗2次 沉淀，抽干，溶于100 μl DEPC处理的水中，放置-70℃保存备用。
1.2.2 Endo的RT-PCR扩增
分别以OligodT和PrEn-D为引物进行反转录，取5×Buffer 4.0 μl, dNTP(2.5 mmol/L)2.0 μl, 引物OligodT或PrEn-D各1.0 μl, AMV反转录酶(10 U/μl)1.0 μl, RNA 5.0 μl ，ddH2O 8 μl，反应体积20 μl，70℃ 5 min，37℃ 1 h进行反转录反应。
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取10×PCR Buffer(不含Mg2+)3.0 μl, 引物PrEn-U, PrEn-D各1.0 μl, Taq酶1.0 μl, ddH2O 24 μl ,混合加入上述反转录PCR液，反应体积共50 μl，94℃ 3 min，然后，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共35次循环，72℃ 7 min，至4℃。
1.2.3 Endo的克隆及酶切鉴定
取经低溶点胶纯化的Endo PCR扩增产物5 μl(50 ng)及pGEM-T载体1 μl(50 ng)于10 μl体积14℃过夜进行连接反应。转化大肠杆菌DH5α，从培养板上挑10个克隆抽提质粒。
用HindⅢ和 BamHⅠ酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆。
1.2. 4 Endo的序列测定
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挑选阳性克隆抽提质粒并用GFP自动测序仪进行正/反向测序。所测序列用DNAsis软件进行分析比较。
2 结 果
2.1 Endo的RT-PCR扩增
提取的中国人胎肝RNA分别用Endostatin特异引物PrEn-D和OligodT进行反转录，合成反应在37℃进行。再用引物PrEn-U和PrEn-D进行PCR扩增，结果如图1所示在分子量在550 bp处，OligodT合成的cDNA有较为特异的扩增，而PrEn-D扩增效果不理想。
2.2 pGEM-Endo的克隆和酶切鉴定
将由以OligodT合成的cDNA为模板的PCR扩增的Endo产物克隆到PGEM-T载体中，重组质粒酶谱分析结果表明该DNA片段被正确克隆(见图2)。
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图1 中国人Endostatin cDNA 的RT-PCR扩增
Fig.1 The RT-PCR amplification of Chinese Endostatin cDNA
Lane 1: Negative control;
Lane 2: cDNA reverse transcripted with primer PrEn-D;
Lane 3:PCR products of cDNA reverse transcripted with primer Oligo-dT;
Lane 4: Positive control; Lane 5: PCR marker
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图2 pGEM-T-Endostatin 的酶切鉴定
Fig.2 Digestion of pGEM-T-Endostatin with EcoRⅠ and BamHⅠ
Lane 1: λ DNA/HindⅢ marker;
Lane 2～6: pGEM-T-Endostatin from various clones digested
with EcoRⅠ and BamHⅠ; Lane 7: PCR products of endostatin;
Lane 8: λ DNA/HindⅢ+ EcoRⅠ marker
2.3 序列测定
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挑取3个不同的DNA克隆进行DNA序列测定，其中1个质粒为反向克隆。测序结果经DNAsis软件分析比较(见图3)，3个克隆的序列完全相同，为Endostatin编码序列。将该序列与国外发表序列比较，二者序列完全一致。
3 讨 论
一般的观点认为使用靶基因的特异序列为引物合成CDNA进行靶基因的cDNA扩增会取得比用OligodT合成cDNA进行扩增更好的效果[4]，而我们Endostatin的扩增实验结果是正好相反(见结果1)。可能的原因是当靶基因RNA含量很少并在总RNA中的比例较少时，序列特异的引物比OligodT会更有利靶基因的cDNA合成。然而，人肝组织Endostatin mRNA的含量很丰富[5]，用OligodT就足以保证一定量的靶基因cDNA被合成出来。在进行靶基因PCR的扩增中，由于，用序列特异引物PrEn-D合成的cDNA模板，限制反应特异扩增的只有一个引物PrEn-U，而OligodT合成的cDNA，同时有一对引物PrEn-U，PrEn-D限制PCR反应的特异扩增。因而该方法取得更好的实验结果。
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图3 中国人Endostatin的核苷酸序列及推导的氨基酸序列
Fig.3 The determined DOA sequence and deduced amino acid sequence of Chinese Endostatin
人类基因组中，有一些基因很保守，而另一些基因则存在着基因多态性现象[6]。我们进行中国人Endostatin基因克隆的根本目的是要了解中国人的Endostatin基因序列是否与已报道的国外序列一致，是否有多态性现象，为将来对Endostatin进行结构功能研究及其开发利用打下基础。我们的实验结果证实从一例中国人胎肝组织克隆的Endostatin序列已与国外报道序列完全一致，而且国内外所报道的序列来也完全一致，初步说明了Endostatin的序列较为保守。然而，目前所测序还较少，还不能完全肯定该基因不存在多态性，我们正在进行更多不同个体的Endostatin基因克隆，以期进一步证实该结论
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国家自然科学基金资助
贺祥,男,34岁,助理研究员,主要从事肿瘤分子药理学研究
参 考 文 献
1，Folkman J. Tumor angiogenesis: Therapeutic implication. N Engl J Med， 1971, 225: 1182
2，O'Reilly MS, Boehm T, Shing Y， et al. Endostatin: An endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell， 1997, 88: 277
3，O'Reilly MS, Holmgren L, Shing Y， et al. Angiostatin: A novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma. Cell, 1994, 79: 315
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4，萨姆布鲁克 J， 弗里奇 EF， 曼尼阿蒂斯 T. 分子克隆实验指南. 金冬雁， 黎孟枫 等译. 第2版， 北京： 科学出版社， 1993. 672
5，Sasaki T, Fukai N, Mann K, et al. Structure, function and tissue forms of the c-terminal globular domain of collagen ⅩⅧ containing the angiogenesis inhibitor endostatin. EMBO J, 1998, 17(15): 4249
6，Prins J, Leus FR, Bouma BN, et al. The identification of polymorphisms in the coding region of the apolipoprotein (a) gene-association with earlier identified polymorphic sites and influence on the lipoprotein (a) concentration. Thromb Haemost， 1999, 82(6):1709
(1999-07-20收稿； 1999-10-05修回), 百拇医药