HSV-tk/GCV协同放射治疗黑色素瘤的实验研究

http://www.100md.com 《中国肿瘤生物治疗杂志》 2000年第2期

     作者：叶传忠 裴雪涛 李澎灏 郑宇辉 李梁 陈仕平

    单位：叶传忠 裴雪涛 李澎灏 郑宇辉 李梁 陈仕平(福建医科大学附属协和医院泌尿外科 福州350001)

    关键词：黑色素瘤；潮霉素磷酸转移酶和HSV-tk的融合基因；γ射线

    中国肿瘤生物治疗杂志000210

    摘 要 目的: 了解HSV-tk/GCV系统协同放射治疗对小鼠黑色素瘤的联合杀伤作用。方法： 通过逆转录病毒介导，将潮霉素磷酸转移酶和HSV-tk的融合基因(hytk)导入黑色素瘤细胞中并获得表达，通过体外和C57BL/6小鼠动物实验，检测GCV对转基因细胞的体内外杀伤作用及联合应用放射治疗对黑色素瘤的治疗作用。结果： PCR、RNA Dot blotting、免疫组化检测证实HyTK在转基因细胞的表达，体内外实验示GCV对B16/HyTK细胞有明显的杀伤作用，而对野生型B16细胞无明显杀伤作用(P<0.05)；联合应用低剂量GCV可使转入hytk基因的黑色素瘤细胞对放疗的敏感性明显增高(SER=1.62)，体内实验也证实协同疗法可延缓荷瘤小鼠的肿瘤生长。结论： HSV-tk/GCV系统协同放射治疗有望成为黑色素瘤基因治疗的一种有效方法。

    《中国图书资料分类法》分类号 R730.54； R739.5

    The Synergism of HSV-tk/GCV System and Radiotherapy in Murine Melanoma

    Ye Chuanzhong Pei Xuetao Li Penghao Zheng Yuhui Li Liang Chen Shiping

    (Department of Urology， the Union Hospital，Fujian Medical University， FuZhou 350001)

    Abstract Objective: To evaluate the therapeutic efficacy of retroviral-mediated HSV-tk/GCV system combined with radiotherapy on murine melanoma. Methods: By using retroviral-mediated gene transfer technique， hygromycin phospotransferase-thymidine kinase fusion gene(hytk) was transferred into B16 murine melanoma cells. Antitumor effects were observed after γ-rays irradiation with ⁶⁰Co rays as well as GCV treatment. Growth inhibition of melanoma models in C57BL/6 mice by HSV-tk/GCV systems in combination with radiotherapy was observed. Results: B16 cells transduced with hytk gene and treated with low concentrations of GCV， which showed little cytotoxicity alone， were highly sensitive to radiation. The sensitizer enhancement ratio(SER) was 1.62. This radiopsensitization was also obtained in vivo. Conclusion： The addition of retroviral-mediated HSV-tk/GCV gene therapy to standard radiation therapy an improve the therapeutic effectiveness for melanoma.

    Key words melanoma； phosphotransferase-thymidine kinase fusion gene； γ-rays

    通过逆转录病毒介导，将潮霉素磷酸转移酶和单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因(HSV-tk)的融合基因(hytk)导入黑色素瘤细胞株B16中并获得表达，联合应用放射治疗，通过体外和小鼠动物实验，探讨其协同作用。

    1 材料与方法

    1.1 动物、质粒与细胞株

    C57BL/6小鼠，6～8周龄，雌性，重量18～22 g，购自军事医学科学院动物中心。转染hytk cDNA的逆转录病毒包装细胞PA317/HyTK由笔者保存^[1]。鼠黑色素瘤细胞株B16由军事医学科学院基础医学所提供。

    1.2 γ射线照射源

    军事医学科学院放射医学所⁶⁰Co源，吸收剂量率168.5c Gy/min。

    1.3 主要试剂

    兔抗鼠HSV-tk多抗LotB由美国耶鲁大学Summers.W教授惠赠；DNA提取试剂盒DNAzol、RNA提取试剂盒Trizol为GIBCO产品；PCR产物回收试剂盒(Advantage^R PCR-Pure Kit)为Clontech产品； GCV为Warner-Lambert产品;PCR引物参见文献[1]; HMB45、S100单克隆抗体、SP组化试剂盒及DAB显色剂购自福州迈新公司。

    1.4 离体实验

    1.4.1 逆转录病毒转染B16细胞

    按文献[1]方法进行。

    1.4.2 hytk基因整合及表达的鉴定

    1.4.2.1 PCR分析hytk基因的整合：按DNAzol说明书提取细胞基因组DNA，取1 μl DNA用于PCR扩增，50 μl体系, 94℃预变性1 min，加Taq酶2 U，94℃变性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸60 s，30个循环后72℃延伸7 min，2%琼脂糖凝胶电泳。

    1.4.2.2 RNA Dot blotting检测hytk的mRNA表达：按Advantage^RPCR-Pure Kit说明书回收530 bp的hytk基因PCR产物，缺口平移法[α-³²P]dATP标记PCR产物作探针。按Trizol说明书提取细胞总RNA，按文献[2]进行RNA Dot blotting。

    1.4.2.3 免疫组织化学检测HSV-tk蛋白表达：按文献[1]进行。

    1.4.3 MTT法检测B16/HyTK细胞对GCV的体外敏感性

    参照文献[1]进行。

    1.4.4 ⁶⁰Co和GCV对转hytk基因细胞的协同效应

    将对数生长期的B16细胞和B16/HyTK细胞制备成单细胞悬液，分为B16，B16/HyTK，B16/HyTK+GCV 3组，低剂量GCV选用0.02 μg/ml，根据MTT法检测出的GCV起效时间设定加药时间。分别照射0，2，4，6，8，10 Gy后不同浓度接种60 mm培养皿，2周后甲醛固定，Giemsa染色，光镜下计数大于50个细胞以上的克隆。按文献[4]方法分别计算接种效率及存活分数。

    微机按多靶单击模型(multi target single hit survival model)拟合数据^[3]，绘出细胞存活曲线。计算射线增敏率(sensitizer enhancement ratio，SER)为两组细胞间D₀值的比。

    1.5 体内实验

    1.5.1 荷瘤小鼠模型的建立及鉴定

    取生长良好的B16/HyTK细胞，以5×10⁷ /ml悬浮于PBS中,小鼠右腋下皮下接种0.2 ml即1×10⁷细胞，复制黑色素瘤模型，1周后取瘤块石腊包埋，5 μm厚连续切片，分别行HE染色和采用SP免疫组化法检测HMB45，S100和HSV-tk蛋白表达。

    1.5.2 HSV-tk/GCV在体治疗的疗效观察

    取10只C57BL/6小鼠，复制转hytk基因黑色素瘤模型，接种1周后随机等分。一组给予GCV腹腔注射，剂量为60 mg^.kg^-1.d^-1，分2次给药，连续7 d；另一组同法注射PBS；均于第9天处死小鼠后取瘤块，游标卡尺测瘤体长短径(A，B)并计算肿瘤体积，体积(mm³)=0.5236×AB²/2^[4]；制备石蜡切片，HE染色后封片镜检。

    1.5.3 单纯γ射线照射下B16/HyTK细胞在小鼠体内的生长情况

    C57BL/6小鼠后足背皮下接种10⁸/ml B16/HyTK细胞0.05 ml，2周后成瘤，将小鼠随机分为B16/HyTK, B16/HyTK+5 Gy, B16/HyTK+10 Gy, B16/HyTK+20 Gy等 4组，每组8只，照射荷瘤肢。隔日测瘤体长短径，绘出其生长曲线。

    1.5.4 ⁶⁰Co和GCV对转HytK基因细胞的体内协同作用

    根据单纯γ射线照射下B16/HyTK细胞在C57BL/6小鼠体内的生长情况，选择一适当的照射剂量，同时给予腹腔注射GCV；单纯GCV腹腔注射组作为对照。 低剂量GCV的用法参考文献[5]，观察肿瘤生长情况。

    1.6 计算及统计

    细胞剂量存活曲线计算机处理程序(version2.1)由军事医学科学院提供，有关统计过程均在SPSS9.0统计软件中进行，以P<0.05为显著性水平。

    2 结 果

    2.1 hytk 基因的转染

    用PA317/HyTK病毒上清转染的C16细胞，经潮霉素(400 μg/ml)加压筛选3周，获得抗性克隆，命名为B16/HyTK，培养传代。

    2.2 PCR分析hytk基因的整合

    PCR特异性扩增出530 bp的hytk 基因片段。证实有hytk基因的插入。

    2.3 Dot blotting检测目的基因的表达

    Dot blotting结果证实B16/HyTK细胞中有hytk 的 mRNA表达。

    2.4 免疫组织化学检测HSV-tk蛋白表达

    B16/HyTK细胞的胞浆可见棕褐色的阳性染色，而野生型B16细胞未见阳性染色。

    2.5 GCV对B16/HyTK细胞的体外杀伤作用

    GCV对B16/HyTK细胞有明显的杀伤作用。其IC₅₀值为1.874 μg/ml，而对野生型B16细胞无明显毒性(P<0.05)。其作用起效时间为48 h，120 h可杀伤绝大部分转基因细胞。

    2.6 ⁶⁰Co和GCV对转hytk基因细胞的协同效应

    ①不同剂量照射后B16/HyTK细胞与野生型B16细胞的存活曲线无明显差异(P>0.05)；②B16/HyTK组的D₀值为3.095，B16/HyTK+GCV组的D₀值1.911，SER为1.62。

    2.7 荷瘤小鼠模型的建立及鉴定

    免疫组化染色可见HMB45及S100蛋白表达，说明肿瘤恶性黑色素瘤来源性未变；HSV-tk蛋白表达阳性说明肿瘤接种小鼠后其转入的治疗基因表达良好。

    2.8 HSV-tk/GCV在体治疗疗效观察

    肿瘤细胞接种小鼠后约5～7 d见瘤块形成，大小为258.3±127.2 mm³。将其随机等分2组，Mann-Whitney 检验显示2组间无显著差异。分别予GCV或PBS治疗，发现对照组所荷瘤块生长迅速(2561.2±1143.5 mm³)，而GCV治疗组瘤块生长受到明显抑制(412.4±278.3 mm³)；组织学检查GCV组肿瘤可见散在面积不等的坏死灶，对照组仅中央部位有少量坏死。

    2.9 ⁶⁰Co，GCV对B16/HyTK细胞的体内协同作用

    单纯γ射线照射下B16/HyTK荷瘤小鼠的肿瘤生长情况如图1，各组均与未照射组存在显著差异，5 Gy及10 Gy照射组小鼠肿瘤生长情况无显著差异(P>0.05)，20 Gy组小鼠肿瘤生长较5 Gy及10 Gy照射有显著差异(P<0.05)，但小鼠于照射后12～16 d相继死亡；给予腹腔注射GCV(5 mg/kg×4 d)后，肿瘤生长较阴性对照无显著延缓(P>0.05)。所以选择5 Gy为联合治疗组的照射剂量， 5 mg/kg×4 d为腹腔注射GCV剂量，于⁶⁰Co源照射前48 h起给药，经⁶⁰Co和GCV联合治疗，发现其对黑色素瘤的体内生长产生明显抑制。

    图1 γ射线照射联合GCV对B16/HyTk荷瘤小鼠的

    肿瘤生长情况的影响

    Fig.1 in vivo radiosensitization of mice with tumors composed

    of B16/HyTK cells

    3 讨 论

    单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因(HSV-tk)/GCV系统是目前众多肿瘤基因治疗方案中技术上较为成熟的一种，但临床疗效并不十分理想，主要原因有①随着肿瘤的增长，其对GCV的敏感性降低；②有效剂量的GCV(10 mg^.kg^-1.d^-1)对机体可能产生毒副效应，主要并发症有肾功能受损(40%～60%)、骨髓抑制(20%～41%)等^[5]。1992年Weichselbaum等首先提出了联合应用基因治疗和放射治疗的设想，将同时具有肿瘤杀伤和辐射增敏作用的基因转入体内，在对肿瘤实施局部放疗时，造成辐射和基因对肿瘤的协同杀伤作用^[6]。新近研究表明，HSV-tk基因具有辐射增敏作用，当GCV进入HSV-tk基因转染的细胞内，可三磷酸化成GCV-TP(GCV-triphosphate)，后者不仅能抑制癌细胞辐射后的潜在致死性修复，还可作为三磷酸脱氧胸苷(dTTP)的竞争抑制物掺入DNA中以增加辐射的敏感性，从而可降低辐射剂量^[7]。

    我们利用逆转录病毒介导将hytk基因导入B16细胞，并在mRNA及蛋白水平上获得表达。当用其特异性底物GCV处理时，可发现有明显的杀伤作用，而对照的野生型B16细胞仅少量被杀死；而且本实验所建立的肿瘤模型免疫组化染色可见HMB45及S100蛋白，说明了肿瘤恶性黑色素瘤来源性未变；HSV-tk蛋白表达阳性说明肿瘤接种小鼠后其转入的治疗基因仍然表达良好，在体实验也证实了hytk基因/GCV治疗的有效性。当联合应用⁶⁰Co和低于有效剂量的GCV时，转hytk 基因细胞对γ射线的敏感性有了较为明显的提高(SER为1.62)；在C57BL/6小鼠体内水平也获得了相应的结果。这提示在将来的临床研究中有望利用放疗协同HSV-tk/GCV系统来达到治疗目的。

    福建省科委基金(99-Z-167)

    叶传忠,男,32岁,主治医师,现在上海医科大学附属中山医院泌尿外科攻读博士

    参 考 文 献

    1，叶传忠， 陈仕平， 裴雪涛， 等. 逆转录病毒介导HyTK基因治疗膀胱癌的实验研究. 中华外科杂志， 1999， 37： 453

    2，F.奥斯伯著. 精编分子生物学实验指南. 颜子颖， 王海林译. 北京： 科学出版社， 1998， 63： 141

    3，夏寿萱 主编. 放射生物学. 北京： 军事医学科学出版社， 1998. 58

    4，Sutton MA， Berkman SA， Chen SH， et al. Adenovirus-mediated suicide gene therapy for experimental bladder cancer. Urology， 1997， 49: 173

    5，Tong XW， Engehausen DG， Kaufman RH， et al. Improvement of gene therapy for ovarian cancer by using acyclovir instead of ganciclovir in adenovirus mediated thymidine kinase gene therapy. Anticancer Res, 1998， 18(2A): 713

    6，吕 星， 吴祖泽， 孙志贤， 等. 肿瘤的基因-放射治疗设想与实验研究. 生命科学， 1998， 10： 106

    7，Nishihara E， Nagayama Y， Mawatari F， et al. Retrovirus-mediated herpes simplex virus thymidine kinase gene transduction renders human thyroid carcinomacell lines sensitive to ganciclovir and radiation in vitro and in vivo. Endocrinology， 1997， 138: 4577

    (1999-01-26收稿； 1999-08-01修回)

    百拇医药网 http://www.100md.com/html/analecta/2003/08/31/77/765.htm